Name: In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Leer optogenetische stimulatie in vivo bij knaagdieren voor gedragsneurowetenschap. Deze methode maakt real-time controle van neuronale circuits mogelijk tijdens gedragstaken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studies werden gefinancierd door subsidies van het NIH (MH082876, DA023988).

! LET OP: Dit protocol omvat het gebruik van de klasse 3B lasers en zal juiste richtlijnen opleiding en veiligheid moeten worden gevolgd. Veiligheidsbril moet gedragen worden ten alle tijden bij het bedienen van lasers, met de aanpassing procedures presentatie van een bijzonder hoog risico. Neem contact op met de laser provider om de brillen die maximale demping zal zorgen voor een gegeven laser bepalen. Indien beschikbaar, inschrijven in een institutionele laserveiligheid-opleiding. Exploiteren van een laser nooit zonder de juiste oogbescherming en opleiding. 1. Laser Apparatuur Set-up In voorkomend geval, zijn stappen in hoofdstuk 1 aangeduid als (A) of (B) om onderscheid te maken tussen enkele of dubbele lasersystemen, respectievelijk. <ol><li> Hechten en veilig lasers om het breadboard. Breadboards zijn uitstekende warmtegeleider en fungeren als een koellichaam om schade aan de interne laser onderdelen bij langdurig gebruik te voorkomen. </li><li> (A) Bevestig de pre-gekoppelde laser om een 10 &quot;x 12&quot; broodplank (of indien nodig) met behulp van ¼-20 &quot;cap schroeven en ringen (Figuur 2A). Als broodplank gaten niet uitgelijnd met laser montagegaten, gebruik maken van kleine &#39;tafelklemmen&#39; laser vast te breadboard. </li><li> (B) Als het 2 lasers te gebruiken zeer verschillende beam hoogtes (&gt; ~ 1 cm), gebruik maken van kleine 4 &quot;x 6&quot; breadboards een platform voor één van de lasers. Bevestig deze borden naar de belangrijkste grote 12 &quot;x 18&quot; breadboard met behulp van ¼-20 &quot;cap schroeven met ringen, bevestig vervolgens de laser om de kleinere planken met behulp van schroeven of tafelklemmen zoals weergegeven in figuur 2B. Maak de andere laser direct op de broodplank met behulp van schroeven of een variabele hoogte tafelklem. Kritische stap: Breadboards, schroeven, en optische componenten kunnen worden gekocht als keizerlijke of metrische consistente dus bij de aankoop van artikelen; de standaardinstelling voor dit protocol is keizerlijke. </li><li> (A)Bevestig een dikke mantel platte splitsen / fysiek contact (FC / PC) patch snoer met de koppelaar (aangeduid als een snoer van zie figuur 3) die fysiek is bevestigd aan de voorzijde van de laser (figuur 2A). </li><li> (B) Haal het koppelstuk op een ¾ &quot;optisch post, dan epoxy de verbinding tussen de koppeling en de bovenkant van de paal met JB Kwik, epoxy of dergelijke te voorkomen losmaken en uitlijning gedurende gebruik. Bevestig de post naar de broodplank (zoals de broodplank gaten zal niet altijd op een lijn met de vereiste plaatsing van optische componenten, een ambtsdrager, voetstuk base-adapter, en klemmen vork worden gebruikt om de koppeling van de optische achteraf vast te zetten). Bevestig een dikke mantel patchkabel (koppeling snoer) aan de achterkant van de koppeling. </li><li> (B) Plaats de eerste stuur- spiegel voor de blauwe laser in de kinematische houder en bevestig deze aan de broodplank met een ¾ &quot;optische bericht. Bevestig dit bericht aan een basis ADAPter en klemmen vork. Plaats de klemmen vork en post montage direct voor de blauwe laser met spiegel onder een hoek van 45 ° met de laser naar de dichroïsche spiegel sturen. Gebruik het rooster patroon van gaten op de broodplank als een ruwe uitlijngeleider. Eenmaal grofweg gepositioneerd, gebruik dan een ¼ &quot;-20 dop schroef aan de klem vork vast te zetten aan de broodplank (zie figuren 2B, C). </li><li> (B) Steek de dichroïsche spiegel in een kinematische houder en bevestig deze aan een 1 &quot;optische post en veilig direct naar het breadboard. Plaats de dichroïsche spiegel aan de uiterst links van, en in overeenstemming met de blauwe laser spiegel. Hoek van de dichroïsche spiegel in een hoek van 45 °, zodanig dat blauw licht gereflecteerd door de eerste spiegel wordt weerspiegeld in de koppeling, draai de schroef bevestigen van de kinematische houder om de post (zie figuren 2B, C). </li><li> (B) Bevestig de eerste stuur- spiegel voor de gele laser om een ​​¾ &quot;optische bericht. Bevestig de optical post naar een basis-adapter en klemmen vork. Plaats de klemmen vork en post-ensemble direct voor de gele laser en de hoek van de spiegel bij 45 ° zodanig dat geel licht wordt gericht naar de tweede spiegel stuurinrichting. Bevestig de klemmen vork in plaats met een ¼ &quot;-20 dop schroef en ring. </li><li> (B) Bevestig de tweede stuurstand spiegel voor de gele laser om een ​​1 &quot;optische bericht. Hoek van de spiegel zodanig dat de gele lichtstraal van de eerste spiegel zal worden weerspiegeld door de dichroic en in de koppeling (figuur 2C). Bevestig het bericht direct naar de breadboard en draai de bevestigingsschroef zodra de spiegel onder een hoek op de juiste wijze. Fijne spiegel aanpassingen worden gemaakt met behulp van de kinematische spiegel mounts in een latere stap. </li><li> (B) Bevestig een grijsfilter wiel om een ​​¾ &quot;optische post en leg de post in een post houder bevestigd aan een montageplaat. Bevestig het ensemble aan de broodplank tussen de eerste en second gele spiegels met behulp van een enkele ¼ &quot;-20 dop schroef. Dit wiel wordt gebruikt om de kracht van geel laserlicht bereikt de koppeling passen. Tip: Individueel alle componenten (zoals de schroeven waarmee kinematische spiegel houders naar de top van de ambten, en de draden houden basis adapters aan de onderkant van berichten) draai voordat ze aan de basis. Gebruik een schacht van een kleine inbussleutel in de informatie die via-gaten in optische berichten om genoeg koppel te krijgen. Hiermee wordt voorkomen dat onderdelen los komen tijdens het gebruik, noodzakelijk herschikking. </li><li> Bevestig een FC / PC naar FC / PC L-bracket adapter op het breadboard. </li><li> Optioneel: Bevestig een 1 x 2 50/50 mini kubus vezel splitter direct naar breadboard voor gelijktijdig in vivo stimulatie van twee of meer dieren. Bovendien kunnen handvatten worden toegevoegd om te helpen bij de beweging van steekbord samenstel (zoals weergegeven in figuur 2A). </li></ol> 2. Laser Koppeling (Non-contact stijl Koppeling) Deze sectie heeft betrekking op de dual-laser set-up (Figuur 2B). Lijn de innerlijke blauwe laser pad vóór het uitlijnen van de buitenste gele laser pad. ! LET OP: Gebruik een laag licht macht koppeling (~ 1 mW) om de veiligheid oog te garanderen. Draag een veiligheidsbril aan de macht van de laser en tot lichtintensiteit wordt gemeten en die veilig worden geacht. <ol><li> Stel de schakelaars op de achterzijde van de laser &quot;Curr&quot; (stroom) en transistor-transistor logic mode (TTL) + voor constante verlichting (in tegenstelling tot analoge modus). Zorg ervoor dat de stroom knop op de voorkant van de bestuurder is ingesteld op nul. Zet de laser instelling door de bestuurder en daarna de laser toets. </li><li> Langzaam pas de stroom knop aan de voorzijde van het laseraanstuurmiddel zodat ~ 1 mW laserlicht wordt uitgezonden. Wacht 10-15 minuten (of zoals aangegeven door de fabrikant) voor laser op te warmen. </li><li> Sluit de glasvezelkabel tester direct naar de free einde van de koppeling patch stopcontact en zet de kabel tester (Figuur 3A). Pas de hoek van de koppeling zodat de rode straal reist direct terug naar het midden van de dichroïsche spiegel. De bundel pad van het rood licht uitgestraald door de kabel tester is het exacte pad dat de inkomende laserlicht zal moeten volgen om te worden gekoppeld in de laser. </li><li> Voer een grove uitlijning: Gebruik de laterale en horizontale knoppen aan de kinematische spiegels aan de laserstraal te sturen in de koppeling. Het voetstuk klemmen moet worden losgemaakt iets herpositioneren de spiegels en de koppeling. De kinematische mounts moet nog wat reizen beschikbaar voor verdere fijne aanpassingen. Wees niet bezorgd zijn als er geen blauw licht wordt uitgezonden uit de koppelaar bevestigd patchkabel op dit moment. </li><li> Plaats een stuk semitransparant papier direct voor de dichroïsche spiegel, tussen de dichroïsche en koppeling. Er zal zowel een blauwe en ared stip op dit papier uit de laser en de kabel tester, respectievelijk. Gebruik papier dat is doorschijnend genoeg om zowel de rode en blauwe plekken tegelijk zien vanaf dezelfde kant van het papier. </li><li> Nauwkeurig afstellen de eerste stuurinrichting spiegel (dwz de ene dichter bij de laser, niet de dichroïsche) door voorzichtig aanpassen van de laterale en horizontale knoppen om het midden van de rood punt met de blauwe stip lijnen. </li><li> Schuif het papier terug naar de koppeling zodat het direct voor de koppeling en de knoppen pas op de