Name: Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Aprenda a isolar e analisar células mononucleares do sangue periférico infiltrantes em gliomas usando citometria de fluxo. Este método fornece dados quantitativos temporais sobre o número e estado de ativação de leucócitos no microambiente tumoral cerebral.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health / Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NIH / NINDS) concede R01-NS074387, R01-R21 NS057711 e-NS091555 para MGC; NIH / NINDS concede R01-NS061107, R01-NS076991, R01 e R21-NS082311-NS084275 a PRL; subvenções de corações felizes de Leah, da Universidade de Michigan Comprehensive Cancer Center atribuído a MGC e PRL; o Departamento de Neurocirurgia da Universidade de Michigan School of Medicine; do Instituto Michigan de Pesquisa Clínica e da Saúde, financiado pelo NIH concessão 2UL1-TR000433; a bolsa de formação Biologia da Universidade de Michigan Cancer financiado pelo NIH / NCI (National Cancer Institute) concessão T32-CA009676; da Universidade de Michigan Treinamento em clínica e básica Neuroscience suportado pelo NIH / NINDS conceder T32-NS007222; e da Universidade de Programa de Formação Médica Cientista Michigan financiado pelo NIH / NIGMS (Instituto Nacional de Medicina Ciências Gerais) conceder T32-GM007863. Os autores de umre grato pela liderança acadêmica e apoio recebido do Dr. Karin Muraszko e do Departamento de Neurocirurgia; a M. Dahlgren, D. tomford, e S. Napolitan para apoio administrativo soberba; a M. Dzaman para a assistência técnica excelente; e Phil F. Jenkins para apoio generoso para a compra de um Microscópio Eletrônico de Varredura Zeiss 3D. Reconhecemos também o laboratório Kuchroo na Harvard Medical School a partir do qual uma versão modificada da estratégia mediada por meios centrifugação de densidade para isolamento de células mononucleares do cérebro foi desenhado.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um método robusto e reprodutível para o isolamento e análise de citometria de fluxo de PBMC que se infiltraram no rato precoce microambiente do tumor cerebral. As suspensões de células de glioma são gerados a uma concentração especificada pelo experimentalista que são enxertados estereotaxicamente no corpo estriado do cérebro do rato. Os ratos são então sacrificados a pontos de tempo pré-determinados especificados pelo desenho experimental e os seus cérebros são colhidas e transformadas para isol...

