Name: Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Découvrez l'imagerie intravitale pour visualiser l'amorçage des neutrophiles chez la souris IL-1ß-DsRed. Cette méthode combine marquage fluorescent et imagerie in vivo pour étudier les réponses immunitaires dans les maladies rares.

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Toutes les expériences sur les animaux sont effectuées en conformité avec les instituts nationaux de directives de santé et approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle de l&#39;Université de Toledo. 1. phénotypage de pIL1-DsRed Souris NOTE: Offspring sont générés par l&#39;élevage des souris pIL1-DsRed hétérozygotes souris de type sauvage (WT) C57BL6. Trois à quatre semaines vieux chiots sont considérés comme prêts pour le phénotypage. Saignements Submandibulaire de souris suit un protocole établi avec des modifications mineures 23. <ol><li> Isolement des globules blancs du sang total de Pups souris <ol><li> Ajouter 20 ul d&#39;héparine à chaque tube de 1,5 ml. </li><li> Acquérir un chiot de la cage. Enregistrez l&#39;étiquette d&#39;identification du chiot. Il est pas nécessaire pour anesthésier les chiots avant le prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire. </li><li> Tenez chiot par le cou scruff et percer la veine submandibulaire dans ee abajoue en utilisant un 5 mm lancette. Appliquer une force adéquate pour créer une petite perforation, de sorte que des gouttes de sang exsudent du point de pénétration. Utilisez une nouvelle aiguille pour chaque chiot. </li><li> Collecter 3 - 5 gouttes de sang par chiot dans un tube à centrifuger contenant de l&#39;héparine. Nettoyer le site de ponction et appliquer une pression pour faciliter l&#39;hémostase. </li><li> Mettez chiot dans une nouvelle cage et observer pendant 30 minutes avant de retourner la cage à l&#39;animalerie. </li><li> Recueillir le sang des souris adultes d&#39;un phénotype connu en tant que témoins positifs et négatifs. </li><li> Ajouter 500 pi de tampon de lyse des globules rouges dans chaque tube, les tubes à vortex et laisser incuber pendant 5 à 10 min sur la glace. </li><li> ajouter lentement 400 - 500 ul de sérum de fœtus bovin (FBS), sous les suspensions de cellules dans chaque tube. Une interface claire peut être observée entre la suspension de cellules de couche supérieure et la couche inférieure de FBS. </li><li> tubes Cap et des échantillons de centrifugation à 1500 × g pendant 5 min. </li><li> Répétez les étapes 1.1.7 - 1.1.9 à la fourrureTher éliminer les globules rouges. Ne pas répéter si la lyse est suffisante pour la première fois. Le culot doit être difficile de discerner après centrifugation. </li></ol></li><li> Lipopolysaccharide (LPS) Stimulation et Culture <ol><li> Resuspendre les cellules dans 200 pi de complète Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un tube de cytométrie en flux. </li><li> Faire LPS solution de travail en mélangeant 10 pl de LPS solution mère (1 mg / ml) avec 990 ul de milieu RPMI 1640 complet. </li><li> Ajouter 20 pi de 10 pg / ml de LPS solution de travail à 200 ul de suspension cellulaire. </li><li> Des tubes à bouchon lâche et incuber les échantillons pendant 4 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Analyse par cytométrie en flux <ol><li> Ouvrez le programme d&#39;acquisition de données pour la cytométrie de flux. Mettre en place modèle d&#39;acquisition avant d&#39;échantillonner acquisition. </li><li> Cliquez sur