tweede (dwz dichroïsche) spiegel voor de laserbundel met de rode balk lijnen. </li><li> Itereren over de stappen 2.6 en 2.7 tot en met het middelpunt van de blauw / gele en rode balken precies zijn uitgelijnd in beide posities (dat wil zeggen, tot de rode en blauwe balken zijn colineair). </li><li> Verwijder de kabel tester uit de koppeling snoer. Laserlicht moet nu worden uitgezonden vanaf het einde van de koppeling patchkabel. </li><li> BEPALIne koppelingsefficiëntie door het meten van het licht wordt uitgezonden vanuit de vezel tip van de koppeling patchkabel met behulp van een power meter. Gebruik de 500 mW instelling op fotodiode de power meter en de golflengte instelling (λ) naar blauw (473 nm) of geel (635 nm) spectrum licht, afhankelijk van de laser wordt gebruikt veranderen. </li><li> Plaats de vezelpunt loodrecht op de fotodiode tot een macht te bekomen. Vergelijk het licht kracht invoeren van de koppeling aan het licht wordt uitgezonden vanaf het einde vezels. Een koppeling rendement van&gt; 80% wordt als zeer goed. Zeer kleine verdere aanpassingen van de tweede stuurstand spiegel kan soms licht verbeteren koppeling. In het algemeen, wanneer de lichtbundel vanaf het einde van de koppeling vezel is een kleine, strakke, centrale locatie (zonder er omheen), koppelingsefficiëntie in de vezelkern optimaal. </li><li> Herhaal de stappen 2,1-2,11 voor gele laser koppeling, met uitzondering van het gebruik van de twee spiegels voor de gele laser (zie figuur 2C). Doe geent pas de positie van de dichroïsche spiegel of uitlijning van de blauwe laser zullen verloren gaan. </li></ol> 3. In vivo optogenetische Stimulatie Zorg dat alle procedures met betrekking tot het gebruik van dieren worden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale en nationale richtlijnen en goedgekeurd door de overeenkomstige Institutional Animal Care en gebruik Comite. <ol><li> Optische vezel opstelling (zie figuur 3B voor identificatie van de verschillende patchkabels hierna). Om een enkele muis te stimuleren, sluit de koppeling patchkabel tot een dikke mantel patchkabel met behulp van de FC / FC L-bracket adapter rechtstreeks aangesloten op de broodplank (zie figuur 4A). Om twee dieren van de ene laser te stimuleren, sluit de koppeling patchkabel aan twee dikke mantel patchkabels met behulp van de 1 x 2 50/50 mini kubus (zie figuur 4B). Om drie of meer dieren te stimuleren, bevestig het snoer van een multimode fiber splitter met behulp van de 1 x 2 mini kubus reeds aan de broodplank (zie Figuur 4C). </li><li> Bevestig een collector / rotary joint aan de vrije uiteinden van de dikke mantel flardkoord / fiber splitter. Schakelaars zijn essentieel als ze rotatie van de vezel met beweging van knaagdieren, die accumulatie van torque voorkomt op de patch kabel mogelijk. Te veel koppel kan koorden draaien leiden tot breuk, en interfereren met de natuurlijke beweging van het dier tijdens het testen. </li><li> Bevestig het dier patchkabel aan de collector. </li><li> Bevestig een verbinding gespleten huls aan de vrije metalen ferrule uiteinde van het dier patch kabel (figuur 5). Forceer de mouw helemaal tot het beentje; laat ~ 0.5 cm huls blootgesteld is wat verbinding met de geïmplanteerde glasvezel aangebracht op het dier (figuur 6). Kritische stap: Altijd aankoop mouwen die een split bevatten om uitbreiding van huls over geïmplanteerde vezels beentje mogelijk te maken tijdens verbinding enverwijdering. Te strak van een fit kan ernstig trauma veroorzaken aan het dier als het implantaat loskomt van de schedel bij een poging om de hoes van het implantaat los te koppelen. Als dit toch gebeurt, moet het dier uit de studie worden verwijderd en onmiddellijk de dierenarts zorg. Ook voor het gebruik van een nieuwe hoes voor de eerste keer, &#39;breken in&#39; door het aansluiten en loskoppelen van een ferrule totdat hij verbreekt met de gewenste hoeveelheid kracht. Tip: Het is gemakkelijk om een vezel te breken tijdens het verwijderen van een huls die nauw verbonden is aan een ferrule. Om dit te voorkomen, duw het beentje door het invoegen van een kleine houten staaf in het open uiteinde van de bus (het handvat van een standaard wattenstaafje is de juiste maat). </li><li> Sluit de blauwe laser bestuurder om een ​​pulsgenerator met een BNC-kabel en zet de pulsgenerator op. </li><li> Passende veiligheidsbril op. Stel de schakelaars op de achterzijde van de laser &quot;Curr&quot; en &quot;TTL +&quot; -modus. Zorg ervoor dat that de kracht knop op de voorkant van de bestuurder is ingesteld op nul andturn de laser op (zet de bestuurder op de eerste en vervolgens de laser-toets). </li><li> Pas de macht knop op de voorzijde van de laser zodat 5-10 mW wordt uitgezonden door het dier flardkoord vezelpunt als gemeten met een lichtvermogen meter. 5-10 mW is een algemene richtlijn - precies vermogensintensiteit moeten beïnvloeden een gegeven volume weefsel moeten vóór de start van het experiment wordt berekend, zoals in Aravanis et al 3. </li><li> Schakel de blauwe laser op &quot;Analoog&quot; modus voor in vivo stimulatie. Opmerking: Geel DPSS lasers worden gebruikt in TTL + modus voor een constante verlichting. Wacht 10-15 minuten voor de laser op te warmen. </li><li> Zachtjes bedwingen van de muis en sluit de split-hoes op het dier patchkabel om de chronische implanteerbare vezel (zie figuur 6). Zorg ervoor dat de uiteinden van de beide vezels maken fysiek contact met elkaar. Gebruik de splitsing op de mouw aansluiting als eenvenster om direct contact tussen de twee visualiseren Kritische stap:. Soms vuil kan verzamelen over de metalen ferrule van implanteerbare vezels van het dier en interfereren met de juiste aansluiting. In dit geval gebruikt u een ethanol doekje om voorzichtig te reinigen het beentje op de kop van het dier voorafgaand aan de bevestiging. Probeer nooit een verbindingsmof via ferrule dit ernstig trauma veroorzaken aan het dier. Als een fysieke verbinding tussen vezeluiteinden niet gemaakt kan worden na het reinigen, verwijder het dier uit de studie. Tip: Lichte lekkage kan optreden op het verbindingspunt tussen de geïmplanteerde vezel en dier patchkabel. Visualisatie van dit licht door knaagdieren kan een experimentele verwarren 10 presenteren. Krimpkous kan worden bevestigd aan patchkabels en gleed over het aansluitpunt om vreemd licht te minimaliseren. </li><li> Laat de muis te herstellen gedurende enkele minuten vóór de aanvang van gedragstesten. Tip: Dfhankelijk de gedragstest te dienen, is het het beste om muizen voor de verbinding en tethering proces wennen 2 - 3 dagen, als de behandeling nodig is om het dier te verbinden stress kan induceren en verwarren gedragstesten. </li><li> Plaats de muis in de gedragswetenschappen testapparatuur ervoor te zorgen dat de stekker uit het stopcontact is vrij van haken en ogen. Laat nooit een dier zonder toezicht tijdens de stimulatie. Zelfs met het gebruik van commutatoren, hoeft patch koorden hebben de neiging te verdraaien gedurende langere tijdsperioden en kan interfereren met gedragstesten. </li><li> Gebruik een pulsgenerator de blauwe laser puls met een vooraf bepaalde frequentie die opsin keuze activeert. Voor geel laser gebruik: pulseren de gele laser met externe shutters of door simpelweg blokkeren van de bundel pad met een ondoorzichtige, niet-reflecterend, niet brandbaar object. </li></ol> 4. bericht In vivo stimulatie Overwegingen Dit gedeelte is niet bedoeld om een ​​complete proto zijncol, maar wordt aangeboden als leidraad voor de aanvullende procedures die moeten worden overwogen na in vivo optogenetische stimulatie. <ol><li> Na voltooiing van een experiment, bevestigen virale en fibre placement histologisch voor een nauwkeurige interpretatie van gedragsmatige resultaten. Euthanaseren dier volgens de institutionele richtlijnen en perfuseren het dier met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 4% (w / v) paraformaldehyde in PBS. </li><li> Verwijder geïmplanteerde glasvezel door stevig vast te grijpen de blootgestelde metalen ferrule met een tang of hemostats. Trek in een vloeiende, maar toch snel, beweging. Het is belangrijk dat de integriteit van de geïmplanteerde vezel getest door meting van de lichtopbrengst aan het einde van elk experiment. </li><li> Post-fix de hersenen in paraformaldehyde gedurende ten minste 24 - 48 uur vóór het snijden door het gebied van belang. (Bij gebruik van een bevriezing microtoom, incubeer hersenen in een 30% sucrose oplossing voor enkele dagen voor het snijden). Uit te voeren met behulp van immunohistochemie standard protocollen voor de detectie van de geschikte-opsin tagged fluoroforen, dat wil zeggen, groen fluorescent eiwit (GFP), verbeterde gele fluorescerende eiwit (eYFP) of mCherry. </li><li> Controleer plaats van opsin meningsuiting en vezels implantaat onder een microscoop en visueel bevestigen juiste plaatsing van het virus injectie en implantaat op basis van gekozen coördinaten. </li></ol>

