A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

Purificação de todo o genoma de DNA circular extracromossômico de células eurcarióticas. Olá, sou Rasmus. Aqui apresentarei todo o esboço do método de purificação circular do DNA.

Na primeira parte, as células de levedura são cultivadas e colhidas. Em seguida, o DNA circular é purificado e amplificado em três etapas. Primeiro, pela separação da coluna, onde os círculos de DNA são purificados e enriquecidos.

Em seguida, pelo tratamento do DNA com exonuclease para digerir todo o DNA linear restante e, finalmente, pela amplificação dos círculos de DNA usando a polimerase phi-29. Na quinta parte deste protocolo, os círculos de DNA são sequenciados e as leituras são mapeadas para o genoma de referência de Saccharomyces cerevisiae. No final deste vídeo, mostraremos alguns resultados representativos.

Discutiremos as perspectivas para estudos futuros e as vantagens do uso desse método. Parte um, colheita de células. A cultura inicial é cultivada a 30 graus com agitação até a densidade máxima, que é de aproximadamente 200 milhões de células por mililitro e é alcançada após 24 a 48 horas.

A cultura cultivada é transferida para um tubo Falcon e peletizada por centrifugação por três minutos. O sobrenadante é removido. O pellet grande é vórtice em tampão TE e repelido por centrifugação.

Parte dois, purificação da coluna. Nesta etapa, usamos um kit de purificação de coluna disponível comercialmente que produz plasmídeos altamente purificados a partir do DNA bacteriano genômico. Antes de usar este kit com levedura, a parede celular precisa ser rompida.

Isso é feito ressuspendendo o pellet de célula lavada em tampão L-1 do kit. A suspensão celular é transferida para um tubo de microcentrífuga e esferas de vidro são adicionadas a um terço do volume total. A amostra é agitada em vórtice na velocidade máxima por 10 minutos e os grânulos são removidos por centrifugação a 2.000 rotações por minuto por 30 segundos.

O sobrenadante é transferido para um novo tubo. Neste método, adicionamos plasmídeos altamente diluídos ao sobrenadante em três proporções diferentes. Propomos incluir plasmídeo altamente diluído no ciclo.

Isso pode servir como guias de referência internos. Isso você pode usar para verificar a qualidade da purificação e amplificação do DNA, também, você pode fazer uma estimativa de semiquantidade dos DNAs não circulares por célula usando esses picos de plasmídeos. Apenas plasmídeos altamente diluídos devem ser adicionados, pois afetarão a resolução da sequência de outros DNAs circulares.

A suspensão celular contendo plasmídeos enriquecidos é tratada com solução L-2 do kit e o protocolo do kit é seguido. Após o carregamento da coluna, proteínas, lipídios e DNA cromossômico são removidos lavando a coluna duas vezes. O DNA circular cromossômico extra é altamente enriquecido na fração eluato.

Parte três, digestão linear do DNA. Nesta etapa, usamos uma exonuclease para digerir o DNA linear restante. Uma exonuclease dependente de ATP visa especificamente o DNA linear de fita dupla e simples sem digerir o DNA circular.

A especificidade da exonuclease para DNA linear foi confirmada por eletroforese em gel após 29 horas de tratamento com DNase. Os resultados mostram que o DNA genômico é digerido enquanto o DNA do plasmídeo permanece conforme indicado pela seta vermelha. A levedura contém 16 cromossomos, com até 1.500 quilobases de comprimento.

Portanto, para facilitar a digestão da exonuclease, uma endonuclease de corte rara é usada para obter um número maior de extremidades de DNA acessíveis. Se estiver usando a enzima de restrição NotI, cada cromossomo é clivado até sete vezes, conforme indicado. O DNA purificado em coluna é tratado com NotI a 37 graus em um bloco de aquecimento durante a noite.

Após a inativação do calor de NotI, o DNA clivado é tratado com exonucleases a 37 graus de acordo com o protocolo do fabricante. Após o tratamento com exonuclease, as enzimas são inativadas por calor a 70 graus por 30 minutos. Pode levar vários dias para digerir todo o DNA cromossômico linear por ATP e exonuclease adicionais Para garantir que todo o DNA linear seja completamente digerido, as amostras são analisadas por métodos de PCR ou qPCR usando um gene de referência interno, como o ACTI.

Parte quatro, amplificação do DNA. Nesta etapa, enriquecemos e amplificamos o DNA circular usando a polimerase phi-29. A reação ocorre a 30 graus usando oligonucleotídeos hexâmeros aleatórios e phi-29.

A polimerase possui alta fidelidade e atividade de leitura de provas, garantindo amplificação imparcial do DNA. Cada polimerase pode, pela replicação do círculo rolante, sintetizar até 100 quilobases de DNA. A polimerase também é altamente processiva, amplificando o DNA até 10 elevado à nona dobra.

