본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리 전의 VIVO 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

이 프로토콜의 전반적인 목표는 폴리(락틱-코-글리콜산) 또는 PLGA, 미세구를 사용하여 배양된 온전한 췌장도에 관심 화합물을 전달하여 성인 췌장 베타 세포 증식에 대한 개별 화합물의 효과를 연구하는 것입니다. 이 방법은 손상되지 않은 섬에 지속적인 방출 방식으로 국부적으로 전달되는 다양한 화합물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 대체 전달 생체 재료, 관심 화합물 및 종말점 분석에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 또한 생체 내에서 채택된 섬의 전달과 관련하여 관심 화합물을 전달할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. PLGA 마이크로슈페레를 만드는 방법을 시연할 사람은 제 연구실의 대학원생인 Taylor Kavanaugh입니다. 먼저 형광 표지된 관심 화합물 1mg을 100마이크로리터의 탈이온수에 첨가하여 첫 번째 물 단계를 형성합니다.

다음으로, 섬광 바이알에 750 마이크로 리터의 디클로로 메탄에 65 밀리그램의 PLGA를 용해시키고 160 와트에서 10-30 초 동안 혼합물을 초음파로 처리하여 PLGA를 완전히 용해시킵니다. 이것이 유상을 형성합니다. 첫 번째 물 단계를 모두 적방울 방식으로 오일 상태에 추가합니다.

다음 소형 균질화기를 20, 첫번째 물 기름 단계를 형성하는 30 초 동안 000 분당 회전수에 해결책을 유화하기 위하여 이용하십시오. 그런 다음 첫 번째 물-기름 상을 모두 15 밀리리터의 1 % PVA 용액에 적가하고 방금 설명한대로 유화합니다. 다음으로, 에멀젼의 전체 부피를 200 밀리리터 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 회전 증발기를 사용하여 635 밀리미터 진공 상태에서 1 시간 동안 수성상 생성을위한 용매를 제거합니다.

14개의 마이크로 원심분리기 튜브 각각에 1ml의 수성 상을 분취하고 원심분리로 미세구를 펠릿화합니다. 스핀이 끝나면 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 각 튜브에서 900마이크로리터의 수용액을 제거합니다. 1ml의 탈이온수로 마이크로스피어를 세척한 다음 900마이크로리터의 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 900마이크로리터의 탈이온수를 나머지 100마이크로리터의 상층액에 추가합니다. 그런 다음 잠시 소용돌이와 초음파 처리를 하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 관심 있는 실험 동물로부터 섬을 분리한 후, 200마이크로리터의 섬 배양 배지에 있는 96웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 시각적으로 크기가 일치하는 40개의 섬을 파종합니다.

다음날 아침, 튜브에서 관심 화합물의 최종 농도가 마이크로리터당 10나노그램이 되도록 사전 분석 배지에서 마이크로스피어의 1개 분취량을 다시 현탁시키고 섭씨 4도에서 10초 긴 펄스로 160와트에서 10분 동안 얼음물 수조에서 마이크로스피어를 초음파 처리합니다. 다음으로, 섬을 제거하지 않고 각 웰에서 100마이크로리터의 섬 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 100마이크로리터의 마이크로스피어 함유 분석 배지로 배양물을 배양합니다. 3일 후, 섬을 방해하지 않고 모든 우물에서 분석 매체를 조심스럽게 버리고 200마이크로리터의 PBS로 섬을 두 번 부드럽게 세척합니다.

섬은 96웰 플레이트에만 느슨하게 부착됩니다. 따라서 섬이 실수로 제거되거나 폐기되지 않도록 각 우물에서 매체 및 PBS를 부드럽게 제거하는 것이 중요합니다. 두 번째 세척 후 실온에서 3분 동안 100마이크로리터의 트립신 EDTA 용액에 섬을 부드럽게 담그고 2분 후에 부드럽게 피펫팅합니다.

각 웰의 전체 부피를 개별 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 각 튜브에 400마이크로리터의 섬 배양 배지를 추가하여 해리를 중지합니다. 원심분리로 처리된 섬을 수집한 후 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 부드럽게 제거하고 펠릿을 200마이크로리터의 신선한 섬 배양 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 해리된 섬을 세포 원심분리기의 하전 된 현미경 슬라이드로 회전시킵니다.

공기 건조 후 소수성 마킹 펜으로 섬 주위에 상자를 그리고 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드 75마이크로리터에 셀을 고정한 다음 75마이크로리터의 PBS로 두 번 세척합니다. 두 번째 관찰 후 PBS에서 0.2%Triton X-100 75마이크로리터로 10분 동안 세포를 투과한 다음 PBS 75마이크로리터만으로 최종 세척합니다. 섬에 대한 면역 라벨을 적용하려면 먼저 슬라이드 셀 면이 위로 향하게 하여 습한 챔버에 놓고 PBS를 제거합니다.

다음으로, 실온에서 75마이크로리터의 일반 당나귀 혈청으로 비특이적 결합을 차단합니다. 1시간 후, 혈청을 75마이크로리터의 1차 관심 항체로 교체하여 실온에서 한 시간 더 사용합니다. 배양이 끝나면 1차 항체 용액을 조심스럽게 흡인하고 375마이크로리터 PBS 세척으로 샘플을 세척합니다.

그런 다음 75마이크로리터의 적절한 면역형광 태그가 붙은 2차 항체로 섬을 배양하여 빛으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 2차 항체 용액을 75마이크로리터의 Dappy로 3분 동안 교체한 다음 탈이온수로 5분 동안 헹굽니다. 세척이 끝나면 퇴색 방지 시약이 포함된 속건성 마운팅 솔루션 100마이크로리터 드롭을 유리 커버 슬립에 놓고 샘플링 면이 아래를 향하도록 현미경 슬라이드 하나를 마운팅 용액에 뒤집습니다.

미세구의 가장 큰 부분은 직경이 1-10미크론 사이이지만 일부 미세구는 더 클 수 있습니다. 온전한 PLGA 미세구체 처리된 섬의 분산과 그에 따른 면역 표지 후, 세척 단계에서 완전히 제거되지 않은 온전한 미세구로 인해 세포 사이에 표지가 없는 샘플 영역을 관찰하는 것이 일반적입니다. 이미징 후 Ki67 인슐린 양성 세포의 비율은 소프트웨어 이미지 분석을 사용하거나 라벨링된 세포의 총 수를 수동으로 계산하여 정량화할 수 있습니다.

방금 시연된 바와 같이 3일 동안 재조합 인간 결합 조직 성장 인자 PLGA 미세구로 온전한 섬을 처리하면 베타 세포 증식이 증가하여 단백질이 미세구 생성 중에 어떠한 기능도 잃지 않음을 입증했습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 일주일 이내에 결과를 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실험에서 베타 세포 증식에 미치는 영향은 관심 화합물과 생성된 미세구의 정확한 방출 역학에 따라 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라, 온전한 췌장 섬과 화합물이 적재된 미세구의 동시 이식과 같은 다른 방법을 수행하여 관심 화합물이 생체 내에서 베타 세포 증식을 유도할 수 있는지와 같은 다른 질문을 해결할 수 있습니다. PLGA는 FDA의 승인을 받은 장치 및 약물 전달 시스템에 사용된 이력이 있으므로 장기간에 걸쳐 손상된 조직에 치료 화물을 전달하려는 연구자 및 임상의에게 좋은 선택입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 화합물이 로드된 PLGA 마이크로스피어를 생성하고 이를 배양된 온전한 섬에 투여하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.