<ol><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147, 1446-1457 (2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+neural+interface%3A+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).</li>
<li>Sidor, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychiatry%27s+age+of+enlightenment%3A+optogenetics+and+the+discovery+of+novel+targets+for+the+treatment+of+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychiatry+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders.</a> J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li>
<li>Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+dissection+of+neural+circuits+underlying+emotional+valence+and+motivated+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors.</a> Brain Res. 1511, 73-92 (2013).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li>
<li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477, 171-178 (2011).</li>
<li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+identification+of+striatal+projection+neuron+subtypes+during+in+vivo+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings.</a> Brain Res. 1511, 21-32 (2013).</li>
<li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nat Methods. 9, 159-172 (2012).</li>
<li>Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+principles+underlying+optical+stimulation+of+a+channelrhodopsin-2+positive+pyramidal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron.</a> J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).</li>
<li>Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li>
<li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).</li>
<li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463, 98-102 (2010).</li>
<li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-stable+neural+state+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bi-stable neural state switches.</a> Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).</li>
<li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> J Vis Exp. , e50004(2012).</li>
<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).</li>
<li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li>
<li>Goshen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+retrieval+strategies+for+remote+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of retrieval strategies for remote memories.</a> Cell. 147, 678-689 (2011).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer%3A+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

De huidige beschreven laser set-ups en tethering strategieën zijn compatibel met een breed scala van knaagdieren gedragstesten. Inderdaad, hebben een verscheidenheid van gedragstesten gebruikt na, of begeleiden, in vivo optogenetische stimulatie die emotieve gedragstherapie taken, gedragsconditionering, leren en geheugen paradigma&#39;s, slapen, opwinding, en appetitief taken omvatten een paar te noemen (zie Nieh et al. 6 voor een uitgebreide review). Optogenetics heeft de manier veranderd waarop traditionele gedrags-tests worden uitgevoerd in die meerdaagse studies kunnen nu worden gecondenseerd in een enkele sessie waarin gedrag wordt vergeleken, binnen-proefpersonen, tijdens verschillende tijdperken van het licht &#39;aan&#39; versus &#39;uit&#39; 5. Van de nota, gedrags- apparaten die deuropeningen bevatten, afgesloten compartimenten of andere obstakels kunnen aangepast moeten worden om de doorgang van tethered vezels tegemoet te komen. De beschreven tethering strategieën vergunning simultaneous stimulatie van meerdere muizen uit een laser. High throughput optogenetic gedragstesten kunnen derhalve worden bereikt door het gebruik van meerdere lasers en testapparatuur. Het aantal dieren die gelijktijdig kunnen worden gestimuleerd, zal echter door de maximale lichtsterkte dat in elke vezelpunt kan worden bereikt. Maximaal vermogen aan de vezel tip is afhankelijk van de 1) startvermogen van de laser; 2) koppelingsefficiëntie en 3) het aantal bundel splitst. Voor 100 mW laser met ~ 80% koppelingsefficiëntie en maximaal 4 bundel splitst (zoals weergegeven in figuur 4C), gemiddelde vermogen in de vezel uiteinde kan variëren tussen 5-10 mW bij gebruik van 200 urn kern, 0,22 NA fiber patch cords (nb verwachten transmissie verlies van roterende gewrichten te zijn &lt;15%). Meten lichtopbrengst op de vezel tip is van essentieel belang voor het bepalen van een geschikt licht macht voor opsin activering als opsins verschillen in hun gevoeligheid voor licht en dus het licht vermogensdichtheid (mW/ Mm2) voor activering vereiste 11. Bijvoorbeeld, de stabiele stap-functie opsin (SSFO) als een foton accumulator en vereist daarom weinig licht vermogensdichtheid voor activering (&lt;8 uW / mm 2) 8. Vergelijk dit met de traditionele kanaal rhodopsin (ChR2) dat een minimum van 1 mW / mm 2 van licht om actiepotentialen ontlokken vereist 2. Tabel 1 wordt geleverd als een snelle referentie voor bekende minimale licht bestralingen die nodig is om de meest voorkomende opsins momenteel in activeren gebruiken. Ten slotte moet men overwegen dat licht verstrooit en absorbeert als het reizen door hersenweefsel zodanig dat meer licht vermogen nodig is voor diepere hersenstructuren 3. Een handig online hulpmiddel is altijd beschikbaar <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> dat de lichtsterkte op verschillende diepten door hersenweefsel zal berekenen door rekening terekening de vezel kern grootte, numerieke opening, golflengte van het licht gebruikt, en het begint licht vermogen bij de vezel tip. Voor een uitstekend overzicht van de theoretische uitgangspunten van deze berekeningen, zie Foutz et al. (2012) 12. Voorbeelden van hoe deze uitgangspunten en berekeningen te experimenteel design toepassing worden gedemonstreerd in Aravanis et al. (2007) 3 en Tye et al. (2012) 13. Voorafgaand uitvoeren van deze berekeningen het begin van een experiment cruciaal voldoende licht bestralingssterkte voor opsin activatie waarborgen. Gezien deze overwegingen is het voordelig om hogere aangedreven lasers kopen om voldoende vermogen te garanderen. Lasers met een vermogen tussen 100-200 mW zijn over het algemeen voldoende om te compenseren voor kleine kern vezels, meerdere vezels splitsen, koppeling inefficiëntie en transmissie verliest 7. Bij gebruik van een hoog vermogen lasers, echter, zorg moeten worden genomen om neurale schade of warmte en licht-associate voorkomend artefacten die kan optreden bij langdurige en / of hoge aangedreven licht verlichting 7. Een veilige bereik voor in vivo experimenten tot 75 mW / mm2. 14 Beslissen over de aard van de laser om de aankoop kan een ingewikkelde zaak, omdat er veel factoren te overwegen zijn. Bijvoorbeeld, directe diode lasers zorgen voor meer stabiele en herhaalbare gepulseerd vermogen dan doen diode-gepompte solid-state (DPSS) lasers, en zijn betrouwbaarder dan de tijd in een testomgeving. In sommige gevallen echter direct diodelasers een lagere lichtopbrengst, ~ 0,1 mW afgeven, zelfs wanneer de stuurspanning 0 V door een constante instelstroom aan de diode wordt verzonden door regelelektronica van de laser. Deze &#39;spontane&#39; emissie heeft een breder spectrum dan doet laser emissie van dezelfde laser, dus kan specifiek door het installeren van een smalle band-pas (of &#39;opschonen&#39;) filter tussen de laser en de koppeling (zie onderdelen lijst) worden verlaagd. Dit filter zal ookverminderen vermogen door ~ 50% bij het laseren, dus de aanschaf van een hogere aangedreven laser dienovereenkomstig. Opgemerkt zij dat geel DPSS lasers zijn zeer gevoelig en kunnen niet goed bijgewerkt en verminderde levensduur als snel gemoduleerd door een pulsgenerator. Aanpassing van de gele laservermogen moet worden gedaan door middel van externe dichtheid filter wielen geplaatst in de bundel pad (paragraaf 1.7), terwijl de bediening van de laser in de TTL + modus. Als alternatief, de aanschaf van een groene 532 nm DPSS laser is een kosteneffectief alternatief dat zowel halorhodopsins en archaerhodopsins kan activeren. De numerieke apertuur (NA) van een vezel is belangrijk om te overwegen bij het ontwerpen en de aankoop van fiber componenten voor laser montage set-up. De NA van een optische vezel bepaalt de hoeken van lichtstralen die kan worden aanvaard en afgegeven aan het uiteinde van een vezel. Indien een hoge-NA vezel wordt naar een lagere NA vezel zal aanzienlijk verlies optreden op die interface, dus is het belangrijk om consequent WI<html> th fiber NA binnen één setup (of ervoor te zorgen dat NA verhoogt langs het lichtpad). Het effect van vezel NA van het volume van hersenweefsel verlichte minder belangrijk, aangezien hersenweefsel sterk verstrooiende en aangezien het licht gekoppeld vanuit een laserbron wordt vaak &quot;underfill&quot; high-NA vezels; Echter optische vezels met een NA van 0,22 en 0,37 worden vaak gebruikt. Evenzo koppelen van een grotere kern een kleinere kern vezel zal ook resulteren in aanzienlijke verliezen, dus altijd zeker te verhogen of gelijk kern diameters wordt naargelang de laserbron aan het dier implantaat. Op een algemene opmerking, moet vezeluiteinden altijd worden afgedekt wanneer niet in gebruik om stof en deeltjes opbouw te voorkomen. Het is een goed idee om regelmatig schoon vezeluiteinden en connectoren (70% isopropylalcohol werkt goed) om maximale licht vermogen te garanderen, en om licht vermogen door middel van een &#39;dummy implantaat&#39; te testen voordat u begint elke dag experimenten. &quot;&gt; Tijdens gedragstesten, is het noodzakelijk maatregelen te nemen om te controleren voor de effecten van virale infectie, exogene eiwitexpressie, zichtbaar licht, en eventuele verwarming van weefsel effect en artefacten diergedrag. Daarom is de juiste controlegroep bestaan ​​dieren getransduceerd met een controle virus (bijvoorbeeld GFP, eYFP, mCherry) dat identieke lichte stimulatieparameters ontvangen. Experimentele verificatie is een cruciale laatste stap als gedragsgegevens gebruikt voor analyse is geheel afhankelijk van een juiste opsin glasvezelkabels plaatsing in het interessegebied . Specifiek bij dieren waarbij geen immunohistochemisch signaal wordt gedetecteerd of wanneer plaatsing van het signaal of vezel niet in het gebied van belang, dan gedragsgegevens voor dat dier worden verwijderd uit het experiment. Daarnaast is het essentieel lichtopbrengst testen de vezelpunt zowel voor chirurgische implantatie en opnieuw post-mortem om voldoende licht macht voor opsin activering te garanderen. In animals waar ernstige licht verlies is opgetreden door de vezel na experimenten (&gt; 30%) 9, gegevens voor dat dier moet worden overwogen voor verwijdering. Criteria voor de verwijdering moeten worden vastgesteld a priori. Ten slotte moet men de pulsfrequentie nodig neurale afvuren moduleren, die zal afhangen van de hersenen structuur en neuronale subtypes doelwit beschouwen. Geplaatst optogenetic licht stimulatieparameters aanwezig voor meervoudige neuronale subtypes, moet echter de mogelijkheid om neurale afvuren moduleren onafhankelijk bevestigd door in vivo of hersenplakje elektrofysiologische opnames. Als men wordt bedreven met laser gebruik en modificatie van laser set-ups, kunnen combinaties van verschillende golflengten worden aangebonden om meerdere vezels op een enkel dier of geleverd door dezelfde vezel voor combinatorische optogenetics 8. Multi-golflengte stimulatie zal steeds belangrijker worden, gezien de snelle ontwikkeling van de roodverschuivinged channelrhodopsins 8, de engineering van blauw-verschoven hyperpolariserende opsins 15, het gebruik van bistabiele stap-functie opsins 8,16,17, en de algemene groeiende lijst van opsins met verschillende activering spectra 11. Deze uitbreiding van de optogenetische toolbox zal de ongekende controle van meerdere neurale sub-types, zowel binnen als tussen de gebieden van de hersenen in staat te stellen hun rol in het bestuur van complexe gedragsproblemen staten bepalen.