Parte cinco, sequenciamento. Seguindo o protocolo para uma plataforma de sequenciamento de próxima geração de alto rendimento, o DNA é sonicado a um tamanho médio de 300 pares de bases e sequenciado como leituras de extremidade única de 141 nucleotídeos. As leituras de sequência são mapeadas para o genoma de referência de Saccharomyces cerevisiae, usando o banco de dados gratuito Galaxy.

Os dados sequenciados são carregados no Galaxy e as leituras são mapeadas usando o alinhador de leitura curta Bowtie2, que permite o mapeamento de leituras parciais. Parte seis, resultados representativos. Após o sequenciamento e mapeamento para o genoma de referência de Saccharomyces cerevisiae, as leituras podem ser visualizadas no navegador do genoma dentro do software Galaxy.

O DNA de origem circular pode, por exemplo, ser contado como regiões que contêm leituras coerentes maiores que um quilobase, conforme indicado na tela. Um exemplo de uma região no cromossomo quatro que contém leituras coerentes abrangendo mais de uma quilobase é a região com os genes transportadores de hexose seis e sete. Ao usar este método em uma população de células de levedura, leituras mapeadas são freqüentemente encontradas neste locus e a cobertura de leitura sugere claramente que um círculo de DNA se formou entre os genes transportadores de hexose parralog.

Devido à alta homologia de sequência entre os genes transportadores de hexose, propomos que a recombinação homóloga ilegítima leva à circularização desse DNA. No modelo de mutação circular do DNA é quando o processo de reparo do DNA é executado de forma imperfeita. Por exemplo, se ocorre uma quebra de fita dupla em um elemento repetitivo, a sequência homóloga na mesma cromátide pode ser usada como modelo para o reparo do DNA por recombinação homóloga.

Após a ressecção, invasão da fita, síntese de DNA e resolução de todas as injunções, um círculo de DNA pode se formar a partir do genoma, causando uma deleção de DNA no cromossomo. Os efeitos do tratamento do DNA com exonucleases e fi-29 polimerase podem ser visualizados usando a coloração de iodeto de propídio. Os controles de coloração do DNA genômico aparecem como na imagem da esquerda, enquanto o DNA do plasmídeo aparece como na imagem da direita.

Após 29 horas de tratamento com exonuclease 400 nanogramas de DNA genômico, a maior parte do DNA é digerida conforme indicado na imagem à esquerda. Este resultado é confirmado por eletroforese em gel, conforme mostrado na imagem do gel à direita. Após 72 horas de tratamento com exonuclease seguido de síntese de DA pela polimerase phi-29, milhões de cópias de DNA ainda podem ser identificadas.

Da mesma forma, após 29 horas de tratamento com exonuclease de 400 nanogramas de DNA genômico, mais 100 nanogramas adicionais de DNA de plasmídeo, a maior parte do DNA genômico é digerida. No entanto, o DNA do plasmídeo não é digerido conforme indicado pela imagem do gel. Após o tratamento com polimerase phi-29 da amostra tratada com exonuclease de 72 horas, a maioria do DNA amplificado aparece como plasmídeos corados.

Então, primeiro examinamos genes para DNA circular e ficamos realmente surpresos ao encontrar várias centenas de tipos diferentes de amostras de DNA. Sim, ficou realmente surpreso ao descobrir como os círculos de DNA são comuns na população de leveduras, e acreditamos que esse método pode ser usado para muitos tipos de estudos. Obviamente, um seria olhar para o tecido humano.

Sabemos que o gene pode ser amplificado em elementos circulares e leveduras, é claro, e até mesmo células tumorais. Acho que, em geral, será interessante olhar para as células somáticas e investigar que tipo de DNA circular encontraremos lá e como podemos fazer esse efeito. Circularização. Nas células envelhecidas, temos círculos que se acumulam à medida que envelhecemos e esperamos que mais genes sejam encontrados no DNA circular.

E, além disso, gostaríamos de olhar para os mecanismos moleculares que a circularização do DNA e a coisa óbvia a fazer é olhar para a levedura onde temos mutantes que são defeituosos na recombinação homóloga e depois não homóloga Ao estudar esses mutantes, esperamos que a circularização do DNA tenha um perfil diferente dos diferentes tipos de mutantes e, esperançosamente, a partir dos estudos de leveduras, poderemos aprender muito mais sobre a circularização do DNA. Portanto, em comparação com outros métodos, esse método é muito mais sensível. Pode ser realmente capaz de encontrar o círculo de DNA em aproximadamente uma em cada 10.000 células.

E até onde eu sei de estudos do teste feitos longamente. Os alelos mutantes normalmente precisam atingir uma proporção de um a 10% da população antes que possam ser detectados. Certo, e por esta técnica você não precisa ter nenhum conhecimento prévio dos círculos de DNA formados, ao contrário das técnicas Ou os círculos de DNA têm que ser um pouco ligados e então você pode detectá-los facilmente como amplificações por sequenciamento ou por coloração cromossômica.

Sim, então eu acho que realmente a principal vantagem é a sensibilidade e espero que possamos fazer muitas coisas interessantes com esse método.