Name: מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: חקור מודל תרבית שיתוף תלת-ממדי לחקר אינטראקציות בין תאי סרטן ריאה לפיברובלסטים קשורים לסרטן בתוך מטריצת קולגן. שיטה זו מאפשרת חקירה מדויקת יותר של פלישת תאים ואינטראקציות סטרומליות בסביבת גידול פיזיולוגית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 ו-25460137).

הערה: מחקר זה אושר על ידי ועדות האתיקה המתאימות. 1. יסודי תרבות של Fibroblasts ריאות האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף של רקמת ריאה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימות רקמת ריאה אנושיות מחדר הניתוח כירורגי ישירות. לאסוף כ 1 סנטימטר 3 בלוקים מרקמת ריאה סרטנית ולא-סרטנית, עם המדגם שאינו סרטני שנאסף כרחוק מן הגידול ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את הדגימות במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) בתוספת 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר ו 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B (בינוני סרום ללא). לשמור על הדגימות התלויות בצינורות 50 מיליליטר סטרילי ולהעביר למעבדה. הערה: פיברובלסטים הם נוהג לנדוד ופרוליפרטיביים לעומת סוגי תאים אחרים, כגון אפיתל, אנדותל ותאי שריר חלק. שיטת תולדה מנצלת תכונות של fibroblasts אלה, וoutgroתאי כנף מסעיפי רקמות נמצאים בשפע בfibroblasts. לאחר כמה קטעי תא, סוגי תאים אחרים לא יצליחו לשרוד ולהפיץ בDMEM עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), וכתוצאה מכך בתרביות תאי פיברובלסטים מטוהרים. יכולים לשמש התאים 3-7 קטעים הבאים תרבות העיקרית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות explant ואוויר לתולדת תא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע תרבות העיקרית של fibroblasts באמצעות פרוטוקול שדווח בעבר עם שינויים 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במעבדה, למקם את דגימת הרקמה על צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים מבלי מדיום התרבות וחתוך לחלקים קטנים ~ 2-3 מ&quot;מ בגודל באמצעות מלקחיים סטרילית ואזמל. במהלך תהליך זה, להימנע מיבש הסעיף, אחרת היעילות של תולדת תא נפגמת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרדה של שכבת תאי האפיתל ורקמת חיבור: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את חלקי רקמות קיצוץ במדיום תרבות המכיל 2,000 PU / מיליליטר dispase אני ותרבות במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את סעיפי רקמות לצלחת, ולהפריד את שכבת תאי האפיתל מרקמת חיבור הסמוכה. לעבד את החלקים בספסל נקי כדי למנוע זיהום של מיקרואורגניזמים. הערה: אם יש צורך בתרבות העיקרית של תאי אפיתל, לבצע שלב 1.3. אם fibroblasts רק הם להיות מבודד, להשמיט צעד 1.3 בגלל מעברי תרבות explant והתא הבאים הם שליליים עבור תאי אפיתל, אשר יניבו אוכלוסיות פיברובלסטים מטוהרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קובץ מצורף של סעיפי רקמות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את הרקמות לחתיכות 1 מ&quot;מ באמצעות שני אזמלים. אם החלקים אינם קטנים מספיק, הם לנתק בקלות רבה יותר מהצלחת, והתאים לא יצליחו להיגמל על פני השטח הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קטעי רקמת ריאות קטנים זו מזו כדי לשמור על אזור ריק המקיף את כל חתיכה. הפוך סריטות על פני השטח של צלחת תרבית רקמה באמצעות סכין אזמל כדי להקל על התקשרות של סעיפי רקמות. הערה: מגרדמופיע גם כדי להקל על תולדת תא, מתן מסלולים שלאורכו תאים יכולים להעביר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להניח את חלקי רקמות טחונים בנפרד לתוך היטב בכל צלחת 6-היטב, ומכסה אותם עם תלוש כיסוי. צרף את תלוש לכסות על פני השטח של הצלחת באמצעות גריז סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח גריז סיליקון בשתי נקודות בנפרד 1.5 סנטימטרים בכל אחד גם באמצעות סיכת סטרילי. כיסוי של פיסות רקמה משפר את היעילות של תולדת תא ותא התפשטות הבאה כמה קטעים. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות explant לאחר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף בינוני תרבות לצלחת לפני סעיפי הרקמות להתייבש, כתולדת תא יעילה הולכת לאיבוד ברוב המקרים אם הדגימות להתייבש. אין לשפוך הבינוני מדי במהירות כמו בסעיפי הרקמות היו לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים בDMEM עם 10% FBS. השתמש מספיק בינוני רק כדי לכסות את הרקמה, אבל לא יותר מדי, כי זה מאפשר צף, כציפה נוספת מקדמת ניתוק מצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר נייד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית מדיום התרבות בזהירות בכל העת כמו תנועות חוזרות ונשנות של את המנה התרבות יכולות להוביל לניתוק של חלקי רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים התרבות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5-7 ימים. רענן הבינוני בכל יום אחר, ולטפל בכלי התרבות מינימאלית במהלך השינויים בינוניים. Fibroblasts להיגמל מקצה קטעי הרקמה בשבועות הבאים. הערה: לאחר ~ 2-3 שבועות, fibroblasts התבגרות כמעט מגיע למפגש, בהתאם לכמות של שטח פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 1x PBS, ולהוסיף 1 מיליליטר של טריפסין אני לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר trypsinization, לנתק את התאים באמצעות 9 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS. איסוף תאים תלויים במדיום בצינור 10 מיליליטר, יחד עם קטעי הרקמה. בעקבות צנטריפוגה כדי ליצור כדורי תא, resuspend את כדורים וכתוצאה מהמדיום החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים וחלקי