Optogenetics heeft een revolutie teweeggebracht systemen-niveau neurowetenschappen in zijn zoektocht naar de neurale circuit elementen rijden normaal en ziekte-relevante gedragstoestanden. De ontdekking dat lichtgevoelige microbiële opsins kon 1 functioneel worden uitgedrukt in zoogdiercellen mits het platform voor het gebruik van licht om ongekende controle van neurale activiteit met een hoge ruimtelijke en temporele precisie 2 te krijgen. In tegenstelling tot traditionele elektrofysiologische en farmacologische benaderingen voor de behandeling van neurale activiteit optogenetics maakt de bestrijding van specifieke celtypen (voor genetische identificatie of ruimtelijke uitsteeksel) in heterogene populaties en fysiologisch relevante tijdschalen. De latere invoering van een neurale-optische interface voorzien van een praktisch hulpmiddel voor de levering van licht om gedragen dieren 3. Dit heeft het mogelijk gemaakt voor real-time modulatie van bepaalde neurale circuits in wakker gedragen knaagdieren om causaal testen van derol van deze neurale circuits in het bestuur van gedragstoestanden naar neurologische en psychiatrische ziekten 4-6 relevant. Optogenetics, daarom is een krachtig hulpmiddel voor introductie in elk laboratorium geïnteresseerd in het onderzoeken van de functionele relatie tussen hersenactiviteit en gedrags- of fysiologische maatregelen in diermodellen. Succesvol ontwerp en de voltooiing van een optogenetische experiment houdt in verschillende stappen en overwegingen (zie figuur 1). Het doel van het huidige protocol is om individuen te voorzien van de gereedschappen en onderdelen, samen met de theoretische en praktische kennis, die nodig zijn om optogenetische stimulatie uitvoeren wakker gedragen knaagdieren. Momenteel zijn er twee overheersende golflengte marges gebruikt microbiële opsin kanalen activeren: in het blauwe spectrum (gewoonlijk 473 nm) en groen-geel spectra (meestal 532 of 591 nm). Beide lasers en licht-emitterende diodes (LEDs) worden gebruikt als lichtbron voor dEliver specifieke golflengten van licht om hersenweefsel. De niet-coherent licht dat LEDs maakt echter effectieve transmissie van licht moeilijk wanneer het koppelen in de voor in vivo knaagdier stimulatie kleine kern vezels. Bepalen van de geschikte laser samenstel een cruciale eerste stap en zal afhangen van het beoogde gebruik van optogenetics in het lab. Het huidige protocol beschrijft twee basisconfiguraties die verschillen in hun gemakkelijke montage en gebruik: single pre-gekoppelde lasers en dubbele lasersystemen (zie figuur 2). Enkele lasersystemen die vooraf gekoppeld door de fabrikant in wezen kant-en-go bij aankomst met weinig tot geen opstelling vereist, maar hebben het nadeel minimale eindgebruiker voorbeeld. Een dual laser systeem maakt het mogelijk de levering van twee verschillende golflengten beneden dezelfde vezel. Dit wordt steeds belangrijker met de komst van combinatorische optogenetics worden waarbij verschillende golflengtes kan worden gebruikt voor het activeren / remmen onderscheidt celtypen die ruimtelijk mede gelokaliseerd. Dit is ook van essentieel belang is voor gebruik met een bi-stabiele stap functie opsins waar fotostromen worden gestart en beëindigd door blauw en geel licht, respectievelijk 7,8. Dual lasersystemen ook aanpasbaar als de gebruiker kan toevoegen of componenten (zoals een externe shutters, beam filters, inline power meter) vanaf de stralengang verwijderen behoefte. Door zijn veelzijdigheid, is de dual laser set-up aan te raden als optogenetics gaat om een ​​voortdurende instrument dat wordt gebruikt in het lab zijn. Koppeling van de lasers, kan echter een uitdaging en dus een snelle, eenvoudige en betrouwbare koppelingsmechanisme is voorzien in dit protocol. Let op, dit protocol beschrijft de montage van optische componenten en maakt gebruik van patchkabels en componenten die zijn geoptimaliseerd voor stap-index multimode glasvezels met een 200 pm kern en een numerieke apertuur (NA) van 0,22. Verschillende kern maten en NA zijn beschikbaar voor aankoop, maar alle componenten moeten idealiter overeenkomen qua kerngrootte en NA te vermijden licht verlies bij glasvezelverbinding punten. Als alternatief op een glasvezelverbinding, kan het licht gaan van een kleinere naar een grotere kern grootte; en / of van een lagere naar een hogere NA-NA vezel zonder bijkomend verlies. Tethering strategieën worden voorzien die het mogelijk maken simultane stimulatie van meerdere muizen high-throughput gedragstesten. De protocollen over te nemen, gebruik van chronisch implanteerbare vezels voor gedragsonderzoek, maar kunnen worden aangepast voor acute stimulatieprotocols. Acuut geïmplanteerde vezels voordelig te combineren optogenetic stimulatie met farmacologische manipulatie, omdat dezelfde canule gebruikt om drugs en het uiteinde van een optische vezel op dezelfde locatie te leveren. Het gebruik van chronisch geïmplanteerde vezels is echter sterk aanbevolen voor meerdaagse gedragstesten aangezien daardoor weefselbeschadiging een herhaalde plaatsen en verwijderen van vezels en verhoogt de nauwkeurigheid qua consistente plaatsing van vezels voorweefsel verlichting 3. In combinatie met de tethering configuraties beschreven, kan gedrag worden geregistreerd betrouwbaar meerdere dagen. Inderdaad, betrouwbare lichttransmissie gemeld maanden na vezels implantatie 9 zodanig dat chronische stimulatie en gedragsproblemen testen paradigma&#39;s kan, in theorie, worden uitgevoerd over meerdere dagen en weken uitgevoerd. Aanvullende opmerkingen over hardware componenten zijn toegevoegd aan het protocol bij de lezer de keuze in het beste product dat past bij hun individuele behoeften, met inbegrip van kosteneffectieve alternatieven en producten die kunnen worden gemaakt in eigen huis mogelijk te maken. Belangrijke tips die handig zijn tijdens de installatie en implementatie zijn ook aanwezig.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Laser Set-up</td></tr><tr><td>100 mW 473nm of 488nm Diode Laser System, &lt;2% Stabiliteit (hoeveelheid: 1)</td><td>Omicron</td><td>Luxx/Phoxx 473/488-100</td><td>Optioneel accessoire omvat een afstandsbediening
box met sleutelschakelaar en LED-display</td></tr><tr><td>100 mW 594nm DPSS-laser (hoeveelheid: 1)</td><td>Colbolt</td><td>0594-04-01-0100-300</td><td>04-01 serie gele laser; gevoelig voor terugreflectie
van vezels</td></tr><tr><td>200 mW 532 nm DPSS-laser; 5% vermogensstabiliteit (hoeveelheid: 1)</td><td>Shanghai Lasers</td><td>GL532T3-200</td><td>Kosteneffectief alternatief voor gele DPSS-laser
voor activering van halorhodopsines en
archaerhodopsines</td></tr><tr><td>Non-contact stijl laser naar multimodevezelkoppeling (hoeveelheid: 1)</td><td>OZ Optics</td><td>HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td><td>Voor gebruik met dubbele laseropstelling; Specificaties: 33 mm
OD voor 400 - 700 nm; FC ontvangstvak, f = 20 mm lens
met postmontage laserkopadapter #11</td></tr><tr><td>Aluminium breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Draad (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>MB1213</td><td>Voor dubbel lasersysteem</td></tr><tr><td>Aluminium breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Draad (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>MB1012</td><td>Voor enkel lasersysteem</td></tr><tr><td>Aluminium breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Draad (hoeveelheid: 2)</td><td>Thorlabs</td><td>MB4</td><td>Voor blauwe laser; dubbel lasersysteem</td></tr><tr><td>Compacte variabele hoogteklem, 1/4"-20 Tapped (hoeveelheid: 4)</td><td>Thorlabs</td><td>CL3</td><td></td></tr><tr><td>3/4" roestvrij staal post (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>TR075</td><td></td></tr><tr><td>1" roestvrij staal post (hoeveelheid: 4)</td><td>Thorlabs</td><td>TR1</td><td></td></tr><tr><td>Posthouder met veerbelaste hex-vergrendelingsmoer (hoeveelheid: 2)</td><td>Thorlabs</td><td>PH1</td><td></td></tr><tr><td>Socle Base Adapter (hoeveelheid: 3)</td><td>Thorlabs</td><td>BE1</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Klemvork (hoeveelheid: 3)</td><td>Thorlabs</td><td>CF1253</td><td></td></tr><tr><td>Kinematische houder voor 1" optica met zichtbaar laserkwaliteitsspiegel (hoeveelheid: 3)</td><td>Thorlabs</td><td>KM100-E02</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale filterdichtheidswiel (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-2M</td><td></td></tr><tr><td>1" Longpass dichroic spiegel 50% (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td></td></tr><tr><td>Kinematische houder voor 1" optica (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>Voor dichroische spiegel</td></tr><tr><td>20-delig zeskantsleutelset met standaard (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>TC2</td><td></td></tr><tr><td>1/4"-20 dopschroef en hardwarekit (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2</td><td></td></tr><tr><td>Montagebasis 1" x 2.3" x 3/8" (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S</td><td></td></tr><tr><td>FC/PC naar FC/PC L-Haak koppelingshuls (hoeveelheid: 2)</td><td>Thorlabs</td><td>ADAFCB1</td><td>Dual FC/PC L-bracket ook beschikbaar</td></tr><tr><td>Breadboard heftjes (hoeveelheid: 3)</td><td>Thorlabs</td><td>BBH1</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash;1" Bandpass Filter, CWL = 450 &plusmn; 2 nm, FWHM = 10 &plusmn; 2 nm (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>FB450-10</td><td>Voor gebruik met diodelasers die spontaan
uitzenden</td></tr><tr><td colspan="4">2. Laser Koppeling</td></tr><tr><td>! Laserbeschermende bril (hoeveelheid: 1 voor elke gebruiker bij elke golflengte)</td><td>Verschillend</td><td></td><td>! Raadpleeg laseraanbieder om de juiste
selectie van bril te verzekeren die maximale
lichtverzwaking zal bieden voor de aangeschafte laser</td></tr><tr><td>Vezel optic kabel tester (hoeveelheid: 1)</td><td>Eclipse</td><td>902-186N</td><td></td></tr><tr><td>Een-staps vezel connector reiniger (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>FBC1</td><td></td></tr><tr><td>Koppeler patchkabel (0.75 meter) (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>0.75 m 200 &mu;m kern, 0.22 NA, FC/PC connectors multimodevezels; voor dubbel lasersysteem</td></tr><tr><td>Koppeler patchkabel (0.5 meter) (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>0.5 m 200 &mu;m kern, 0.22 NA, FC/PC connectors, multimode; voor enkel lasersysteem</td></tr><tr><td>Doric mini kubus (hoeveelheid: 2)</td><td>DORIC</td><td>DMC_1x2_FC-2FC</td><td></td></tr><tr><td>Compacte vermogen en energie meter console (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Digitaal 4" LCD</td></tr><tr><td>C-serie slanke vermogen sensor 5 - 500 mW (hoeveelheid: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>S130C</td><td>Meerdere detectortypes zijn beschikbaar; check
met leverancier</td></tr><tr><td colspan="4">3. In vivo Optogenetische Stimulatie</td></tr><tr><td>Multimodevezel splitters (hoeveelheid: 2)</td><td>FONT Canada</td><td></td><td>Grote kern vezel optic 1 x 2 splitter, 50/50 verhouding, FC connectors, versterkt. Lengte, kerngrootte en numerieke apertuur kunnen worden gespecificeerd bij bestellen; kosteneffectieve
kleinere kerngrootten beschikbaar</td></tr><tr><td>Willekeurige golfvorm functiegenerator (2 kanalen) (hoeveelheid: 1)</td><td>Rigol</td><td>DG1022</td><td>Kan tot 2 lasers tegelijkertijd besturen</td></tr><tr><td>Vezel optic rotatiegewricht (commutator) (hoeveelheid: 6 - 8)</td><td>DORIC*</td><td>FRJ_1X1_FC-FC</td><td>*Ook beschikbaar via Thorlabs en Prizmatix</td></tr><tr><td>Dierd