l&#39;outil Dot-Plot dans la palette d&#39;outils. Tracez une foscatter rward (FSC) vs diffusion latérale (SSC) parcelle. Définissez les paramètres tension FSC et SSC à échelle linéaire. </li><li> Sélectionnez les seuils les plus bas du FSC et SSC autorisés par le cytomètre. Appliquer les seuils de 200 et 50 pour le FSC et SSC, respectivement. </li><li> Dans le FSC vs SSC terrain, dessiner une grille G1 qui comprend les monocytes, les granulocytes et les cellules dendritiques, et exclut les débris, les cellules et les lymphocytes du sang rouge. </li><li> Cliquez sur l&#39;outil Histogramme dans la palette d&#39;outils. Dessinez un FL2 (canal de fluorescence rouge) histogramme. Utilisez un échantillon de contrôle négatif pour définir la ligne de base des signaux FL2 et un échantillon de contrôle positif pour dessiner une porte d&#39;inclure tous les événements positifs DsRed. </li><li> Sur le panneau de commande fluidiques du cytomètre, régler le mode fluide à &quot;RUN&quot; et le débit à &quot;HI&quot; (environ 60 pi / min). Acquérir 10.000 événements pour chaque échantillon. </li><li> Déterminer le phénotype chiot en mesurant le pourcentage de cellules positives DsRed de la grille G1. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Induction de l&#39;inflammation de la peau dans pIL1-DsRed Souris <ol><li> Anesthetize souris par voie intrapéritonéale (ip) injection d&#39;un cocktail anesthésique contenant 100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine, et 1 mg / kg d&#39;acépromazine. souris anesthésiés de façon adéquate ne montrent pas la patte arrière retrait pincement de l&#39;orteil. </li><li> Appliquer la crème d&#39;épilation à la surface dorsale des deux oreilles de la souris. Attendre 30 secondes à 1 minute. Essuyez la surface de l&#39;oreille avec du coton mouillé à l&#39;eau et laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Mesurer l&#39;épaisseur de l&#39;oreille en utilisant un micromètre et remplacer la souris dans une cage séparée. Observer jusqu&#39;à la récupération de l&#39;anesthésie (~ 15-30 min). Pour résoudre l&#39;inflammation cutanée induite par le produit d&#39;épilation, laisser la souris se reposer pendant 3 jours avant l&#39;expérimentation plus poussée est effectuée. </li><li> Préparer 1,25% (p / v) OX en dissolvant 16,7 mg de OX dans 1 ml d&#39;acétone et on mélange 750 ul d&#39;une solution / acétone OX avec 250 ul d&#39;huile d&#39;olive. Préparer la solution de véhicule en mélangeant 750 ul d&#39;acétone avec 250 &amp;# 181; l d&#39;huile d&#39;olive. </li><li> Re-anesthésier la souris par injection ip de cocktail anesthésique (2.1). Mesurer l&#39;épaisseur de l&#39;oreille comme avant. </li><li> Appliquer 12,5 pi de 1,25% OX sur chaque côté de l&#39;oreille droite. Appliquer 12,5 pi de véhicule d&#39;huile solution acétone / olive sur chaque côté de l&#39;oreille gauche. </li><li> Gardez la souris séparée de la cage camarades jusqu&#39;à guérison complète pour empêcher l&#39;insulte à ses oreilles par d&#39;autres souris, puis remplacer la souris dans sa cage d&#39;origine et retourner au centre d&#39;hébergement des animaux. NOTE: L&#39;épilation peut entraîner une inflammation mineure de la peau suite par le changement de l&#39;épaisseur de l&#39;oreille. Cette inflammation mineure sera résolu 3 jours plus tard confirmé par l&#39;épaisseur de l&#39;oreille normale. Après application topique pendant 24 heures, les oreilles OX traités montrent significative (p &lt;0,01) gonflement solution du véhicule par rapport oreilles seuls traités. </li></ol> 3. Étiquetage des neutrophiles dans pIL1-DsRed Souris REMARQUE: marquage in vivo des neutrophiles par une faible dose de fluorescence-conjugué spécifique neutrophiles mAb suit un protocole récemment mis au point 19. Les injections rétro-orbitaire sont réalisées selon un protocole établi avec quelques modifications 24. <ol><li> Préparer l&#39;anti-Ly6G solution de travail en diluant mAb 10 pi de 0,5 mg / ml d&#39;Alexa Fluor 647 conjugué anticorps monoclonal anti Ly6G (clone 1A8) dans 90 ul de tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Transférer 100 ul de solution de travail anti-Ly6G mAb (50 pg / ml) dans une seringue d&#39;insuline U-100 avec une aiguille de calibre 28. </li><li> Anesthetize un adulte pIL1-DsRed souris par injection ip du cocktail anesthésiant décrit précédemment (2.1). Placez l&#39;abdomen de la souris anesthésiée sur une planche de travail propre. </li><li> Appliquer une pression vers le bas douce à la partie dorsale de la peau et ventrale à un oeil de la souris pour faire saillie partiellement le globe oculaire de la prise. </li><li> Placez délicatement l&#39;aiguille, biseau vers le bas, à un angle d&#39;environ 30 ° au niveau du canthus médial dans le rétro-orbitalsinus. NOTE: L&#39;opérateur peut sentir la pression, la pénétration et la résistance soulagée une fois que les inserts des aiguilles dans le sinus. </li><li> Lentement et doucement injecter 100 pi d&#39;anti-Ly6G mAb solution (5 ug mAb / souris / injection) dans la souris de travail. Retirer rapidement l&#39;aiguille. Une petite quantité de sang suggère une injection réussie. </li><li> Appliquer immédiatement 1,25% OX et une solution de véhicule sur le droit et les oreilles gauche de la souris. </li><li> Au bout de 8 h, administrer 100 ul d&#39;anticorps anti-Ly6G solution fraîchement préparée de mAb de travail (5 pg de mAb / souris / injection) par injection rétro-orbital dans la même souris. </li><li> Pour visualiser les vaisseaux sanguins, immédiatement avant l&#39;imagerie, administrer 100 ul de 30 mg / ml d&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dextran (150 kDa) par injection de rétro-orbital. </li></ol> 4. Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage dans PIL-1-DsRed Souris <ol><li> Anesthetize souris avec injection ip de cocktail anesthésique (2.1).0; Appliquer une pommade vétérinaire aux yeux de souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie pour l&#39;imagerie. <ol><li> Préparer 1 ml d&#39;une demi-dose du cocktail anesthésiant en diluant 500 pi d&#39;un cocktail anesthésiant original avec un volume égal de PBS. </li><li> Transfert demi-dose de cocktail anesthésique à 1 ml seringue avec une aiguille de calibre 27 papillon. </li><li> Insérez l&#39;aiguille de papillon dans l&#39;abdomen de la souris par voie intrapéritonéale et fixer l&#39;aile de papillon à l&#39;abdomen en collant. </li></ol></li><li> Placer une lamelle couvre-objet en verre au centre de la scène d&#39;image. Collez les bords de la lamelle pour le maintenir en place. </li><li> Placer une goutte de PBS sur la surface ventrale de l&#39;oreille de souris, ainsi que sur la lamelle. </li><li> Position anesthésié la souris avec son oreille sur la lamelle. Monter la pointe de l&#39;oreille, face dorsale vers le bas, en prenant en sandwich l&#39;oreille entre la lamelle et une lame de verre, également maintenu en place par du ruban