Os gliomas são uma classe de cancros cerebrais gliais que derivam de células gliais transformadas dentro do sistema nervoso central (SNC). De todos os gliomas, Organização Mundial da Saúde (OMS) glioma grau IV ou glioblastoma (GBM), é o mais comum e letal 1. GBM é altamente refractário ao tratamento padrão-de-curso que consiste na ressecção do tumor na medida do possível, seguida por radiação, mais quimioterapia concomitante e adjuvante com temozolomida 2. Estes cancros mortais transportar um prognóstico sombrio de apenas 15-18 meses de sobrevivência a partir do momento do diagnóstico inicial com apenas 5% dos pacientes que sobrevivem a doença depois de 5 anos 3. A presença da barreira hematoencefálica (BHE), a falta de células apresentadoras de antigénios profissionais (APCs), e a existência de estruturas previamente não identificado linfáticos bona fide dentro do cérebro 4 conduziram à noção de GBM como imune privilegiada. No entanto, numerosos estudos agora shoW que estes cancros cerebrais, de facto geram o recrutamento de células imunitárias periféricas que são predominantemente de origem mielóide, que incluem monócitos, macrófagos e células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs) 5. GBM também influencia a atividade de microglia cérebro-residente para se tornar pró-tumorigenic 6,7. As células linfóides, tais como as células T CD8 + 8 e células CD56 + assassinas naturais 9 também estão presentes dentro do microambiente do tumor, mas em muito menor número, um facto provavelmente devido à função imunossupressora instigada por factores derivadas de glioma em macrófagos associados a tumores ( TAM) 10. Células T CD4 + também estão presentes no GBM, mas grande parte dessa população também expressa CD25 e FoxP3, fabricantes de imunossupressora T reguladoras (reg T) as células 11. O estado imunossupressora total do GBM culmina com a promoção da fuga imunológica e progressão tumoral 12. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; Uma melhor compreensão dos mecanismos de GBM imunossupressão é crítico para o desenvolvimento de estratégias eficazes imunoterapêuticas concebidas para estimular o sistema imunitário contra o tumor. Ao longo dos últimos 15 anos, nosso laboratório tem trabalhado para superar os mecanismos do cérebro immunosuppresson tumor, a fim de desenvolver novas immunotherapeutics eficazes anti-GBM 13-19. O culminar deste trabalho tem levado a um ensaio clínico destinado a avaliar um citotóxico combinada e terapêutica imuno-estimulante para os pacientes com diagnóstico recente de GBM (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT01811992). O nosso trabalho mais recente mostra que o GL26 de ratinho e rato de CNS-1 células GBM bloquear antitumoral vigilância imunitária das células NK através da produção de grandes quantidades de a lectina de ligação a β-galactósido galectina-1 (Gal-1) 20. Isto foi demonstrado através da supressão da expressão de Gal-1 em células de glioma de knockdown utilizando shRNA gene mediada. In vitro experiments mostraram que as células de glioma Gal-1 deficiente proliferaram normalmente na cultura, no entanto, sofreu rejeição rápida logo após o enxerto intracraniana em singï¿½ico C57BL / 6J ou RAG1 - / - ratos, estabelecendo assim a independência do T ou células B sobre esta forma de rejeição de tumor. Imunodepleção de células NK com anticorpos anti-asialo GM-1 anti soro ou anticorpos monoclonais NK1.1 conduziram à recuperação completa do crescimento de glioma Gal-1-deficiente intracraniana, estabelecendo o papel das células NK em Gal-1-deficiente rejeição glioma. Mostramos agora que imunodepleção de células mielóides Gr-1 + / CD11b + é suficiente para impedir que o glioma rejeição Gal-1-deficiente apesar da presença de células NK, revelando assim um papel auxiliar indispensável para células mielóides no favorecimento de Gal NK mediada lise tumoral -1 com deficiência (dados não publicados). Este resultado inesperado nos levou a desenvolver um protocolo abrangente para o isolamento e análise de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), queinfiltrar no microambiente do tumor cerebral logo após o enxerto intracraniana para que possamos melhor caracterizar os eventos de infiltração do sistema imunológico que predicado glioma rejeição gal-1-deficiente. O método é demonstrado aqui, usando células de glioma do rato GL26 que a proteína fluorescente mCitrine constitutivamente expresso, chamado GL26-Cit, que permitem a visualização de células tumorais direta por microscopia de fluorescência 21. Estas células são enxertados estereotacticamente no cérebro de singeneicos C57BL / 6J e são deixadas a crescer durante 24, 48, ou 72 horas antes do rato eutanásia. PBMC infiltrantes de glioma são então isolados e immunolabeled usando anti -CD45, -GR-1, -CD11b -NK1.1 e anticorpos de superfície da célula, juntamente com imunomarcação intracelular para a granzima B (GzmB). Esta combinação específica de anticorpos permite a identificação de Gr-1 + / + CD11b células mielóides infiltrantes tumorais e NK1.1 +, células NK, os tipos de células que temos been implicados na rejeição de tumor Gal-1-deficiente. O perfil imunológico infiltração de Gal-1-deficiente GL26-Cit