רקמות על רחוב ללא מוצא חדשצלחת ture, ובשלב הרקמות מצליחות לצרף הצלחת ואילו התאים לדבוק ולגדול. למחרת, להסיר את פיסות הרקמה צף על ידי שאיפה, ולשנות את המדיום. fibroblasts המצורף להפיץ עם תרבויות שלאחר מכן. </li></ol></li></ol> 2. Co-תרבות תלת ממדית של Fibroblasts ריאות אדם ותאי הסרטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאים וחומרים כימיים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ להשתמש 2 x 10 5 תאי אפיתל 2.5 x 10 5 fibroblasts בכל טוב. הכן סוג קולגן IA (3 מ&quot;ג / מיליליטר, pH 3), FBS (100%), חיץ הכינון מחדש (50 מ&quot;מ NaOH, 260 מ&quot;מ NaHCO 3, 200 מ&quot;מ HEPES), 5x DMEM, DMEM בתוספת 10% FBS לתרבות פיברובלסטים, ובינוני שיתוף תרבות 3D (1: 1 תערובת של מדיום תרבות פיברובלסטים ובינוני תרבות לתאים סרטניים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי A549 תרבות אדנוקרצינומה ריאתית, fibroblasts והתרבות המשותף 3D A549 DMEM בתוספת 10% FBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> f ג&#39;ל קולגןormation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף fibroblasts התרבותי על צלחת 10 סנטימטרים עם 1x PBS, ולהוסיף 1 מיליליטר של טריפסין אני לצלחת. לאחר trypsinization ל~ 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לנתק את התאים באמצעות 9 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS. איסוף תאים תלויים במדיום בצינור 10 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב200-300 XG כדי ליצור כדורי תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורים וכתוצאה מכך FBS 100% בצפיפות של 5 x 10 5 מיליליטר /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ג&#39;ל קולגן על קרח. לקרר את חומרים כימיים, טפטפות וצינורות במקרר לפני ההליך הבא. אפילו על קרח, התערובת מתמצקת במידה מסוימת, ואת הנפח הכולל הוא פחות מהסכום של כל המרכיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל טוב, להכין ג&#39;ל קולגן על ידי ערבוב של 0.5 מיליליטר של השעיה פיברובלסטים (2.5 x 10 5 תאים) בFBS, 2.3 מיליליטר סוג IA קולגן, 670 μl 5x DMEM, ו -330 חיץ הכינון מחדש μl. לאפשר לג&#39;לים להגדיר בקלות בטמפרטורת חדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ פיפטה כדי להבטיח מיל הומוגניתxture. הימנע מיצירת בועות בתהליך pipetting. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את התערובת (3 מיליליטר) היטב בכל צלחת 6-היטב ולאפשר לgelatinize בחממה ב 37 ° C ללא הפרעה במשך 30-60 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאי סרטן על ג&#39;ל קולגן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שיתוף תרבות תלת-ממדית באמצעות פרוטוקול שדווח בעבר עם שינויים 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי סרטן גלולים במדיום שיתוף תרבות 3D (או בDMEM עם FBS 10% במקרה של תאי A549) בצפיפות של 1 x 10 5 / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 2 מיליליטר של הפתרון המושעה בתא (2 x 10 5 תאים) על פני השטח של כל ג&#39;ל. לשנות את מספר תא של תאים סרטניים או fibroblasts בשיתוף התרבות בהתאם לתנאי ניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התכווצות ג&#39;ל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג&#39;לי הלילה בשעה 37 ° C כל כך התאים הסרטניים יכולים לדבוק בג&#39;ל קולגן. לנתק את כל ג&#39;ל, וליצור &quot;תרבות הצפה&quot; בכל טוב of 6-גם הצלחת. הערה: על ידי שימוש בתרבות צף, שינויים שונים בגודל ג&#39;ל הנגרמים על ידי מתח מכאני והשפלה קולגן, אשר מתווכים על ידי אינטראקציה סלולרית בין תאים סרטניים שיתוף תרבותי וfibroblasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במחט בזווית 21 G או מרית קטנה כדי להפריד בין ג&#39;ל מהקצה של הבאר. כל 2-3 ימים, לרענן את הבארות עם 2 מיליליטר של מדיום שיתוף התרבות 3D. למדוד את גודלו של כל ג&#39;ל בכל יום במשך 5 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של ג&#39;ל קולגן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את תוכן קולגן של כל ג&#39;ל תוך שימוש בשיטות לכמת קולגן, כגון assay Sircol. לבצע ניתוח transcriptomic או RT-PCR לאחר איסוף RNA מהג&#39;לי 5. </li></ol></li></ol> 3. אוויר נוזלי ממשק תרבות והפלישה Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר culturing ג&#39;ל קולגן על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים, לחשוף את ג&#39;לי נדבק לאוויר על ידי הצבת אותם ברשת (70 גודל נקבובית מיקרומטר) ב6- החדשצלחות גם. הפוך את הרשת ממסננות תא זמינות מסחרי המשמשות לזרימה cytometry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למלא היטב כל אחד עם 11 מיליליטר של מדיום שיתוף התרבות 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את ג&#39;לי על הרשת בעזרת כף סטרילי, ולהסיר כל מדיום שנותר מהג&#39;לי. במצב זה, לצלול ג&#39;לי במדיום תוך לחשוף את פני השטח העליונים של ג&#39;ל לאוויר. להגדיר מצב זה כתרבות ממשק אוויר נוזלי. הערה: לאחר 5-7 ימים של שמירה על תרבות ממשק האוויר הנוזלית על 37 מעלות צלזיוס בחממה, תאי סרטן פולשני להגר לתוך הג&#39;ל. בהתאם לסוג התא וכתוצאה מאינטראקציות הסלולר, מעלות משתנה של שינוי מורפולוגי תא בתאים הסרטניים הנגרמות על ידי תרבות ממשק האוויר הנוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכה היסטולוגית, לתקן את הג&#39;ל בתמיסת פורמלין לילה בטמפרטורת חדר ולהטביע בפרפין. כתם חלקים אנכיים (4 מיקרומטר) עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E). בצע o ניתוח immunohistochemicaln הסעיפים 4. </li></ol>