adhésif. </li><li> Tourner sur un multi-laser fluorescence microscope confocal et tous les e connexesquipment. Éteignez les lumières des chambres pour minimiser l&#39;exposition de la lumière ambiante. </li><li> Ouvrez le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image. Sélectionnez les canaux laser pour la détection de colorants fluorescents dans le menu Liste Dye. </li><li> Réglez la mise au point sur ​​la peau de l&#39; oreille enflammée par l&#39; observation des signaux verts des vaisseaux sanguins et des signaux rouges des DsRed + cellules à travers l&#39; oculaire. </li><li> Effectuez un balayage rapide avec une vitesse de balayage de 2 ms / pixel et résolution de 512 × 512 pixels. Sélectionnez un pseudocolor pour chaque canal dans le menu Live View. Réglez le bouton de mise au point pour définir la fin et commencer à l&#39;emplacement de la numérisation. </li><li> Effectuer des analyses lentes avec une vitesse de balayage de 4-8 microsecondes / pixel et résolution de 800 × 800 ou 1.024 × 1.024 pixels. Régler la haute tension, le gain et le décalage sur chaque canal individuel afin de maximiser l&#39;intensité des signaux tout en évitant la saturation (pixels rouges). Il devrait y avoir seulement quelques pixels rouges dans chaque canal. </li><li> Créer des séries d&#39;images en trois dimensions par balayage ee oreille peau commençant superficiellement dans la couche cornée et en progressant vers le bas avec x, y, z des volumes de 317 um x 317 um x 30 um (objectif 40X), 635 pm x 635 pm x 30 pm (objectif 20X), soit 1,270 um x 1270 um x 50 um (objectif 10X) à 2 pm z-étapes. NOTE: Le stratum corneum est la couche la plus externe de l&#39;épiderme et peut être facilement localisé en fonction de son signal d&#39;autofluorescence forte. </li><li> Dans des expériences d&#39;imagerie time-lapse, d&#39;enregistrer des images en trois dimensions toutes les 2 ou 4 min pour un maximum de 8 heures. </li><li> Par intermittence, comme la souris commence à se remettre de l&#39;anesthésie, a noté basée sur l&#39;observation des moustaches de secousses, administrer 5 - 10 pi de l&#39;anesthésie demi-dose cocktail à travers l&#39;aiguille de papillon. NOTE: Soyez prudent de la dose d&#39;anesthésie - surdosage peut entraîner la mort de la souris. Alternativement, l&#39;anesthésie par inhalation dans un bocal pourrait être appliqué à la souris pour l&#39;anesthésie de courte durée et uncône de nez pourrait être utilisé pour l&#39;imagerie à long terme. </li><li> Retirez la souris anesthésiée de la scène lorsque l&#39;imagerie est terminée. Détachez bande et retirer l&#39;aiguille de papillon de l&#39;abdomen de la souris. Retour de la souris dans une cage séparée dans l&#39;installation de logement des animaux. NOTE: Pour l&#39;imagerie à court terme (&lt;1 h), les souris récupérer pleinement de l&#39;anesthésie rapidement 1-3 h. Pour l&#39;imagerie à long terme (~ 8 h), les souris récupèrent lentement, avec une période de récupération typique de 12-16 h. Ainsi, l&#39;administration de l&#39;eau par voie orale est recommandée au moins plusieurs fois au cours de la période de récupération pour prévenir la déshydratation sévère. </li><li> Processus ensembles de données d&#39;imagerie, le suivi des cellules individuelles, génèrent des voies de migration, et de calculer la directivité et la vitesse de migration des cellules en utilisant l&#39; image logiciel d&#39;analyse 25. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier.

