精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

この手順の総合的な目的は、ラットの精巣上体から上皮細胞を単離し、ホールセルパッチクランプ法を用いて、これらの一次的に分散させた細胞の電気的特性を測定することです。この手法は、精子の成熟や父親の形質の継承に重要な精巣上体の機能など、生殖生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術を用いることで、単離した精巣上体上皮細胞の電気的特性を解析することができ、これにより、これらの細胞の未知の生理学的機能を明らかにすることが可能になります。

手順の実演は、私の研究室の大学院生であるBao Li Zhangが行います。まず、解剖器具を70% ethanolに浸して消毒します。その後、自然乾燥させてください。

次に、完全IMDMを調製します。その後、無菌条件下で50 mlずつ分注し、Parafilmで密封して4°Cで保存します。続いて、コラゲナーゼタイプIおよびコラゲナーゼタイプIIをRPMIに溶解し、各コラゲナーゼの濃度が1 mg/mLとなるようにして、コラーゲン分解酵素消化液を調製します。

溶液を0.22 µmのメンブレンでろ過します。次に、「コラゲナーゼ溶液」とラベルを貼り、使用時まで室温で保存します。続いて、酵素の重量に基づいて酵素溶液の容量を調整します。

1匹のラットの両側副精巣尾部から得られる必要最小量は2 mLです。ラットの副精巣尾部を摘出するには、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与、またはイソフルランチャンバーを用いて、尾をつまむ刺激に反応しなくなるまで麻酔をかけ、その後頚椎脱臼により安楽死させます。その後、下腹部を70%エタノールで拭いて消毒します。

2つの精巣を優しく下腹部へと押し下げ、陰嚢付近の下腹部を切開します。続いて、精巣上体周囲の脂肪を除去し、すべての生殖器官を摘出します。その後、RPMIを入れたディッシュにそれらを移します。

クリーンで気流制御されたワークステーションにおいて、精巣上体尾部を結合組織、脂肪組織、および精巣上体被膜から切り離します。1.5 mLチューブに、精巣上体1つと0.2 mLのコラゲナーゼ溶液を入れます。精巣上体尾部から単一細胞を分離させるため、組織がペースト状の液体状になるまで、微細な鋏を用いてコラゲナーゼ溶液中で精巣上体を細切します。

次に、チューブに残っている酵素溶液でハサミを軽くすすぎます。その後、チューブをメタルサーモミキサーに設置し、37 °C、振盪速度 1,000 rpm で30分間処理します。次いで、酵素と組織の混合液を室温で3分間遠心分離します。

その後、主に精子が含まれている粘性の高い上清をデカンテーションで除きます。次に、すべての酵素活性を停止させるため、ペレットを1 mLの完全IMDMで再懸濁します。続いて、細胞懸濁液を49 mLのRPMIが入った50 mLチューブに移します。

細胞混合液を遠心分離し、上清をデカンテーションで除去します。ペレットを1 mLの完全IMDMで再懸濁し、少なくとも5分間緩やかにピペッティング（trituration）することで、酵素処理した精巣上体組織混合液から単一細胞を解離させます。無菌条件下で上皮細胞を他の細胞から分離し、細胞懸濁液を完全IMDMを含む10 cmペトリ皿に入れ、32 °Cのインキュベーター内で少なくとも8時間または一晩培養します。

翌朝、カバーガラスを100%アルコールに浸して滅菌します。風乾させた後、少量の培地に浸します。次に、カバーガラスを6 cm培養皿または24ウェルプレートのシングルウェルに入れます。

次に、主に上皮細胞で構成されているペトリ皿から細胞懸濁液を穏やかに回収し、解離させた上皮細胞を回収します。細胞懸濁液を室温で 30 ×g で5分間遠心分離し、上清をデカントします。その後、細胞ペレットを 2 mL の完全 IMDM で再懸濁します。