in vivo optogenetische stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

De mogelijkheid om gedefinieerde neurale circuits te onderzoeken bij wakkere, vrij bewegende dieren met celtype-specificiteit, ruimtelijke precisie en hoge tijdelijke resolutie is een lang gezochte tool voor neurowetenschappers in de zoektocht op systeemniveau naar de neurale circuiterie die complexe gedragstoestanden regelt. Optogenetica is een geavanceerd hulpmiddel dat het veld van de neurowetenschappen aan het revolutioneren is en vertegenwoordigt een van de eerste systematische benaderingen om causale testen mogelijk te maken met betrekking tot de relatie tussen neurale signaleringsgebeurtenissen en gedrag. Door optische en genetische benaderingen te combineren, kan neurale signalering bidirectioneel worden geregeld door de expressie van lichtgevoelige ionenkanalen (opsines) in zoogdiercellen. Het huidige protocol beschrijft de levering van specifieke golflengten van licht aan opsine-expresserende cellen in diepe hersengebieden van wakkere, vrij bewegende knaagdieren voor modulatie van neurale circuits. Theoretische principes van lichttransmissie als experimentele overweging worden besproken in de context van het uitvoeren van in vivo optogenetische stimulatie. Het protocol beschrijft de ontwerp- en constructie van zowel eenvoudige als complexe laserconfiguraties en beschrijft tethering-strategieën om gelijktijdige stimulatie van meerdere dieren mogelijk te maken voor hoogdoorvoer gedragstests.

Behavioral resultaten verkregen met in vivo optogenetische stimulatie zijn volledig afhankelijk van de neurale circuit wordt gericht, het diermodel gebruikt, en de modulatie parameters. Voor actuele demonstratieve doeleinden dopamine neuronen in het ventrale tegmentale gebied of VTA, tyrosine hydroxylase :: Cre muizen werden getransduceerd met een stabiele stap-functie opsin (SSFO) 8, of controle virus (eYFP), en een vezel implantaat was chronisch geïmplanteerd. Het gebruik van TH :: Cre transgene muizen zorgt opsin expressie beperkt is tot TH + cellen (dopamine) in de VTA. Figuur 7 toont representatieve gedrags- resultaten verkregen met de huidige beschreven laser opstelling voor simultane stimulatie van meerdere muizen. Hier muizen vastgebonden en gestimuleerd tegelijkertijd met afzonderlijke lasers (3 muizen / Laser volgens figuur 4C) en bewegingsapparaat gedrag werd voor 1 uur. Herhaalde stimulatie van dopamine neuronen in het VTA resulteerde in eenhyperactief fenotype dat hield gedurende de hele duur van de stimulatie. Geen verandering in locomotorisch gedrag werd gezien in eYFP muizen (zie video 1). Volgende gedrags testen, werd immunohistochemie uitgevoerd om nauwkeurige virale targeting naar VTA dopamine neuronen en fibre placement werd visueel bevestigd (zie figuur 7) te controleren. <img alt="Figuur 1" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Experimentele stappen voor in vivo optogenetische stimulatie. Er zijn vier algemene stappen die betrokken zijn bij het ​​ontwerpen en uitvoeren van in vivo optogenetische stimulatie. Dit protocol zet de stappen die betrokken zijn bij de levering van het licht van een laser lichtbron tot diepe hersenstructuren in de gedragen knaagdieren en omvat 1) lasersysteem assemblage en licht koppeling; 2) het aanbinden strategieën voor ceen stap die essentieel is voor de interpretatie van gegevens - ANSLUITEN meerdere dieren lichtbron voor high-throughput gedragstesten en 3) richtsnoeren de targeting voor lichte levering te bevestigen. Opmerking: hoewel dit protocol is niet exclusief voor chronische implanteerbare vezels voor tethering doeleinden, is het raadzaam en aangenomen bij het combineren van optogenetische stimulatie met gedragsproblemen testen. Zie zowel Ung &amp; Arenkiel, 2012 18 en Sparta et al., 2012 9 voor in-house productie en de implantatie van chronische optische vezels. Ononderbroken lijnen = stappen die in dit protocol. <img alt="Figuur 2" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> Figuur 2. Laser systemen voor het in vivo optogenetic stimulatie. (A) Single lasersysteem in vivo stimulatie. Deze laser is ph<html> ysically vooraf gekoppeld door fabrikant en vereist weinig eindgebruiker set-up. (B) Dual lasersysteem. Twee lasers worden gekoppeld in een enkele vezel door het gebruik van spiegels die werken om elke stralengang sturen naar een contactloze stijl koppeling. Dit is de meest veelzijdige set-up als optische componenten kunnen worden verwijderd of toegevoegd als nodig, maar presenteert meer van een uitdaging op het gebied van efficiënte laser koppeling. (C) Schematische voorstelling van de dubbele lasersysteem weergegeven in (B) met vermelding van de plaatsing van lasers en spiegels met de bijbehorende laserstraal pad (pijlen) afgebeeld. Hier wordt de koudlichtspiegel &quot;D&quot; gebruikt om blauwe golflengten van het licht af te buigen tijdens het zenden gele golflengten door naar de koppeling &quot;C&quot; en in de bijgevoegde koppeling patchkabel. B = blauwe laser; C = non-contact stijl koppeling; D = dichroic spiegel; FW = filter wiel; M = Spiegel; Y = geel laser.krijgen = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 3" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> Figuur 3. (A) Kabel tester gebruikt in de niet-fysieke koppeling protocol Bottom:. Kabel tester direct verbonden met een patchkabel. Plaats beeldt verbindingspunt van tester aan de kabel (B) Patchsnoeren aangeduid hele protocol Van buiten naar binnen:.. Multimode fiber splitter, zwarte mantel dier patchkabel met witte zirconia sleufmof verbonden aan de flat-aanhangen (FC) einde, dikke mantel patchkabel (ook wel aangeduid als een &quot;koppeling koord&quot;). Dikke mantel patchkabels zijn bekleed met polyvinylchloride (PVC) buis voor extra bescherming. Voor deze kabels, worden standaard industrie kleurcodes gebruikt om onderscheid te maken tussen verschillende soorten vezels, waarbij oranje = multimode fiber. Dier patchkabels zijn<html> dunnere mantel voorzien om de flexibiliteit voor de verplaatsing van dieren mogelijk te maken tijdens gedragsmatige testen. Merk op dat stofkapjes zijn op FC geplaatst / PC eindigt wanneer de kabels niet in gebruik zijn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> Figuur 4. Tethering strategieën voor in vivo optogenetische stimulatie van (A) een enkel dier, (B) twee dieren; . (C) drie of vier dieren Samenstellingen zijn niet beperkt tot de hierboven getoonde - meerdere configuraties zijn mogelijk door de unieke combinatie van adapters, vezelsplitsingen, en vertakking flardkoorden die commercieel beschikbaar zijn of door aangepaste volgorde. Opmerking: patchkabels en vezelsplitsingen bevatten FC / PC connectoren aan beide uiteinden (slechts één uiteinde wordt afgebeeld).