Le but de cette étude est de développer une technologie pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage chez les animaux vivants, qui n&#39;a pas encore été remplies par les techniques actuellement disponibles. Pour atteindre cet objectif, trois méthodes établies sont exécutées: 1) l&#39; induction d&#39; une inflammation cutanée chez des souris IL-1 ß reporter DsRed promoteur-driven comme une mesure de l&#39; amorçage, 2) marquage in vivo des neutrophiles avec de faibles doses de fluorescence conjugué an...

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants et de courte durée en circulation. Ils sont rapidement recrutés pour les sites d&#39;infection ou d&#39;une blessure, où ils servent phagocytes comme professionnels par la libération d&#39;oxygène et d&#39; azote intermédiaires réactifs ainsi que des granulés contenant des peptides et des protéases 1 antimicrobiens. Au cours de leur recrutement, les neutrophiles sont &quot;apprêtées&quot; par divers agents , y compris les produits microbiens, chemoattractants et cytokines inflammatoires, entraînant nettement amélioré la fonctionnalité phagocytaire arrivée à un site d&#39;inflammation 2. Les mécanismes d&#39;amorçage de neutrophiles ont été étudiés in vitro 3,4; Toutefois, le suivi dynamique du processus in vivo n&#39;a pas été possible à ce jour. Récemment, l&#39;imagerie intravitale est devenue une technique importante pour la visualisation et la quantification de la dynamique cellulaire des processus biologiques dans les organismes vivants. Intraviimagerie tal peut être réalisée par excitation au microscope un photon classique (par exemple, confocale) ou des approches microscopie multiphotonique 5. Au fil du temps, des améliorations substantielles ont été réalisées dans cette technique permettant une meilleure résolution d&#39;image, l&#39; amélioration de la profondeur d&#39;imagerie, une diminution de photovieillissement de tissu, et le renforcement de 6,7 de stabilisation d&#39;image. Compte tenu de sa capacité unique de permettre une visualisation dynamique de la migration cellulaire et l&#39; interaction au fil du temps, la microscopie intravitale a été largement appliquée à divers domaines d&#39;études en immunologie 8. imagerie intravitale permet immunologistes de mieux comprendre et contextualiser les réponses immunitaires à la fois au niveau cellulaire et moléculaire dans la vie des modèles animaux. Des progrès récents dans transgéniques ainsi que des souris knock-in rapporteuses ont fourni des outils utiles pour la surveillance des comportements dynamiques des neutrophiles chez les animaux vivants. Lysozyme M promoteur-driven améliorée protéine fluorescente verte knock-inles souris ont été largement utilisés pour caractériser la motilité des neutrophiles, des monocytes et des macrophages au cours de divers processus inflammatoires comprenant une extravasation, une infection bactérienne, une inflammation stérile et 9-15. En outre, des souris transgéniques exprimant une résonance de fluorescence cytoplasmique de transfert d&#39;énergie biocapteur ont été utilisés dans l&#39; étude de l&#39;activité des neutrophiles mitogene kinase extracellulaire régulée et la protéine kinase A l&#39; intérieur de l&#39; intestin enflammées 16. Un modèle de souris avec une spécificité élevée pour l&#39; expression de la fluorescence dans des neutrophiles est la souris knock-in Catchup, qui produit la recombinase Cre, ainsi que la tdTomato protéine fluorescente, qui est lui - même couplé à l&#39; expression de l&#39; antigène des lymphocytes 6G (Ly6G) 17. Visualisation des neutrophiles Ly6G déficientes par ce modèle a montré que ces cellules exercent une fonctionnalité normale dans une variété de contextes in vivo inflammatoires stériles ou infectieuses. Des souris transgéniques exprimant la DsRed fluorescente protein gène sous le contrôle de la souris interleuikin-1β (IL-1β), le promoteur (pIL1-DsRed) ont été utilisés pour visualiser les comportements motiles de cellules produisant de l&#39;IL-1 ß - censé inclure les neutrophiles, les monocytes inflammatoires et des macrophages activés - émergents dans la peau enflammée 18. In vivo l&#39; étiquetage peut servir comme une approche alternative pour tracer les comportements cellulaires et moléculaires de neutrophiles dans les tissus enflammés. Après injection intraveineuse de faibles doses de fluorescence anticorps anti Gr-1-anticorps monoclonal (mAb), la cascade de recrutement de Gr-1 + neutrophiles a été visualisées dans des lésions de la peau de souris infectées par Staphylococcus aureus 19. L&#39; administration in vivo des conjugués contenant de la streptavidine conjugués 705 points quantiques nm et biotinylé anti-Ly6G mAb étiqueter spécifiquement neutrophiles circulants 20. En outre, l&#39;endocytose de ces conjugués dans neutrophvésicules IL permet le suivi du transport vésiculaire à grande vitesse dans les neutrophiles qui migrent dans le tissu interstitiel. In vivo , le marquage avec des anticorps fluorescents conjugués contre la P-sélectine glycoprotéine ligand-1 (PSGL-1), L-sélectine (CD62L), l&#39; intégrine aM (CD11b ) et chimiokines (CXC motif) récepteur 2 (CXCR2) dans un modèle inflammatoire induite par le TNFa a élucidé les mécanismes de régulation en jeu lors de l&#39; inflammation précoce 21. polarisants neutrophiles font saillie uropodes PSGL-1-enrichi à interagir avec CD62L présent sur les plaquettes activées, ce qui entraîne une redistribution des CD11b et CXCR2, des récepteurs qui stimulent la migration des neutrophiles et déclenchent l&#39;inflammation. IL-1β est l&#39; un des gènes de signature qui est élevée dans les 22 neutrophiles amorcées. Chez les souris rapporteurs pIL1-DsRed, des signaux de fluorescence DsRed (ie., L&#39; activation du promoteur IL-1β) une corrélation positive avec l&#39; IL-1β expression de l&#39; ARNm et de la production de la protéine IL-1β. &lt;sup&gt; 18 Pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage, une méthode de microscopie intravitale a été développé impliquant l&#39; induction de l&#39; inflammation de la peau avec oxazolone (OX) dans le modèle de la souris pIL1-DsRed après marquage in vivo des neutrophiles avec fluorescence conjugué anti-Ly6G mAb. À travers ce modèle, il est possible d&#39;étudier le comportement et la fonction des neutrophiles amorcées dans des modèles animaux de diverses maladies et affections.