glioma, referido aqui como GL26-Cit-gal1i, é então comparada com a de gliomas que expressam níveis normais de Gal-1 chamado GL26-Cit-NT que contêm uma não- segmentação controle hairpin shRNA. O protocolo começa com uma descrição de como a cultura de células de glioma GL26-Cit in vitro, que é seguido por uma explicação sobre como ortotopicamente enxertar essas células para o corpo estriado de singï¿½icos camundongos C57BL / 6J. Em seguida, prossegue para enumerar as etapas envolvidas no isolamento e imunomarcação de PBMCs infiltrantes de glioma para análise de citometria de fluxo. O protocolo termina com uma explicação de análise de dados padrão e representação gráfica. A demonstração revela que tanto a Gr-1 + / + CD11b células mielóides e células NK NK1.1 + preferencialmente se acumular dentro do microambiente do tumor cerebral Gal-1-deficiente dentro 48hr de implantação do tumor, um resultado que ajuda a explicar por que esses tumores rapidamente sofrer lise tumoral completa aproximadamente 1 semana enxerto pós-tumoral 20. O método é facilmente adaptável a um número de diferentes modelos experimentais in vivo em que os dados temporais de infiltração imune no cérebro é necessária. Uma única experimentalista podem executar o protocolo de colheita cérebro para análise citométrica de fluxo de PBMCs infiltrantes de glioma em cerca de 4-6 horas, dependendo do número de amostras a serem analisadas. O método pode também ser combinado com experiências destinadas para caracterizar o perfil de PBMCs em circulação em ratinhos portadores de tumor em comparação com aqueles que se infiltrar no cérebro, de forma a identificar os fenótipos imunossupressão especificamente induzidas pelo microambiente do tumor. Aplicação desta e de semelhantes métodos deverá facilitar uma melhor compreensão dos fatores envolvidos no tráfico de células imunes periféricas no microambiente do tumor cerebral.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modificação do Eagles Medium</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td>com 4,5g/L de D-glicose, L-glutamina, HEPES 25 mM e vermelho de fenol&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td>sem cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml Penicilina; 10.000 &mu; g/ml de estreptomicina&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>G418 sulfato&nbsp;</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>GN-04</td><td></td></tr><tr><td>Dicloridrato de Puromicina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>de Streptomyces alboniger</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase alternativa de tripsina não mamífera&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30030.01</td><td>em DPBS com EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitômetro de contraste de fase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>0,1 mm de profundidade</td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Injeção estéril de NaCl a 0,9%, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC: 0409-4888</td><td>Frascos de 10 ml</td></tr><tr><td>0,6 ml de polipropilenomi cônico</td><td>microtubos Genesee Scientific</td><td>22-272</td><td></td></tr><tr><td>Injeção de cloridrato de atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>NDC: 52483-6298</td><td>Solução de 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Injeção de cloridrato de cetamina</td><td>Fort Dodge</td><td>NDC: 0409-2051</td><td>Solução de 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Injeção de cloridrato de dexmedetomidina</td><td>Zoetis</td><td>NDC: 54771-2805</td><td>Solução de 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Injeção de cloridrato de xilazina</td><td>Lloyd</td><td>NDC: 61311-481</td><td>Solução de 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Injeção de carprofeno</td><td>Pfizer</td><td>NDC: 61106-8501</td><td>Solução de 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Injeção de cloridrato de buprenorfina</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>NDC: 12496-0757</td> Seringas de tuberculina <td>de 0,3 mg/ml ampuls</td></tr><tr><td>1 ml&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>26G x &frac12; (0,45 mm x 13 mm) agulhas de seringa&nbsp;</td><td>Cortadores</td><td>cirúrgicos BD 305111</td><td></td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Solução de iodo-providona</td><td>Aplicare</td><td>82-217</td><td>NDC: 52380-1905</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica de petrolato estéril&nbsp;</td><td>Dechra</td><td>NDC: 17033-211</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de álcool isopropílico 70%</td><td>Kendall</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Gaze estéril</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td>não tecido, 4" x 4", 4-ply&nbsp;</td></tr><tr><td>Microtubos cônicos de polipropileno de 1,7 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico de mouse</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada cirúrgica</td><td>Philips Burton</td><td>CS316W</td><td>Coolspot II Holofote</td></tr><tr><td>variável Pinça de dissecação curva</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5431</td><td></td></tr><tr><td>Afastadores Colibri</td>Furadeira