Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

L’objectif global de l’injection dans la veine cardinale commune Evans Blue Dye et Fitzy Dextrin est d’observer l’intégrité de la membrane musculaire squelettique chez le poisson-zèbre vivant afin d’aider à caractériser les mécanismes pathogènes liés à divers sous-types de dystrophie musculaire. L’injection de colorant bleu d’Evan peut aider à découvrir les mécanismes biologiques qui contribuent à la pathologie de la maladie lors de la caractérisation de modèles animaux sur la dystrophie musculaire, elle peut également contribuer à notre compréhension des mécanismes thérapeutiques potentiels pour le traitement de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée et analysée à l’aide de poissons-zèbres vivants.

De plus, la co-injection de Fitz Dextrin démontre un contrôle de qualité pour une injection réussie, ce qui améliore la rigueur et la quantification. Les implications de cette technique sont liées à l’utilité dans la validation des modèles de poissons zèbres de maladies musculaires. Ils améliorent également la compréhension de la façon dont certaines mutations conduisent à des phénotypes de maladies musculaires, telles que la dystrophie musculaire, ce qui est essentiel pour trouver des traitements et des remèdes.

Pour préparer des plaques d’injection de gélose, faire bouillir deux à 3 % d’aros dans un milieu E trois et laisser refroidir légèrement la solution sur la paillasse. Versez environ 35 millilitres d’agros refroidis dans chaque plat de 100 millimètres. Placez ensuite une extrémité d’un moule d’injection préféré dans la solution avant de poser le reste du moule sur la solution agricole.

Laissez la solution agricole se solidifier à température ambiante ou à quatre degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Ensuite, à l’aide d’une spatule, séparez une extrémité du moule des agros solides et retirez lentement le reste du moule. Faites un stock de 1 % de Evan’s Blue Dye ou EBD dans une solution x ringer.

Préparez ensuite une solution mère de Fitzy Dextrin dans une solution x ringer et conservez-la à moins 20 degrés Celsius. Pour réaliser un mélange d’injection, diluez EBD à 0,1 % directement dans la solution mère de Fitz Dextrin, vortex soigneusement le mélange d’injection et gardez-le à l’abri de la lumière directe en utilisant du papier d’aluminium pour envelopper le tube avant l’injection. Préchauffez la plaque d’injection à température ambiante.

Disposez le micromanipulateur sur une plaque métallique et placez-vous à côté du microscope à injection. Allumez le contrôleur de micro-injection pneumatique. Ensuite, avec environ deux à quatre microlitres de mélange EBD, remplissez l’aiguille d’injection.

Ensuite, calibrez le volume d’injection avec environ cinq nanolitres de mélange EBD. Ensuite, utilisez une solution x ringer pour mouiller la plaque d’injection et retirer l’excès de solution des puits, prétraitez les larves avec 0,04 % de trica dilué dans une solution x ringer pour immobiliser complètement les larves avant d’injecter avec une pipette en verre. Placez les larves anesthésiées dans les puits des plaques d’injection de la tarière, en vous assurant que les larves sont complètement dans les puits couchés sur leurs côtés.

Retirez l’excès de solution trica pour minimiser le mouvement des larves dans le puits, mais laissez-en suffisamment pour éviter la déshydratation. Placez la plaque d’injection des larves sur une lunette de dissection et positionnez l’aiguille de la pipette d’injection contenant l’EBD. Mélangez sur une larve de poisson-zèbre près du cœur et à environ 45 degrés de l’axe antérieur et postérieur.

Insérez l’aiguille d’injection dans la veine cardinale commune ou CCV près de la partie antérieure du jaune où la veine tourne initialement dans le sens dorsal. Ensuite, injectez cinq nanolitres de mélange EBD et maintenez l’aiguille d’injection en position pendant cinq à huit secondes. Pour minimiser les fuites immédiates du mélange EBD, une bonne injection montrera un colorant dans les cavités cardiaques, et elle peut être répétée.

Si EB DMX n’est pas observé dans le cœur immédiatement après une injection réussie, l’embryon accumulera Fitz Dextrin dans le système vasculaire, comme indiqué ici. Une fois que le nombre souhaité de larves a été injecté, renvoyez les larves dans une solution x ringer sans trica dans des paraboles de 100 millimètres pour augmenter le taux de survie et maintenir la force du signal. Gardez la vaisselle enveloppée dans du papier d’aluminium.

Incuber les larves à 28,5 degrés Celsius pendant quatre à six heures pour assurer une absorption efficace de l’EBD. Pour visualiser l’EBD dans le muscle, utilisez 0,04 % de trica pour anesthésier les larves avant de les voir sous fluorescence rouge. L’EBD a été injecté dans le CVC des mutants homogènes de Sapia et des frères et sœurs de type sauvage lors d’injections de PF 3D qui ont rempli les cavités cardiaques comme indiqué ici, ont ensuite été analysés pour une perfusion réussie de la matrice en visualisant la dextrine dans le système vasculaire sous fluorescence verte.

Après une période d’incubation de quatre heures, l’absorption de l’EBD a été examinée au niveau du soacarien, comme le montre cette figure. Les frères et sœurs de type sauvage n’ont montré aucune fluorescence EBD dans les fibres musculaires visibles, tandis que les mutants homozygotes sapia ont montré une absorption EBD indiquant des dommages à la membrane musculaire. Une fois que l’injection du colorant bleu Evans est efficace dans la veine cardinale commune du poisson-zèbre, les larves peuvent être complétées en 30 à 60 minutes selon le nombre de larves injectées.

De plus, les résultats expérimentaux peuvent être obtenus en une seule journée pour garantir la compétence. Il est important de se rappeler de viser soigneusement la veine cardinale afin de produire des résultats cohérents et interprétables. Cela peut être difficile et prendra probablement de la pratique après cette procédure.

D’autres méthodes peuvent être mises en œuvre telles que des criblages chimiques et génétiques afin de déterminer les mécanismes moléculaires responsables des lésions membranaires associées aux dystrophies musculaires. Ces expériences peuvent aider à établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies musculaires après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les maladies musculaires pour explorer l’intégrité membranaire dans des modèles de dystrophie musculaire chez le poisson-zèbre.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension approfondie de la façon d’injecter le colorant bleu d’Evan dans la veine cardinale commune des larves de poisson-zèbre. Vous devez également comprendre comment identifier les fibres musculaires dont la membrane est endommagée en raison de la présence du colorant bleu d’Evan dans les fibres.