<ol><li>Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+key+host+cell+type+in+tumor+initiation%2C+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ups.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis.</a> Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digest+on+the+role+of+the+tumor+microenvironment+in+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers.</a> Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).</li>
<li>Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+as+Another+Polarized+Cell+Type+of+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment.</a> Front. Oncol. 4, 62(2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+lung+cancer-associated+fibroblasts+in+three-dimensional+in+vitro+co-culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).</li>
<li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+gingival+fibroblast-epithelial+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction.</a> J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).</li>
<li>Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+keratinocyte+stratification+by+a+dominant+negative+JunB+mutant+without+blocking+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation.</a> Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li>
<li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li>
<li>Navab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+gene-expression+signature+of+carcinoma-associated+fibroblasts+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).</li>
<li>Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblasts+from+human+colon+tumors+shows+specific+prognostic+gene+expression+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature.</a> Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).</li>
<li>Hägglöf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+PDGFRbeta+expression+in+prostate+tumors+and+non-malignant+prostate+tissue+predicts+prostate+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival.</a> PLoS One. 5 (5), e10747(2010).</li>
<li>Saito, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forkhead+box+F1+regulates+tumor-promoting+properties+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).</li>
<li>Calvo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+YAP-dependent+matrix+remodelling+is+required+for+the+generation+and+maintenance+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Cafs מהווה רכיב מרכזי של ECM סביב תאי סרטן ולא רק לספק פיגום לגידול, אלא גם להשתתף באופן פעיל בהתפתחות גידולי 7. צבירת ראיות פורמת את ההשפעה של cafs או מולקולות הקשורים אליהם בסופו של דבר את הפרוגנוזה, המדגישה את התפקידים הקריטיים של התקדמות גידול בתיווך CAF 8. במחקר הקודם, שהועסקנו שיטת תולדה כדי לבודד cafs ריאות 4. בניסוי זה, התחזוקה של הידבקות סעיף רקמה על פני השטח הצלחת היא קר...