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 5" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> Figuur 5. Correcte en incorrecte (rode x) aansluiting van een patchkabel om een implanteerbare glasvezel met behulp van een split-sleeve. (Linker panel) A zirkoniumoxide split-folie om een patch aansluiten op de ferrule van een implanteerbare glasvezel (hier niet aangebracht op een dier). Pijl wijst naar het verbindingspunt tussen de patchkabel en implanteerbare glasvezel. Vergelijken (rechter paneel), waar er een kloof bestaat tussen de patchkabel en implanteerbare glasvezel, zoals gevisualiseerd door de splitsing van de verbindingsmof. Let op de lichte lekkage die kan optreden bij een slechte verbinding (rechtsonder). Bodeminzetstuk op upper linker paneel toont afzonderlijke componenten gebruikt. Van boven naar beneden van de insert: Dorische implanteerbare glasvezel canule, witte zirconia split-sleeve, een flatscreen-cleeve (FC) einde van een zwarte mantel dier patchkabel (volledige patchkabel weergegeven in figuur 3B). In alle panelen op dat de verbindingsmof is niet gelijk met het FC einde van de patch kabel. Verlaat ~ 0,5 cm van een over-hangen voor de aansluiting op de implanteerbare glasvezel aangebracht op het dier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> Figuur 6. (linkerzijde) en frontale (rechts) van een muis met een geïmplanteerde glasvezel aangesloten op een patch kabel. Gebruik de splitsing op de aansluitmof te visualiseren juiste verbinding van de patchkabel to de ferrule van de geïmplanteerde glasvezel. Het aansluitpunt wordt gemarkeerd door een rood gestippelde doos en ook afgebeeld in de bovenste insert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 7" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> Figuur 7. Representatieve resultaten. (Links) Behavioral uitlezing van in vivo optogenetische stimulatie. Voorbeeld van gedrag dat kan worden verkregen met behulp van de beschreven laser set-up en tethering-protocol. Getransduceerde met ofwel een stap-functie opsin (AAV5-DIO-SSFO-eYFP - bewegingsactiviteit werd tijdens optogenetische stimulatie van de ventrale tegmentale gebied (VTA) in tyrosine hydroxylase (TH) :: Cre muizen (8 / groep n = 7) opgenomen ) of de controle virus (AAV5-DIO-eYFP) in de VTA. Groepen van drie muizen werden gelijktijdig gebonden aan éénlaser zoals afgebeeld in figuur 4C en gestimuleerd met een 5 sec puls van 447 of 473 nm licht eens 15 min opgeleverd. Twee-weg herhaalde metingen ANOVA toonde een significante groep x tijd interactie (F 3,39 = 15,27, p &lt;0,0001) en een significant hoofdeffect van tijd (F 3,39 = 4.67, p = 0.007) waarbij optogenetic stimulatie verhoogde de bewegingsactiviteit alleen in SSFO muizen (Bonferroni post-hoc p &lt;0,0001, ten opzichte = 0 t - 15 keer bin), resulterend in een totale toename van de motorische activiteit in vergelijking met eYFP muizen (belangrijkste effect van de groep: F 1,39 = 10,69, p = 0,0061; Bonferroni post hoc p &lt;0,01 bij t = 15-30 en p &lt;0,001 bij t = 30 - 45 en t = 45 - 60). Fiber specs: 200 pm kern, 0,22 NA. Licht instraling = 6-66 mW / mm 2, wat overeenkomt met vezelpunt afstand van 0,1-0,6 mm van virale injectieplaats met 5 mW licht macht uitgezonden op vezelpunt voorafgaand aan tethering. Fout balken geven standaardfout van het gemiddelde. eYFPvs. SSFO: ** p &lt;0.01; *** P &lt;0.001; tijd-effect: #### p &lt;0,0001 (Rechts) Histologische bevestiging van virale en glasvezel plaatsing.. Image confocale fluorescentie verkregen op een Leica TCS SP5 laser scanning microscoop werd gebruikt om fibre placement (gestippelde lijn) en virale-gemedieerde expressie (groen) in de muis ventrale tegmentum volgende in vivo optogenetische stimulatie visualiseren. Dopamine neuronen (TH +) worden gezien in het blauw. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> Video 1. In vivo optogenetische stimulatie:. Hyperactiviteit tijdens VTA stimulatie met behulp van SSFO in TH :: Cre muizen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">Klik hier om deze video te bekijken.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellsstimulatie = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5"> Tabel 1. Licht bestralingen nodig om veelgebruikte opsins activeren. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Opsin Variant </td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2"> De vermogensdichtheid (/ mm 2) </td><td></td><td rowspan="2"> Woningen </td></tr><tr><td> Aan / Uit Kinetics </td></tr><tr><td colspan="5"> Optische excitatie: Fast-acting channelrhodopsins </td></tr><tr><td> ChR2 2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5 mW </td><td> 1.21 / 12 msec </td><td> Branden tot 40 Hz </td></tr><tr><td> Cheta 19 </td><td> 490 </td><td> 5 mW </td><td> 0,86 / 8,5 msec </td><td> Branden tot 200 Hz </td></tr><tr><td> CHIEF 20 </td><td> 450 </td><td> 1.65 mW </td><td> 1.62 / 12 msec </td><td> Niet-desensibiliserende vorm van ChR2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540-630 </td><td> 8 mW (540nm) </td><td> 5/34 msec bij 540nm </td><td rowspan="2"> Rood-verschoven </td></tr><tr><td> 3.2 mW (630nm) </td><td> 67 msec (on) bij 630nm </td></tr><tr><td colspan="5"> Optische excitatie: Langzaam werkende kanaal rhodopsins </td></tr><tr><td> Stabiele stap functie opsin (SFO) 8 </td><td> 470/590 </td><td> 8 uW (470nm) </td><td> 20 msec / 29 min </td><td> Nieuwe SFO variant; langer open toestand. Geopend door 470 nm, gesloten door 590 nm </td></tr><tr><td colspan="4"> Optische Remming </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560-630 </td><td rowspan="2"> 3-5 mW </td><td rowspan="2"> 2.5 msec / &lt;10 msec </td><td> Aanhoudende remming voor 30 min 22 met constant licht * </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> ArchT3.0 11, 23 </td><td> 520-560 </td><td> 1-5 mW </td><td> 2 / &lt;10 msec </td><td> Gevoeliger met grotere fotostromen dan eNpHR3.0 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="5"> Deze tabel is bedoeld als slechts een leidraad; specifieke licht bestralingen die nodig zijn voor neurale modulatie moet onafhankelijk worden bevestigd. </td></tr><tr><td colspan="5"> Experimentele validatie is belangrijk om te controleren of de opsin, gericht op strategie, en lichte stimulatie parameters moduleren neurale afvuren op de bedoelde wijze 5. </td></tr><tr><td colspan="5"> Vermogensdichtheid (mW / mm2) verwijst naar het vermogen van het licht verlicht op een bepaald gebied van hersenweefsel en niet naar lichtvermogen geëmitteerd vanuit de vezel tip. </td></tr><tr><td colspan="5"> * Gebruik altijd de laagste lichtintensiteit mogelijk, vooral bij langdurig lichte stimulatie. </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Licht bestralingen nodig om veelgebruikte opsins activeren. Afkortingen AAV = adeno geassocieerde virus DPSS = diode-gepompte solid state <br/&gt; EYFP = verbeterde gele fluorescerende eiwit FC / PC = flat aanhangen / fysiek contact GFP = groen fluorescerende eiwit PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing PVC = polyvinylchloride mW = milliwatt NA = numerieke opening SSFO = stabiele stap-functie opsin TH = tyrosine hydroxylase TTL = transistor-transistor logica V = spanning VTA = ventrale tegmentum