elétrica de precisão <td>sem fio FST</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dremel&nbsp;</td>Modelo Stylus <td>1100-01</td><td>; Cortador de Gravação de Lítio-Íon de 7,2 Volts com Estação de Acoplamento</td></tr><tr><td></td> Seringa Microlitro <td>Dremel</td><td>105</td><td>1/32" ou 0,8 mm de diâmetro</td></tr><tr><td></td><td>Hamilton</td><td>75</td><td>Seringas Microlitro Hamilton Série 700; 5 &mu; l volume</td></tr><tr><td>Agulhas de seringa de microlitro</td><td>Hamilton</td><td>7762-06</td><td>33 G, pequeno cubo RN NDL, 1.5 in, estilo de ponta 3, 6/PK</td></tr><tr><td>Suturas de nylon monofilamento preto Ethilon 3-0&nbsp;</td>Barra de agitação magnética <td>Ethicon</td><td>1663</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>74950-296</td><td>7,9 mm de diâmetro x 50 mm de comprimento (5/16" de diâmetro x 2" de comprimento)</td></tr><tr><td>1 L garrafa de armazenamento de vidro com tampa de rosca</td><td>Corning</td><td>1395</td><td>Tipo 1, Classe A de vidro borossilicato</td></tr><tr><td>Heparina sódica&nbsp;</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400</td><td>Solução de 1.000 U/ml</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Cole Parmer Instruments Group</td><td>77200-60</td><td>Master Flex Easy Load II drive de console</td></tr><tr><td>carbogen comprimido (95% O2 / 5% CO2)</td><td>disponível do fornecedor local</td><td>N/A</td><td>A-type, cilindro grande&nbsp;</td></tr><tr><td>20 G x 1 &frac12; " Agulhas de cubo de alumínio sem corte</td><td>Kendall</td><td>8881202363</td><td>0.9 mm x 38.1 mm</td></tr><tr><td>Balde de gelo de poliuretano</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-45</td><td>Capacidade: 0.152 oz. (4.5L)</td></tr><tr><td>Colagenase (Tipo I-S)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1639</td><td>de Clostridium histolyticum&nbsp;</td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS002007</td><td>>2.000 unidades Kunitz por mg de peso seco</td></tr><tr><td>Pratos de pesagem hexagonal de poliestireno antiestático</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>20157-3</td><td>diâmetro interno superior 115 mm, diâmetro interno da base 85 mm, volume de 203 ml</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear de aço inoxidável de um único gume&nbsp;</td><td>Garvey</td><td>40475</td><td></td></tr><tr><td>Bone rongeurs</td><td>FST</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação grande</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação pequena</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de extremidade romba</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13250</td><td></td></tr><tr><td>Moedor de tecidos Dounce de vidro de 7 ml</td><td>Kontes</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Centrifugação de Densidade Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de 10 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td>uso único; estéril</td></tr><tr><td>70 &mu; M Filtros de Células de Malha de Nylon Estéril&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-conjugado rato anti-rato CD45 (clone: 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103128</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugado ratinho anti-mouse NK1.1 (clone: PK136)</td><td>eBiosciences&nbsp;</td><td>17-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Rato conjugado com PE anti-camundongo Gr-1 (clone: RB6-8C5)</td> <td>BD Pharmigen</td><td>553128</td><td></td></tr><tr><td>PerCP / Cy5.5 - rato conjugado anti-camundongo CD11b (clone: M1 / 70)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-conjugado rato IgG2b, &kappa; (clone: RTK4530) controle de isotipo&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400628</td><td></td></tr><tr><td>camundongo conjugado com APC IgG2a, &kappa; (clone: eBM2a) controle de isotipo&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-4724</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b de rato conjugado com PE, &kappa; (clone: eB149/10H5) controle de isotipo&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo conjugado com PerCP/Cy5.5 IgG2b, &kappa; (clone: RTK4530) controle de isotipo</td><td>Biolegend</td><td>400632</td><td></td></tr><tr><td>camundongo conjugado com azul do Pacífico anti-rato granzima B (Clone: GB11)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>515403</td><td></td></tr><tr><td>camundongo conjugado com azul do Pacífico IgG1, &kappa; (Clone: MOPC-21) controle de isotipo&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400151</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103</td><td>fundo cônico&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td> com <td>fundo cônico</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm tubos FACS de polipropileno de fundo redondo&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14-956-1B</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Special Order Research Produto de citômetro de fluxo/classificador de células</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>650033</tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica Classe II</td><td>The Baker Company</td><td>SG603</td><td>modelo: SterilGARD III Advance</td></tr></tbody></table>