רקמת סרטן יכולה להיתפס כסוג של איבר, המתפתח באמצעות אינטראקציות קרובות בין הסרטן למיקרו-סביבה סטרומלית של הגידול, המורכבת מפיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), תאים חיסוניים, כלי גידול והמטריצה החוץ-תאית (ECM). CAFs הם המקור העיקרי לגורמים מסיסים (ציטוקינים, גורמי גדילה וכימוקינים) המפעילים השפעות מיטוגניות, פרו-נדידה ופרו-פולשניות על תאים סרטניים. הם גם מעוררים היווצרות כלי גידול ומגייסים תאים מבשר, כגון תאים שמקורם במח העצם (BMDC). CAFs מופעלים מעורבים בייצור ובעיצוב מחדש של ה-ECM, ובכך מקדמים את הצמיחה וההתפשטות של תאים סרטניים1. CAFs מספקים גם נישה המאפשרת קולוניזציה וגרורות של תאי גידול ומסוגלים להעניק פנוטיפים של תאי גזע לתאי סרטן שכנים. תצפיות פתולוגיות מצביעות על כך שתגובות סטרומליות או שינויים פיברוטיים ברקמות סרטן מעידות על פרוגנוזה גרועה. מחקרים אחרונים הראו גם כי תכונות סטרומליות של הגידול, כגון חתימת הגן, יכולות לחזות את הפרוגנוזה של המטופל. יתר על כן, גורמים שמקורם ב-CAF יכולים לווסת את הרגישות לכימותרפיה, ולהדגיש את תפקידם של CAFs בקביעת רגישות ועמידות לתרופות2.
מכיוון ש-CAFs ממלאים תפקיד רב פנים בקידום התקדמות הגידול באמצעות מסלולי איתות המתווכים אינטראקציות בין CAFs וסוגי תאים שונים בתוך מיקרו-סביבת הגידול, הם משכו תשומת לב הולכת וגוברת כמטרות חדשות לטיפולים בסרטן. ההטרוגניות של אוכלוסיות התאים בתוך המיקרו-סביבה הסרטנית מהווה מכשול למיקוד CAFs. הוצעו מספר סמנים ל-CAFs, כגון אקטין שריר חלק α (α-SMA), חלבון הפעלת פיברובלסטים (FAP) ופרוטן-1 ספציפי לפיברובלסטים (FSP-1: נקרא גם S100A4); עם זאת, סמנים מולקולריים אלה אינם ספציפיים להבחנה בין CAFs לתאים אחרים הקיימים ברקמות לא סרטניות3. לכן, יש צורך במחקרים נוספים כדי להשיג ידע נוסף על המאפיינים הספציפיים של CAFs. לשם כך, זה אינפורמטיבי לאפיין CAFs מתורבתים ראשוניים בהשוואה לפיברובלסטים רגילים המותאמים למטופל.
לאחרונה דווח על ניתוחים על CAFs שמקורם בחולה במספר סוגי סרטן, וחשפו דפוסי ביטוי גנים ייחודיים והתנהגויות תאים בהשוואה לפיברובלסטים שמקורם ברקמות לא סרטניות. באמצעות CAFs מבודדים מרקמות סרטן ריאות אנושיות, פיתחנו שיטת תרבית משותפת תלת מימדית, המאפשרת לנו להעריך את התכונות של CAFs ריאות. במודל זה, חקרנו את ההשפעות של ה-CAFs על פלישת תאי סרטן ריאה, התפשטות והתכווצות ג'ל קולגן, אשר סיכמו באופן ניסיוני את התפקידים מקדמי הגידול של CAFs4 ריאות.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>קולגן מסוג IA</td><td>ניטה ג'לטין בע"מ</td><td>CELL-1A</td><td></td></tr><tr><td>מאגר בנייה מחדש</td><td>Nitta gelatin Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תלוש כיסוי</td><td>NUNC</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>גריז סיליקון</td><td>Dow Corning Toray</td><td>גריז</td><td></td>ואקום גבוה</tr><tr><td>Dispase I</td><td>WAKO</td><td>386-02271</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים (70 &mu; מ)</td> <td>בז BD</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