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Het algemene doel van deze procedure is het succesvol uitvoeren van in vivo optogenetische stimulatie van het centrale zenuwstelsel van knaagdieren in een wakker, vrij bewegend dier. Dit wordt bereikt door eerst het juiste lasersysteem voor het uitvoeren van optogenetische stimulatie op te stellen en te configureren. Vervolgens worden glasvezelkabels die compatibel zijn met gedragstesten geïnstalleerd om laserlicht af te leveren naar een geïmplanteerde glasvezel en in het opsine-expresserende hersengebied van belang.Vervolgens wordt het dier gekoppeld aan het lasersysteem voor optogenetische stimulatie en in een apparaat voor gedragstesten geplaatst. Ten slotte worden, terwijl het dier een gedragstaak uitvoert, door de experimentator gedefinieerde parameters voor lichtstimulatie toegepast om neuronen aan of uit te schakelen. Uiteindelijk wordt in vivo optogenetische stimulatie gebruikt om real-time controle over gedefinieerde populaties neuronen of neurale circuits in wakker, actieve dieren mogelijk te maken, om zo hun functionele rol in een specifiek gedrag van belang te bepalen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het de real-time controle mogelijk maakt van genetisch en ruimtelijk gedefinieerde populaties neuronen in wakkere, behandelde dieren, met de temporele resolutie die nodig is om neurale activiteitspatronen direct te koppelen aan complexe gedragstoestanden. Dit protocol maakt gebruik van klasse 3B lasers en vereist dat de juiste training en veiligheidsrichtlijnen worden gevolgd. Veiligheidsbrillen moeten te allen tijde worden gedragen bij het bedienen van lasers, waarbij uitlijningsprocedures een bijzonder hoog risico vormen. Na het opzetten van de laserapparatuur volgens het tekstprotocol wordt de contactloze laserkoppeling van de interne blauwe laser uitgevoerd door eerst de schakelaars aan de achterzijde van de laser in te stellen op 'cur' voor stroom en 'TTL' voor transistor-transistor logica-modus voor constante verlichting; zorg ervoor dat de stroomknop aan de voorzijde van de driver op nul staat.Zet vervolgens de laser aan door eerst de driver in te schakelen, gevolgd door de lasersleutel. Pas, ter bevordering van de oogveiligheid, de krachtknop langzaam aan zodat er ongeveer 1 mW laserlicht wordt uitgezonden. Laat de laser vervolgens 10 tot 15 minuten opwarmen.Sluit vervolgens de glasvezelkabelltester direct aan op het vrije uiteinde van het koppelingspatchkoord en schakel de kabeltester in. Pas daarna de hoek van de koppelaar aan, zodat de rode straal rechtstreeks terugloopt naar het midden van de dichroïsche spiegel. Het straalpad van het rode licht dat door de kabeltester wordt uitgezonden, is het exacte pad dat het binnenkomende laserlicht moet volgen om in de laser te worden gekoppeld.Om een koersuitlijning uit te voeren, gebruikt u de laterale en horizontale knoppen op de kinematische spiegels om de laserstraal naar de koppelaar te sturen. Maak u geen zorgen als er op dit moment geen blauw licht uit de aan de koppelaar bevestigde patchkabel komt. Plaats nu een enkel stukje semi-transparant papier direct voor de dichroïsche spiegel, tussen de dichroïsche spiegel en de koppelaar.Er zullen zowel een blauwe als een rode stip op dezelfde zijde van dit papier verschijnen, respectievelijk afkomstig van de laser en de kabeltester. Voer fijne aanpassingen uit aan de eerste stuurspiegel door voorzichtig aan de laterale en horizontale knoppen te draaien om het centrum van de rode stip uit te lijnen met de blauwe stip. Verplaats het papier terug naar de koppelaar zodat het er direct voor staat, en stel de knoppen op de tweede dichroïsche spiegel bij om de laserstraal uit te lijnen met de rode straal.Ga door met het maken van fijne aanpassingen aan de twee spiegels totdat het centrum van de blauwe en rode stralen exact zijn uitgelijnd. Coline, verwijder de kabeltester uit het koppelkoord. Laserlicht kan nu worden toegelaten vanaf het uiteinde van het koppelpatchkoord.Om de koppelingsefficiëntie te bepalen, gebruikt u een lichtvermogensmeter om het lichtvermogen dat de koppelaar ingaat te vergelijken met het lichtvermogen dat uit het uiteinde van de vezel komt. Een koppelingsefficiëntie van meer dan 80% wordt als zeer goed beschouwd, mits de positie van de dichroïsche spiegel behouden blijft. Gebruik de twee stuurspiegels voor de buitenste gele laser en volg de zojuist gedemonstreerde uitlijningsprocedure voor het koppelen van de gele laser om een optische vezel in te stellen voor de stimulatie van één enkele muis.Begin met het direct bevestigen van de F-C-F-C-L beugeladapter aan het breadboard om de koppelsnoer-patchkabel aan te sluiten op een dikke, omhulde patchkabel. Bevestig een commutator-draaikoppeling aan de vrije uiteinden van de dikke, omhulde patchkabel. Bevestig vervolgens de dier-patchkabel aan de commutator.Bevestig een verbindingssplitmuff door deze over het vrije metalen hulsuiteinde van het patchkoord voor het dier te schuiven, zonder de moff volledig aan te drukken. Laat ongeveer 0,5 centimeter van de moff bloot, aangezien dit het deel is dat via een BNC-kabel wordt verbonden met de glasvezel die aan het dier is bevestigd. Verbind de blauwe laserdriver met de pulsgenerator en schakel de pulsgenerator in.Zet nu een geschikte veiligheidsbril op. Controleer vervolgens of de voedingsknop aan de voorzijde van de driver op nul staat, en schakel de laser in door eerst de driver aan te zetten en daarna de lasersleutel, waarbij de laser is ingesteld op de TT L positieve modus. Pas de knop aan de voorzijde van de laser langzaam aan en gebruik een lichtvermogensmeter om een lichtvermogensemissie van 5 tot 10 milliwatt in te stellen aan de punt van de patchkabel voor dieren.Raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende details over deze instelling. Schakel de blauwe laser over naar de analoge modus voor in vivo stimulatie en wacht 10 tot 15 minuten tot de laser is opgewarmd. Fixeer vervolgens de muis voorzichtig en verbind de split-mouwe van het dier-patchkoord met de chronische implanteerbare vezel.Zorg ervoor dat de uiteinden van beide vezels fysiek contact met elkaar maken door de opening in de verbindingshuls als venster te gebruiken om het directe contact tussen de twee te visualiseren. Laat de muis enkele minuten herstellen voordat de gedragstests beginnen. Plaats het dier vervolgens in het apparaat voor gedragstesten en zorg ervoor dat het verbindingskoord niet is blijven haken.Gebruik de pulsgenerator om een blauwe laser met een vooraf bepaalde frequentie te pulseren die de gekozen optie zal activeren. Bevestig na voltooiing van het experiment histologisch de plaatsing van het virus en de fiber, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, voor een nauwkeurige interpretatie van de gedragsresultaten. Controleer onder een microscoop de plaats van de opsinexpressie en het fiberimplantaat en bevestig visueel de juiste plaatsing van de virusinjectie en het implantaat op basis van de gekozen coördinaten.In dit voorbeeld van gedragsresultaten verkregen via in vivo optogenetische stimulatie, werden dopaminerge neuronen in het ventrale gebied of de VTA van tyrosinehydroxylase-GFP-muizen getransduceerd met ofwel een stabiele step-function OPSIN of EYFP als controlevirus, waarna een fiber-implantaat chronisch werd geplaatst. Groepen muizen werden simultaan gestimuleerd en het locomotieve gedrag werd gedurende één uur geregistreerd, zoals hier wordt gedemonstreerd. Herhaalde stimulatie van de ops-getransduceerde muis links resulteerde in een hyperactief fenotype dat gedurende de gehele stimulatie aanhield.Hoewel er na de gedragstests geen verandering in het locomotief gedrag werd waargenomen bij de controlemuis rechts, werd immunohistochemie uitgevoerd om de nauwkeurige virale targeting van VTA-dopaminerge neuronen te verifiëren, en de plaatsing van de vezels werd visueel bevestigd, zoals in deze figuur wordt getoond. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden gebruikt om de neurale activiteit in elk gewenst hersengebied van interesse te manipuleren, in combinatie met diverse gedragstests als functionele readout van de modulatie van neurale circuits.