<table><tbody><tr><td>Héparine sodique</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acépromazine</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Church & Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anticorps anti-souris Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline U-100 avec aiguille 28 G</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Kit de perfusion papillon (aiguille 27 G)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur cytomètre</td><td>BD Logiciel CellQuest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro BD</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie intravitale de neutrophiles amorçage utilisation de il-1ß conduit promoteur-dsred souris reporter

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine humaine et sont rapidement recrutés pour des sites inflammatoires. Amorçage est un événement critique qui améliore la fonctionnalité phagocytaire des neutrophiles. Bien que des études approfondies ont dévoilé l&#39;existence et l&#39; importance de neutrophiles amorçage lors de l&#39; infection et des blessures, des moyens de visualisation de ce processus in vivo ont été indisponibles. Le protocole fourni permet de surveiller le processus dynamique de neutrophiles amorçage chez les animaux vivant en combinant trois méthodes: 1) Signal rapporteur DsRed - utilisé comme une mesure d&#39;amorçage 2) in vivo étiquetage des neutrophiles - réalisé par injection de l&#39; antigène anti-lymphocyte fluorescence conjugué 6G (Ly6G) anticorps monoclonal (mAb) et 3) l&#39;imagerie confocale intravitale. Plusieurs étapes critiques sont impliqués dans ce protocole: la souris inflammation induite par l&#39;oxazolone-cutanée de l&#39;oreille, la sédation appropriée des animaux, des injections répétées de mAb anti-Ly6G et prevention de la dérive de mise au point lors de l&#39;imagerie. Bien que quelques limitations ont été observées, telles que la limite de temps d&#39;imagerie continue (~ 8 h) chez une souris et la fuite de l&#39;isothiocyanate de fluorescéine-dextran de vaisseaux sanguins dans l&#39;état inflammatoire, ce protocole fournit un cadre fondamental pour l&#39;imagerie intravitale de le comportement apprêté neutrophile et la fonction, qui peut être facilement étendu à l&#39;examen d&#39;autres cellules immunitaires dans les modèles d&#39;inflammation de la souris.

Criblage des souris pIL1-DsRed est effectuée sur la base du signal de fluorescence de DsRed phénotypiques produite par les leucocytes du sang périphérique en utilisant la cytométrie de flux. Stimulation par le LPS est connu pour induire la production d&#39; IL-1β dans les cellules myéloïdes , y compris les neutrophiles, les monocytes et les cellules dendritiques 26-28. Ainsi, les leucocytes isolés sont incubés avec LPS pendant 4 heures avant de cytométrie en flux analyse. Ensu...

Ce protocole actuel utilise des rapporteurs fluorescents, le marquage in vivo et des techniques d’imagerie intravitale pour permettre la surveillance du processus dynamique d’amorçage des neutrophiles chez les animaux vivants.

Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

L’objectif global de cette procédure est de présenter une technologie pour surveiller le processus d’amorçage des neutrophiles chez les animaux vivants. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que la visualisation du comportement et de la fonction d’amorçage des neutrophiles dans des modèles animaux de maladies et de troubles les plus rares. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine trois méthodologies établies, notamment les rapporteurs fluorescents dans le marquage viral et l’imagerie intravitale.Élevez des souris hétérozygotes pIL1-DsRed avec des souris C57Black de type sauvage. À trois ou quatre semaines, phénotypez leurs petits. Pour chaque chiot, préparez un tube de 1,5 millilitre avec 20 microlitres d’héparine.Pour recueillir du sang, tenez un chiot par la peau de son cou et percez la veine sous-mandibulaire de la poche de la joue à l’aide d’une lancette de 5 millimètres. Seule une petite ponction est nécessaire. Prélevez trois à cinq gouttes de sang par tube.Après avoir effectué la collecte, assurez-vous d’arrêter l’hémorragie et d’observer les animaux pendant 30 minutes avant de les ramener à l’anim

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

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Surveillance de la dynamique de recrutement des neutrophiles et de la charge bactérienne au site d’infection dans un modèle murin

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Technique permettant d’évaluer la réponse immunitaire contre un antigène en induisant une inflammation cutanée

Nous rapportons ici une technique expérimentale de la microscopie de fluorescence intravitale de visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes. Cette technologie microscopique seront très utiles pour étudier le mécanisme moléculaire de la maladie vasculaire et de tester des agents pharmacologiques dans des conditions physiopathologiques.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Haute résolution intravitale imagerie avec un contraste accru jusqu'à 120 um de profondeur dans les ganglions lymphatiques de la souris adulte est obtenue en modulant spatialement le modèle d'excitation d'un multi-focal microscope à deux photons. En 100 profondeur pm nous avons mesuré des résolutions de 487 nm (latéraux) et 551 nm (axial), contournant ainsi les limites de diffusion et de diffraction.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Les mécanismes qui régissent la motilité interstitielle des cellules CD4 T effecteurs aux sites d'inflammation sont relativement peu connus. Nous présentons une approche non invasive pour visualiser et manipuler dans des cellules in vitro -primed T CD4 dans le derme de l' oreille enflammée, ce qui permet pour l' étude du comportement dynamique de ces cellules in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

La méthode décrite ici permet la visualisation de l'activation de l'inflammation dépendante du promoteur de l'IL-8 dans les poumons de la souris par une imagerie bioluminescente non invasive (BLI). Le même animal peut être soumis à BLI à plusieurs reprises pendant jusqu'à deux mois à partir du moment de la livraison de la construction de journaliste de luciférase.

Un modèle de souris transmissible transitoirement IL-8 pour le<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi à long terme des réponses inflammatoires

Ici, nous montrons comment effectuer la microscopie intravitale sur les venules post-capillaires du muscle de cremaster de souris. Communément appliqués à différents modèles d’inflammation et de septicémie, en particulier ceux induits par les chimiothérapeutiques et les cytokines, nous soulignons sa pertinence dans l’étude des muscolopathies impliquant l’infiltration musculaire exagérée de leucocyte.

Infiltration de Leukocyte de Cremaster Muscle chez les souris évaluées par microscopie intravitale

La migration des neutrophiles repose sur le remodelage rapide et continu de la membrane plasmique en réponse au chimioattractant et à ses interactions avec le microenvironnement extracellulaire. Il s’agit d’une procédure basée sur la microscopie subcellulaire intravitale pour étudier la dynamique du remodelage membranaire dans les neutrophiles injectés dans l’oreille de souris anesthésiées.

Imagerie de la migration des neutrophiles dans la peau de souris pour étudier le remodelage de la membrane subcellulaire dans des conditions physiologiques

Découvrez l'imagerie intravitale pour visualiser l'amorçage des neutrophiles chez la souris IL-1ß-DsRed. Cette méthode combine marquage fluorescent et imagerie in vivo pour étudier les réponses immunitaires dans les maladies rares.

Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter

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