התקדמות הסרטן (התחלה, גדילה, פלישה וגרורות) מתרחשת באמצעות אינטראקציות בין תאים ממאירים לתאי הסטרומה של הגידול שמסביב. המיקרו-סביבה של הגידול מורכבת ממגוון סוגי תאים, כגון פיברובלסטים, תאים חיסוניים, תאי אנדותל כלי דם, פריציטים ותאים שמקורם במח העצם, המוטבעים במטריצה החוץ-תאית (ECM). לפיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) יש תפקיד פרו-גידולי באמצעות הפרשת גורמים מסיסים, אנגיוגנזה ושיפוץ ECM. המודלים הניסיוניים להישרדות תאים סרטניים, התפשטות, נדידה ופלישה הסתמכו בעיקר על תרביות רקמה חד-תאיות וחד-שכבתיות דו-ממדיות או מבחני תא ביידן. עם זאת, ניסויים אלה אינם משקפים במדויק את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים באיבר חולה. כדי להשיג הבנה טובה יותר של אינטראקציות סטרומליות של גידול או מטריצת גידול, תרבויות רב-תאיות ותלת מימדיות מספקות כלים חזקים יותר לחקירת תקשורת בין-תאית ואפנון תלוי ECM של התנהגות תאי סרטן. כפלטפורמה למחקר מסוג זה, אנו מציגים מודל ניסיוני שבו תאים סרטניים מתורבתים על ג'ל קולגן המשובץ בתרביות ראשוניות של CAFs.

שיטת שיתוף תרבות זו, מחקה את המיקרו-הסביבה של הגידול, היא כלי שימושי כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאים הסרטניים וfibroblasts המשובצים ג&#39;ל קולגן. במחקר הקודם, שלושה פרמטרים הוערכו במודל זה ניסוי: התכווצות ג&#39;ל קולגן, פלישה של תאי סרטן ושינוי מורפולוגי. התפשטות תאי הסרטן גם נאמדה באמצעות immunostaining Ki67 4. דגימות רקמת ריאה נאספו מסעיפים סרטניים ולא-סרטניים של אונת ריאה כריתה (איור 1 א). דגימות טחונות לחתיכות קטנות ותרבותית בDMEM בתוספת 10% FBS...

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתרבית משותפת בתלת מימד, שימושי לחקירת אינטראקציות רב-תאיות ואפנון תלוי מטריצה חוץ-תאית של התנהגות תאי סרטן. במודל ניסיוני זה, תאים סרטניים מתורבתים על ג'ל קולגן המשובץ בפיברובלסטים הקשורים לסרטן אנושי.