in-vivo-optogenetic-stimulation-of-the-rodent-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

Dit werk introduceert een methode voor het uitvoeren van een optogenetic single-eenheid betrouwbaar opnemen vanaf een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode.

Optogenetics identificatie van een neuronale Type met een glazen Optrode in wakker muizen

Hier beschrijven we methoden van optogenetische manipulatie van bepaalde soorten neuronen tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen, het presenteren van onze recente werk op de bed kern van de Stria terminalis als voorbeeld.

Optogenetische manipulatie van neurale circuits tijdens het monitoren van slaap/wakkerheid toestanden in muizen

Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het identificeren van de cel-type specifieke functionele connectiviteit van lange-bereik ingangen van verre hersengebieden met behulp van optogenetische stimulaties in ex vivo hersenen segmenten.

In vivo intracerebrale Stereotaxic injecties voor Optogenetische stimulatie van lange-afstand ingangen in muis hersenen segmenten

Hier presenteren we twee gemakkelijk te volgen stapsgewijze protocollen voor plaatsvoorkeursparadigma's met behulp van optogenetica bij muizen. Met behulp van deze twee verschillende opstellingen, voorkeur en vermijding gedrag kan stevig worden beoordeeld binnen hetzelfde apparaat met een hoge ruimtelijke en temporele selectiviteit, en op een eenvoudige manier.

Twee verschillende Real-Time Place Preference Paradigma's met behulp van Optogenetica binnen de Ventral Egmental Gebied van de Muis

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd.

Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Zoals momenteel geïmplementeerd, vereist optogenetica bij niet-menselijke primaten injectie van virale vectoren in de hersenen. Een optimale injectiemethode moet betrouwbaar zijn en, voor veel toepassingen, in staat zijn om individuele locaties van willekeurige diepte te targeten die gemakkelijk en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd in de postmortale histologie. Een injectiemethode met deze eigenschappen wordt gepresenteerd.

Injecties van AAV-vectoren voor optogenetica in verdoofde en wakkere zich gedragende niet-menselijke primatenhersenen

Het huidige protocol beschrijft hoe draadloze optogenetica in combinatie met high-speed videografie kan worden gebruikt in een enkele pellet reach-to-grab-taak om de neurale circuits te karakteriseren die betrokken zijn bij de uitvoering van bekwaam motorisch gedrag bij vrij bewegende muizen.

In vivo Draadloze optogenetische controle van bekwaam motorisch gedrag

Dit protocol beschrijft een chirurgische ingreep voor het uitvoeren van ruggenmergchirurgie en voor het implanteren en vastzetten van een optische schacht over het ruggenmerg bij knaagdieren.

Implantatie van opto-elektronische apparaten in het ruggenmerg van knaagdieren

Leer optogenetische stimulatie in vivo bij knaagdieren voor gedragsneurowetenschap. Deze methode maakt real-time controle van neuronale circuits mogelijk tijdens gedragstaken.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Meer video's verkennen