Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas

O objetivo geral deste procedimento é visualizar as bactérias e a atividade da pneumonia por estreptococos usando o ensaio de sobreposição. Isso é feito primeiro esfaqueando a cepa do produtor em uma placa TSA. Na segunda etapa, a mistura de cepas de sobreposição é preparada e, em seguida, pipetada lentamente na placa TSA contendo a cepa produtora escalonada.

Na etapa final, a atividade bacteriana é avaliada. Em última análise, o ensaio de sobreposição pode ser usado para mostrar a inatividade da bactéria ou a produção de feromônios pela cepa de interesse esfaqueada. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a purificação direta da bacterina, é que esse método é uma maneira rápida de estabelecer uma variedade de bactérias, inatividade e rastrear várias cepas em busca de bactérias em produção.

Demonstrando o procedimento estará Natalie Marchek, uma estudante de pós-graduação em meu laboratório Para preparar as bactérias em produção, comece listrando a cepa pneumocócica de interesse em uma placa TSA de 5% de sangue de ovelha e incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, pipete de 3000 a 4.000 unidades de catalisadores em placas contendo 25 mililitros de TSA e use esferas de vidro estéreis para espalhar os catalisadores pelas placas. Depois de deixar as placas secarem por cerca de 10 minutos sob um gabinete de segurança biológica, colete uma quantidade visível de bactérias em uma ponta de pipeta e enfie a ponta da pipeta na placa TSA seca.

Se possível, inclua uma bactéria conhecida produtora de pecado como controle positivo e a cepa a ser usada na sobreposição como controle negativo, fornecendo espaço adequado entre as facadas para que os halos de crescimento não se sobreponham. Em seguida, incubar as culturas de facadas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por seis horas no dia anterior ao ensaio de sobreposição, inocular cinco a 10 colônias da cepa pneumocócica a ser testada em tubos de vidro contendo cinco mililitros de meio THY contendo 0,5% de extrato de levedura. Em seguida, feche as tampas dessas culturas de cepas de glicerol e incube-as em banho-maria a 37 graus Celsius sem agitar.

Após quatro a cinco horas, inverta suavemente os tubos algumas vezes e meça o od. Quando as culturas atingirem uma DO dois 60 de 0,3 a 0,5, adicione glicerol a uma concentração final de 20% e, em seguida, alíquota das culturas em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e armazene os tubos a menos 80 graus Celsius. Na manhã seguinte, descongele uma alíquota de caldo de glicerol em temperatura ambiente.

Então, pouco antes da aplicação de sobreposição, misture cinco mililitros de THY 3000 a 4.000 unidades de catalisador e 200 microlitros do estoque de glicerol em um tubo cônico de 15 mililitros. Para cepas bacterianas repórter, adicione 50 microlitros de Xcel à mistura de sobreposição usando um tubo cônico por placa. Coloque a mistura de sobreposição em temperatura ambiente enquanto a mistura está equilibrando o sólido fundido TSA em um micro-ondas e, em seguida, coloque-a em um banho-maria a 55 graus Celsius.

Quando o TSA derretido esfriar a 55 graus Celsius, adicione rapidamente três mililitros do TSA à mistura de sobreposição e pipete para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de cinco mililitros. Tomando cuidado para não introduzir bolhas, em seguida, pipete lentamente a mistura de sobreposição diretamente na placa TSA esfaqueada. Após alguns minutos, quando a placa estiver endurecida e sem girar a placa, coloque cuidadosamente a cultura de facada sobreposta de volta na incubadora para cultura durante a noite.

Na manhã seguinte, observe o crescimento durante a noite. As placas devem parecer opacas devido ao crescimento da cepa de sobreposição, exceto nas áreas onde ocorreu inibição ou sinalização de feromônios. Existem dois resultados possíveis para o ensaio de sobreposição neste experimento representativo.

Após a cultura durante a noite, uma zona de depuração foi observada ao redor da cepa esfaqueada, indicando que essa cepa de sobreposição é sensível aos pecados da bactéria que estão sendo produzidos. Observe também o redemoinho da deformação esfaqueada na mistura de sobreposição. Neste experimento, a cepa de sobreposição era imune à secreção da bacterina, conforme indicado pela ausência de um halo ao redor da facada.

Também é possível que a cepa esfaqueada não secrete bacterina para o ensaio de sinalização. Dois resultados diferentes são possíveis. Neste experimento, a cepa esfaqueada secretou um feromônio que interagiu com a histidina quinase da cepa de sobreposição, conforme observado pela zona azul indicando a quebra de xal nesta imagem.

Se o feromônio não ativar a transcrição do locus BLP na cepa do repórter, ou se a cepa esfaqueada não secretar um feromônio, a quebra da escala X não ocorrerá como observado nesta imagem Seguindo este procedimento. Outros métodos, como análise mutacional ou sequenciamento, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se alguma atividade inibitória apreciável é atribuível ao locus BLP ou se é uma falta de atividade como resultado de uma mutação no gene transportador.