isolamento e análise de citometria de fluxo infiltrantes glioma células mononucleares do sangue periférico

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Nosso laboratório tem demonstrado recentemente que natural killer (NK) são capazes de erradicar GL26 rato ortotopicamente implantado e rato CNS-1 gliomas malignos logo após o enxerto intracraniana se as células cancerosas se tornam deficientes em sua expressão da galectina lectina β-galactoside de ligação -1 (Gal-1). Um trabalho mais recente mostra agora que uma população de células mielóides + / CD11b + GR-1 é essencial para este efeito. Para melhor compreender os mecanismos pelos quais NK e células mielóides cooperam para conferir rejeição tumoral Gal-1 deficiente em temos desenvolvido um protocolo detalhado para o isolamento e análise de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma (PBMC). O método é demonstrado aqui pela comparação PBMC infiltração no microambiente tumoral de Gal-1 que expressam GL26 gliomas com aqueles preparados Gal-1-deficiente através shRNA knockdown. O protocolo começa com uma descrição de como a cultura e preparar GL26 cells para inoculação no singï¿½ico C57BL / 6J cérebro do rato. Em seguida, explica as etapas envolvidas no isolamento e análise de citometria de fluxo de PBMCs infiltrantes glioma do microambiente do tumor cerebral precoce. O método é adaptável a um número de modelos experimentais in vivo em que os dados temporais de infiltração imune no cérebro é necessária. O método é sensível e altamente reprodutível, como PBMCs infiltrantes glioma pode ser isolado a partir de tumores intracranianos, logo que 24 hr pós-enxerto de tumor com contagens de células semelhantes observadas em tumores de pontos de tempo ao longo combinado experiências independentes. Uma única experimentalista pode executar o método de colheita cérebro para análise citométrica de fluxo de PBMCs infiltrantes de glioma em cerca de 4-6 horas, dependendo do número de amostras a serem analisadas. Modelos de glioma alternativos e / ou de detecção de anticorpos específicos de células também podem ser utilizados à discrição dos experimentalistas para avaliar a infiltração de vários outros Immune tipos de células de interesse, sem a necessidade de alterações no procedimento geral.

