Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

Evans Blue Dye ve Fitzy Dextrin ortak kardinal ven enjeksiyonunun genel amacı, kas distrofisinin çeşitli alt tipleriyle ilgili hastalığa neden olan mekanizmaları karakterize etmeye yardımcı olmak için canlı zebra balıklarında iskelet kası zarı bütünlüğünü gözlemlemektir. Evan'ın mavi boya enjeksiyonu, kas distrofisi üzerine hayvan modellerini karakterize ederken hastalık patolojisine katkıda bulunan biyolojik mekanizmaların ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir, ayrıca hastalık tedavisi için potansiyel terapötik mekanizmaları anlamamıza da katkıda bulunabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı zebra balığı kullanılarak gerçekleştirilebilmesi ve analiz edilebilmesidir.

Ek olarak, Fitz Dextrin'in koenjeksiyonu, başarılı enjeksiyon için titizliği ve nicelleştirmeyi iyileştiren bir kalite kontrolü gösterir. Bu tekniğin sonuçları, zebra balığı kas hastalığı modellerinin doğrulanmasındaki fayda ile ilgilidir. Ayrıca, belirli mutasyonların, tedavileri ve tedavileri bulmak için kritik olan kas distrofisi gibi kas hastalığı fenotiplerine nasıl yol açtığının anlaşılmasını da geliştirirler.

Agar enjeksiyon plakalarını hazırlamak için, E üç besiortamında% iki ila 3 aros kaynatın ve çözeltinin tezgahta hafifçe soğumasını bekleyin. Her 100 milimetrelik tabağa yaklaşık 35 mililitre soğutulmuş agros dökün. Ardından, kalıbın geri kalanını agro solüsyonun üzerine koymadan önce tercih edilen bir enjeksiyon kalıbının bir ucunu solüsyona yerleştirin.

Tarımsal çözeltinin oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede yaklaşık 30 dakika katılaşmasına izin verin. Daha sonra kalıbın bir ucunu katı agroslardan ayırmak için bir spatula kullanın ve kalıbın geri kalanını yavaşça çıkarın. Bir x zil çözümünde Evan'ın Mavi Boyası veya EBD'sinden %1 stok yapın.

Daha sonra bir x zil çözeltisinde bir Fitzy Dextrin stok çözeltisi hazırlayın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bir enjeksiyon karışımı yapmak için, EBD'yi doğrudan% 0.1'e kadar seyreltin, Fitz Dextrin stok çözeltisinde, enjeksiyon karışımını iyice girdap haline getirin ve enjeksiyondan önce tüpü sarmak için alüminyum folyo kullanarak doğrudan ışıktan uzak tutun. Enjeksiyon plakasını oda sıcaklığına önceden ısıtın.

Mikro manipülatörü metal bir plaka üzerine yerleştirin ve enjeksiyon mikroskobunun yanında durun. Hava tahrikli mikro enjeksiyon kontrol cihazını açın. Daha sonra yaklaşık iki ila dört mikrolitre EBD karışımı ile enjeksiyon iğnesini geri doldurun.

Ardından, enjeksiyon hacmini yaklaşık beş nanolitre EBD karışımı ile kalibre edin. Daha sonra, enjeksiyon plakasını ıslatmak için bir x zil çözeltisi kullanın ve kuyulardan fazla çözeltiyi çıkarın, larvaları bir cam pipetle enjekte etmeden önce larvaları tamamen hareketsiz hale getirmek için bir x zil çözeltisinde seyreltilmiş% 0.04 trica ile ön işleme tabi tutun. Anestezi uygulanmış larvaları burgu enjeksiyon plakalarının kuyucuklarına yerleştirin ve larvaların tamamen yanlarında yatan kuyucuklarda olduğundan emin olun.

Kuyu içindeki larva hareketini en aza indirmek için fazla trica solüsyonunu çıkarın, ancak dehidrasyonu önlemek için yeterli bırakın. Larvaların enjeksiyon plakasını bir diseksiyon dürbünü üzerine yerleştirin ve EBD'yi içeren enjeksiyon pipet iğnesini konumlandırın. Kalbin yakınında ve ön arka eksenden yaklaşık 45 derece uzakta bir zebra balığı larvası üzerinde karıştırın.

Enjeksiyon iğnesini, damarın başlangıçta sırt yönünde döndüğü yumurta sarısının ön kısmına yakın ortak kardinal vene veya CCV'ye yerleştirin. Daha sonra, beş nanolitre EBD karışımı enjekte edin ve enjeksiyon iğnesini beş ila sekiz saniye boyunca yerinde tutun. EBD karışımının hemen sızmasını en aza indirmek için, iyi bir enjeksiyon kalp odacıklarında boya gösterecektir ve tekrarlanabilir.

Başarılı bir enjeksiyondan hemen sonra kalpte EB DMX görülmezse, embriyo burada gösterildiği gibi damar sisteminde Fitz Dekstrin biriktirecektir. İstenilen sayıda larva enjekte edildikten sonra, hayatta kalma oranını artırmak ve sinyal gücünü korumak için larvaları 100 milimetrelik tabaklarda trica içermeyen bir x ringer solüsyonuna geri koyun. Bulaşıkları alüminyum folyoya sarılı tutun.

Verimli EBD alımını sağlamak için larvaları 28.5 santigrat derecede dört ila altı saat kuluçkaya yatırın. Kastaki EBD'yi görselleştirmek için, larvaları kırmızı floresan altında görüntülemeden önce larvaları uyuşturmak için% 0.04 trica kullanın. EBD, burada gösterildiği gibi kalp odacıklarını dolduran 3D PF enjeksiyonlarında Sapia homojen mutantlarının ve vahşi tip kardeşlerin CCV'sine enjekte edildi, daha sonra yeşil floresan altında vaskülatürdeki fitzy dekstrini görselleştirerek başarılı kalıp perfüzyonu için analiz edildi.

Dört saatlik bir inkübasyon süresinden sonra, EBD alımı bu şekilde gösterildiği gibi so mite seviyesinde incelendi. Yabani tip kardeşler, herhangi bir görünür kas lifi içinde EBD floresansı göstermezken, sapia homozigot mutantlar, kas zarına zarar verdiğini gösteren EBD alımı gösterdi. Zebra balığının ortak kardinal damarına yetkin Evans mavi boya enjeksiyonu yapıldıktan sonra, larvalar enjekte edilen larva sayısına bağlı olarak 30 ila 60 dakika içinde tamamlanabilir.

Ek olarak, yeterliliği sağlamak için deneysel sonuçlar tek bir günde elde edilebilir. Tutarlı ve yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için kardinal damarı dikkatlice hedeflemeyi unutmamak önemlidir. Bu zor olabilir ve muhtemelen bu prosedürü takiben pratik gerektirecektir.

Kas distrofileri ile ilişkili membran hasarından sorumlu moleküler mekanizmaları belirlemek için kimyasal ve genetik taramalar gibi başka yöntemler de uygulanabilir. Bu deneyler, kas hastalığı geliştirildikten sonra için yeni terapötik stratejiler oluşturulmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, kas hastalığı araştırmaları alanındaki araştırmacıların, zebra balığı kas distrofisi modellerinde zar bütünlüğünü keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, Evan'ın mavi boyasını zebra balığı larvalarının ortak kardinal damarına nasıl enjekte edeceğinizi tam olarak anlamalısınız. Ayrıca, liflerin içinde Evan'ın mavi boyasının bulunması nedeniyle zar hasarı olan kas liflerini nasıl tanımlayacağınızı da anlamalısınız.