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור אינטראקציות תאיות בין תאי סרטן ריאה לבין פיברובלסטים הקשורים לסרטן בשיטת תרבית משותפת תלת-ממדית. דבר זה מושג באמצעות תרבית ראשונית של פיברובלסטים אנושיים הקשורים לסרטן ריאה מרקמת ריאה שנאספה וקצצה לחתיכות בגודל של 1 mm. השלב השני הוא הכנת ג'לי קולגן המכילים פיברובלסטים על ידי ערבוב תמיסת קולגן עם תאי trypsinisized, והעברה לפלטה של 6 בארות לצורך ג'לטיניזציה.בשלב הבא, תאי אדנוקרצינומה של הריאה נזרעים על פני השטח של כל ג'ל כדי להכין תרבית משותפת תלת-ממדית של תאי סרטן ופיברובלסטים, והג'ל מופרד מקצה הבאר כדי ליצור תרבית צפה. השלב האחרון הוא ביצוע תרבית בממשק אוויר-נוזל ובדיקת פלישה (invasion assay) באמצעות חשיפת הג'לים המכווצים לאוויר, על ידי הנחתם על רשת הממוקמת בתוך פלטה של שש בארות. לבסוף, נעשה שימוש בבדיקות היסטולוגיות כדי להעריך את הפלישה של תאי הסרטן ואת השינויים המורפולוגיים.היתרון המרכזי של הליך זה על פני שיטות קיימות, כגון תרביות מונו-שכבה דו-ממדיות, הוא שניתן לחקור אינטראקציות רב-תאיות בתרבית תלת-ממדית. הליך זה מתחיל בתרבית ראשונית של פיברובלסטים מרקמת ריאה שנאספה, כפי שמתואר ומצוין בפרוטוקול הטקסט. בסרטון זה, נעשה שימוש בריאות של עכבר במקום ברקמת סרטן ריאה אנושית.הניחו את דגימת רקמת הריאה על צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 סנטימטר ללא תוצר תרבית. חתכו את הרקמה למקטעים קטנים בגודל של כ-1 מילימטר באמצעות פינצטה סטרילית וסכין מנתחים. במהלך תהליך זה, הימנעו מייבוש המקטע, אחרת יעילות צמיחת התאים תיפגע. הניחו את מקטעי רקמת הריאה הקטנים במרחק זה מאלו כדי לשמור על שטח פנוי מסביב לכל חלק.צור שריטות על פני השטח של צלחת תרבית הרקמה באמצעות להב סקלפל. לחלופין, כיסוי של חתיכות רקמה משפר את יעילות צמיחת התאים והנשגיהם לאחר מספר מעברים. ראשית, הנח גריז סיליקון בשתי נקודות, במרחק של 1.5 centimeter אחת מהשנייה, בכל באר.לאחר מכן, הניחו באופן פרטני חתיכות רקמה קצוצות במרכז כל באר. לאחר מכן, הצמידו את לבידה המכסה לפני השטח של הפלטה באמצעות גריס סיליקון. הוסיפו בעדינות תוצר תרבית לצלח, או לפלטת 6 בארות, לפני שפרוסות הרקמה יתייבשו.צמיחת התאים היעילה אובדת ברובה. אם הדגימות התייבשו, אין למזוג את המצע במהירות רבה מדי כדי למנוע התנתקות של חתכי הרקמה לצורך יצירת ג'ל קולגן. שטפו את הפיברובלסטים עם phosphate buffered saline בריכוז 1x או PBS והוסיפו tryin one כדי לנתק את התאים הצומחים לאחר trypsinization למשך כחמש דקות.בטמפרטורה של 37 °C,נתקו את התאים באמצעות תשעה מיליליטר של DMEM מועשר ב-10% FBS. אספו את התאים התלויים במצע לתוך מבחנה של 10 מיליליטר וסבבו אותם בצנטריפוגה במהירות של 200 עד 300 ×g כדי להוות משקעי תאים. השביו את המשקעים שנוצרו ב-100% FBS בריכוז של חצי מיליון תאים למיליליטר. קררו את הרכיבים, הפיפטות והמבחנות להכנת ג'ל קולגן במקרר לפני תחילת הכנת הג'ל.