A estratégia de gating seguinte é usada para uma experiência típica: FSC vs. SSC-A-A → SSC-H vs. SSC-W → FSC-H vs. FSC-W → CD45 vs. contagem → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. contagem. Gates, colocado em Gr-1 + / + CD11b células mielóides e células NK NK1.1 +, em seguida, são estratificados com base na expressão GzmB (Figura 5A). Backgating células identificadas como células NK NK1.1 + e Gr-1 + / + CD11b células mielóides em nossas experiência...

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar e quantificar o número de células mononucleares do sangue periférico que se infiltraram no microambiente do tumor cerebral inicial. Este método pode ajudar a abordar questões-chave no campo da imunologia de tumores cerebrais, identificando fatores importantes para o tráfego de células imunes periféricas para o microambiente do tumor cerebral. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece dados quantitativos dependentes do tempo sobre o número e o status de ativação dos leucócitos que entraram nesse SNC.Depois de colocar um camundongo anestesiado em uma estrutura estereotáxica, faça uma incisão na linha média de dois centímetros sobre o crânio, do osso frontal ao osso occipital, usando uma lâmina de bisturi. Em seguida, retraia a pele na incisão usando afastadores Collibra. Depois disso, abaixe uma seringa de microlitro equipada com uma agulha de calibre 33 diretamente acima do bma.Ajuste a posição da agulha para alcançar o local alvo para implantação do tumor. Em seguida, use uma seringa de tuberculina de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26 para marcar este local, escoriando suavemente o periósteo depois disso

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para análises de citometria de fluxo.

Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do corante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para a identificação e separação de diferentes sub-populações de células em glioblastoma humano com base na frequência de divisão celular.

Identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

O vídeo demonstra o isolamento de células mononucleares do sangue periférico que se infiltram em tumores a partir de um cérebro de camundongo usando dissociação mecânica e digestão enzimática. Isso é seguido pela centrifugação do gradiente de densidade para coletar as células imunes para análise posterior.

Isolando células imunes infiltrantes de tumor de um cérebro murino

A inflamação desempenha um papel central na patogênese do AVC isquêmico. Evidências crescentes sugerem que ele atua como uma faca de dois gumes que exacerba a lesão cerebral precoce, mas também contribui para o reparo posterior. Este protocolo descreve o isolamento de células imunes do cérebro isquêmico e sua subsequente fenotipagem citométrica de fluxo.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Este protocolo fornece uma análise das subpopulações de macrófagos no sistema nervoso central do mouse adulto por citometria de fluxo e é útil para o estudo de marcadores múltiplos expressos por essas células.

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Este protocolo foi desenvolvido para identificar quantitativamente os componentes do microambiente tumoral em resecções do paciente com glioblastoma usando imuno-histoquímica cromogênica e ImageJ.

Imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente

Um protocolo de triagem eficiente é apresentado para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação de Ralevic em células-tronco glioblastoma (GSCs). O ensaio baseia-se em um repórter de diferenciação de células-tronco no qual a expressão da GFP reforçada (eGFP) é conduzida pelo promotor GFAP humano.

Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma

Apresentamos um método para replicar o microambiente tumoral de glioma na frente invasiva que incorpora fluxo de fluido intersticial. Este modelo é um hidrogel de hialuronano-colágeno I em um inserto de cultura de tecidos onde uma cabeça de pressão de fluido pode ser aplicada. A invasão pode ser quantificada e as células podem ser isoladas ou lisadas.

Um modelo fotopolimerizável de ácido hialurônico-colágeno do microambiente de glioma invasivo com fluxo intersticial

Identificar micróglia (MG) e macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) na medula espinhal lesada é difícil. Neste protocolo, a citometria de fluxo (FCM) foi usada para identificar MG semelhante a M1, MG semelhante a M2, Mø semelhante a M1 e Mø semelhante a M2, respectivamente. Essa tecnologia também pode ser aplicada a outras doenças do sistema nervoso central para entender o papel da MG e da Mø.

Identificação de micróglia e macrófagos infiltrantes periféricos na medula espinhal lesada usando citometria de fluxo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a função das células imunes após AVC isquêmico usando análise de citometria de fluxo em um modelo de mini-AVC. Este método permite o exame detalhado das interações neuroimunes e pode ser adaptado para estudar outras doenças neurodegenerativas, aprimorando nossa compreensão das respostas imunes na patologia do AVC.

Isolamento e Avaliação por Citometria de Fluxo de Interações Neuroimunes em Modelo Murino Mini-AVC

Aprenda a isolar e analisar células mononucleares do sangue periférico infiltrantes em gliomas usando citometria de fluxo. Este método fornece dados quantitativos temporais sobre o número e estado de ativação de leucócitos no microambiente tumoral cerebral.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

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