隔离和脂肪干细胞分化的猪从皮下脂肪组织

该程序的总体目标是从猪皮下白色脂肪组织中分离脂肪来源的干细胞，以评估它们分化为间充质脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的能力。这种方法可以帮助回答肥胖研究的关键问题。它是揭示调节脂肪组织发育所涉及的分子机制的好工具。

该技术的主要优点是可以收获大量基质细胞，从而可以深入分析脂肪细胞分化和生物学。该技术对干细胞治疗研究的影响在于猪脂肪来源的干细胞表现出转分化为多个细胞谱系的多能性。首先将仔猪俯卧放在干净的手术台上。

脖子到尾巴的中线剃掉所有毛发，然后用 7.5% 聚维酮碘擦洗背侧皮肤 3 次。第三次磨砂后，让碘在皮肤表面停留约 10 分钟。然后，用 70% 乙醇喷洒皮肤。

并使用浸有乙醇的纱布垫沿一个方向擦拭皮肤以去除消毒剂，直到没有观察到明显的颜色。接下来，从颈部区域向下切开到腿部。然后，用镊子托住脂肪和皮肤，用手术刀将猪皮下脂肪组织的背脂肪层和相邻的皮肤层与肌肉分开。

立即将皮肤和脂肪组织浸入消毒的 200 毫升烧杯中，该烧杯中含有无血清、37 摄氏度的 DMEM，并用 70% 乙醇喷洒烧杯外部。然后，将烧杯放入层流式细胞培养罩中，并在烧杯旁边放置一个 40 x 30 cm 的无菌三层铝箔盖。将组织（皮肤朝下）转移到铝箔上。

并使用镊子和剪刀修剪脂肪组织中剩余的肌肉组织。将脂肪切成 7 x 7 厘米的正方形，然后将脂肪块转移到一个新的消毒 200 毫升烧杯中，该烧杯中装有无血清的 37 摄氏度 DMEM。现在，将一个配备碳钢切片机刀片的定制切片架放在盖箔上，然后将其中一块脂肪块放在切片机上，脂肪层朝下。

将脂肪切成约 1 毫米厚的小块，尽可能靠近皮肤，但不切开皮肤。然后，用剪刀将脂肪组织碎片尽可能细地切碎，并将这些碎片加入含有补充胶原酶的过滤消化培养基的 250 毫升锥形瓶中。在 37 °C 的轨道摇床中以 45 RPM 的离心力旋转培养瓶 90 分钟。

当消化培养基变成浆液，没有明显的组织团块时，用等体积的含有 10% FBS 的 DMEM F-12 的培养基停止消化。为了收集猪脂肪来源的干细胞，将消化的脂肪组织悬液通过单层雪纺过滤到消毒的 250 毫升血清瓶中，使用镊子压下雪纺的中间，以引导和协助消化物的通过。用镊子排空并扭动戚风以完成通道，并将培养基分配到四个 50 毫升锥形离心管中。

通过离心收集基质血管细胞。然后，在不干扰沉淀的情况下去除上清液，以去除含有成熟脂肪细胞的大部分顶部脂肪层。接下来，用移液和轻轻摇动将沉淀重新悬浮在 10 毫升 DMEM 中。

再次旋转细胞并将沉淀重悬于 10 ml ACK 裂解缓冲液中。在室温下 7 分钟后，向每根试管中加入 10 mL DMEM 以终止红细胞裂解，轻轻摇动试管以混合。然后，再次旋转细胞。

用 10 ml DMEM 再洗涤细胞两次，然后通过 100 μm 过滤器将上清液汇集到单个 50 mL 锥形管中。轻轻吸取细胞悬液数次，使细胞均匀分布，并通过台盼蓝排除对细胞进行计数。最后，将猪脂肪来源的干细胞以 6 乘以 10 到 4 平方厘米的密度接种到细胞培养基中适当大小的培养容器中。

并在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育细胞，以促进单层的形成。基质血管组分来源的猪脂肪来源干细胞的形态与小鼠或人脂肪来源的干细胞相似，在接种后 24 小时观察到扩增的玻璃纤维样形态。猪脂肪来源的干细胞在 72 小时内汇合，此时它们已准备好进行脂肪细胞或其他间充质型分化。

这些细胞在化学诱导后也表现出很强的成脂潜力，分化 9 天后可以观察到成熟的脂肪细胞，超过 90% 的猪脂肪来源干细胞表现出成脂分化。间充质干细胞表面标志物包括 CD 29、CD 44、CD 90 和 MHC 1，在猪脂肪来源的干细胞上高度表达，而 CD 4a、CD 31、CD 45 和 MHC II 几乎无法检测到，表明这些猪脂肪来源的干细胞表现出间充质型特征，没有明显的内皮或造血干细胞污染。此外，通过使用特定的组织染色染料，分化的猪脂肪来源的干细胞可以被鉴定为脂肪细胞、骨细胞或软骨细胞，表明这些基质血管部分衍生的细胞保留了间充质型祖细胞的典型多能性。

在执行此程序时，重要的是要记住拥有良好的细胞培养无菌技术，并尽快执行所有步骤。最大限度地提高细胞的活力。一旦掌握，如果技术执行得当，可以在 6 小时内从 2 到 3 头猪收获细胞。

这种标准技术为糖尿病领域的肥胖研究人员探索分子开关铺平了道路，例如控制脂肪细胞分化的转录因子。看完这个视频，你应该对如何分离猪脂肪来源的干细胞有一个很好的了解，并评估这些细胞分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的多能力。