בשלב הבא, הכינו את ג'ל הקולגן על ידי ערבוב תמיחת הפיברובלסטים ב-FBS Type one A collagen five X-D-M-E-M ובבופר רקונסטיטוציה (reconstitution buffer); בצעו פיפוט נמרץ כדי להבטיח תערובת הומוגנית, תוך הימנעות מיצירת בועות במהלך תהליך הפיפוט. לאחר מכן, הוסיפו 3 mL מהתערובת לכל באער של פלטת 6 באערים והניחו לה להפוך לג'ל (gelatinize) באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ללא הפרעה למשך 30 עד 60 דקות. עבור תרבית תאי סרטן על ג'ל הקולגן, השהו (resuspend) את תאי הסרטן במצע קו-קלטור תלת-ממדי (3D co-culture medium) בריכוז של 1×10⁵ תאים ל-mL.צקו שני מיליליטר (2 mL) של תמיסת תאי אדנוקרצינומה של הריאה A 549 שהושעו מחדש על פני השטח של כל ג'ל. שנו את מספר תאי הסרטן או הפיברובלסטים בתרבית משותפת (co-culture) בהתאם לתנאי הניסוי לביצוע התכווצות הג'ל. דגרו את הג'לים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C כדי שתוכל תאי הסרטן להיצמד לג'ל הקולגן.לאחר מכן,נתקו כל אחד מהם וצרו תרבית צפה בכל באער. בלוח שש-בארות, השתמשו במחט במידה 21 בעלת זווית או במרית קטנה כדי להפריד כל ג'ל מדופן הבאר מדי יומיים עד שלושה ימים. רעננו את הבארות באמצעות 2 milliliters של מצע לתרבית שיתוף (co-culture) תלת-ממדית.מדדו את גודלו של כל ג'ל מדי יום במשך חמישה ימים. לבסוף, עיינו בפרוטוקול הטקסט לניתוח ג'ל קולגן. לאחר גידול ג'לי הקולגן ב-37 °C למשך חמישה ימים.חשפו את הג'לים המכווצים לאוויר על ידי הנחתם על רשת. בלוחיות שש-בארות חדשות, הכינו את הרשת ממסנני תאים הזמינים מסחרית המשמשים לציטומטריה של זרימה. מלאו בעדינות כל באר ב-11 milliliters של 3D co-culture.Medium.הניחו את הג'לים על הרשת באמצעות כף סטרילית והסירו כל שארית של מצע מהג'לים בתנאי זה. הג'לים טבולים במצע בעוד שהשטח העליון של הג'ל חשוף לאוויר. הגדירו תנאי תרבית זה כממשק אוויר-נוזל (air liquid interface).שיטת תרבית-משותפת זו, המדמה את הסביבה המיקרוסקופית של הגידול, היא כלי שימושי לחקירת האינטראקציות בין תאי סרטן לפיברובלסטים המוטמעים בג'לי קולגן. תאי 5 49 גודלו בתרבית-משותפת על ג'ל קולגן שבו הוטמעו הפיברובלסטים, ושכבת תאי 5 49 נחשפה לאוויר על ידי הנחת הג'ל על רשת בתוך מדיום. מוצגת כאן תמונה מייצגת של הג'ל המונח על הרשת בתוך באר של פלטת שש בארות, כולל ניתוחים היסטולוגיים עם hemat, toin ו-eoin.צביעה של חתכים רוחביים של ג'ל שגודל בתרבית תלת-ממדית חשפה פלישה של 5 49 תאים אל תוך ג'ל הקולגן שבו הוטמעו פיברובלסטים הקשורים לסרטן ריאה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ביטוי גנים או knockdown כדי לענות על שאלות נוספות, כגון תפקוד של גן ספציפי באינטראקציה של סביבת הגידול (tumor stroma).

three-dimensional-co-culture-model-for-tumor-stromal-interaction

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Heterotypic תלת ממדי<em&gt; במבחנה</em&gt; מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס ספרואיד גידול תלת ממדי ותרבית משותפת של תאי T. אגרוז יצוק עם microwells המכילים spheroids הגידול מוכן, ואחריו תוספת של תאי T. לאחר הדגירה, מערך זה מאפשר לחקור את האינטראקציה של תאי T עם ספרואידים סרטניים בסביבה תלת ממדית מבוקרת.

מודל תלת מימדי של תרבית משותפת של חדירת תאי T לספרואידים סרטניים

Coculture פרוסת מוח organotypic עם קרצינומה של תאים מאפשר לדמיין שינויים מורפולוגיים על ידי הקרינה וכן בתחום בהיר מיקרוסקופיה (וידאו) במהלך התהליך של פלישת תא קרצינומה של רקמת המוח. מערכת מודל זה מאפשרת גם להחלפת תאים וחידוש גישות ומציעה מגוון רחב של מניפולציות וניתוחים.

מערכת Coculture עם מוח פרוס Organotypic ו3D אליפטית של קרצינומה של תאים

שלוש תרבות ממדית של תאי אפיתל החלב בקרום במרתף מחדש היא שיטה שימושית לשחזר את ארכיטקטורת vivo של השד השפיר, וכדי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד. חשוב מכך, מערכת זו יכולה להיות מיושמת ללמוד קרצינומות פולשני ברקמות אחרות.

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

אנו מדגימים שיטה ליצירת פונדקאיות תלת מימדיות לסרטן השד, שניתן לתרבית באמצעות מערכת ביו-ריאקטור זלוף כדי לספק חמצן וחומרים מזינים. לאחר הגדילה, הפונדקאיות מקובעות ומעובדות לפרפין להערכת פרמטרים מעניינים. מוסברת ההערכה של פרמטר אחד כזה, צפיפות התאים.

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

תאי סרטן מוטבעים בג'ל קולגן ולאחר מכן נדחקים בג'ל פיברין תאי כדי ליצור מערכת תרבית תלת מימדית שבה ניתן לנטר את הפולשניות והיווצרות גידולי לווין.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

מערכת מודל מבחנה פותחה כדי ללכוד שינויים אדריכליים רקמה במהלך קרצינומה של הריאות קשקש (LUSC) התקדמות ב תלת מימדי (3D) שיתוף התרבות עם סרטן הקשורים פיברותקיעות (CAFs). מערכת זו אורגאיד מספק פלטפורמה ייחודית כדי לחקור את התפקידים של שונים תא הגידול הפנימי ושינויים חיצוניים לווסת את פנוטיפים הגידול.

מערכת מרב התרבות Coculture מודל ריאות קשקש התקדמות קרצינומה

המודל הרומן תלת מימדי המבוסס על האינטראקציה הטרולימית של תאי הגידול והריטרותקיעות מסטרומה. כאן, אנו מציגים התרבות הcoculture של תאים סרטניים מסטרומה, הדמיה של הזמן, ו מיקרוסקופ קונפוקלית כדי להמחיש את היווצרות של spheroids. זה מודל תלת מימדי מציע פלטפורמה רלוונטית ללמוד אינטראקציות הגידול משתית ולבדוק therapeutics סרטן.

סטרומה הרומן פיברוהפיצוץ-מודנן 3D הגידול מודל ספרואיד ללמוד אינטראקציה סרטניים-סטרומה וגילוי הסמים

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

מודלים מקיפים במבחנה המשיבים נאמנה את המחלה האנושית הרלוונטית חסרים. המחקר הנוכחי מציג יצירה ותרבות תלת מימדית של גידול תלת מימדי(תלת-ממדי), כלי הפריה אמין לחקר האינטראקציה בין הגידול לסטרומלי בקרצינומה הפטוקולרית האנושית.

מודל ספרואידי תלת מימדי לחקר האינטראקציה בין גידולים סרטניים בקרצינומה הפטוקולרית

יש צורך קריטי במודלים תלת מימדיים של סרטן הלוכדים הצלבה הטרו-תאית כדי לחקור גרורות סרטניות. המחקר שלנו מציג את הדור של הטרו-אפיתל סטרומלטי-תאי בסביבה נטולת פיגומים ופיגומים שניתן להשתמש בהם לחקר פלישה והתפלגות מרחבית תאית.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

חקור מודל תרבית שיתוף תלת-ממדי לחקר אינטראקציות בין תאי סרטן ריאה לפיברובלסטים קשורים לסרטן בתוך מטריצת קולגן. שיטה זו מאפשרת חקירה מדויקת יותר של פלישת תאים ואינטראקציות סטרומליות בסביבת גידול פיזיולוגית.

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

גלה סרטונים נוספים