回収した細胞懸濁液0.2 millilitersを、滅菌済みカバーガラスの中央に播種します。細胞がガラスカバーガラスに緩やかに接着するように、細胞懸濁液を液滴内で少なくとも10分間静置します。その後、細胞を乱さないように、6 cmディッシュの端に1 milliliterの完全IMDMを、または24ウェルプレートの各ウェルに0.3 millilitersの完全IMDMを慎重に加えます。

分離した単一細胞を載せたカバーガラスは、パッチクランプ実験までインキュベーター内で32 degrees celsiusに保持します。パッチクランプ実験当日、細胞内液の分注液1本を氷上で解凍し、分解を防ぐため実験中も冷却した状態で保持します。次に、ガラスカバーガラス上で培養した上皮細胞を、室温の標準PSSを満たした記録室に移します。

パッチクランプ実験を行う前に、ピペットを使用して浸漬用PSSを少なくとも2回注意深く交換してください。ホールセル構成を確立するために、マイクロマニピュレーターの最高速度でピペットをバス溶液に浸します。デジタルカメラに接続された画面上でピペットチップを確認してください。

次に、マイクロマニピュレーターの速度を中〜高モードに下げます。コンピュータ制御のアンプから生成された電圧ステップを印加し、データ収集インターフェースのコマンドを使用して、マイクロピペットの抵抗値を迅速に確認します。抵抗値がこの範囲から大幅に外れている場合は、新しいマイクロピペットに交換してください。

次に、ソフトウェアのコマンドインターフェースにあるピペットオフセットコマンドを使用して、ピペットとバス溶液間の液絡電位をゼロに設定します。メンブレンテストで抵抗値をモニターしてください。抵抗値が500 MΩより大きく、1 GΩより小さい場合は、ギガシール形成を促進するために負の電位を印加してください。

その間に、マイクロピペットの過渡容量電流を補正します。この時点で、シール抵抗を測定するために、保持電位0 mVから10 mVの過分極ステップを印加します。ホールセル構成が正常に完了した後、直ちに保持電位-60 mVから10 mVの過分極ステップを印加します。

電圧モードをゼロ電流モードに切り替え、10秒間のギャップフリー記録を行い、細胞の静止膜電位を測定します。その後、速やかに電圧モードに戻し、そのままの状態を維持します。計画した実験に従って電圧プロトコルを適用し、電流応答を測定します。

パッチクランプ実験に先立ち、ディッシュで一晩培養し、再回収する前後のラット精管尾部から単離した上皮細胞の例を以下に示します。この図は、パルス誘発プロトコルを用いて単一の精管上皮細胞から記録された典型的なホールセル電流を示しています。点線は電流ゼロのレベルを示しています。

以下は、指示されたタイムポイントで測定された電流応答の電流-電圧関係です。これらは、ATPを含むまたは含まないピペット溶液で透析した主細胞の静止膜電位の代表的なトレースです。そして、この棒グラフは、ATP添加時と非添加時の初期静止膜電位の間に有意な差がないことを示しています。

バー内の括弧内の数字は、少なくとも3匹の動物からテストした細胞数を示しています。また、ここでは、全細胞または主細胞のみのシール抵抗および入力抵抗と、ホールセル形成直後のゼロ電流クランプで測定した静止膜電位、および保持電位から-100 mVへの過分極ステップで測定した電流値との相関分析を示しています。この手法に習熟し、適切に実施すれば、9時間で完了させることができます。

この手順を行う際は、細胞分離ステップにおいて酵素消化を直ちに停止させることが重要です。さもない contrárioに、過剰消化が起こり、ギガオームシール（gigaohm seal）の形成が困難になり、パッチクランプ実験が失敗する可能性があります。培養細胞の健全性を維持するためには、酵素的に解離させた細胞混合液を 30 G の低速で 2～3 分間遠心分離し、主に精細胞を含む粘性の高い上澄み液をデカンテーションで除去することが重要です。

これらの手順に従い、ライブセルイメージングや単一細胞培養法などの他の手法を用いることで、例えば、ナイーブな上皮細胞における静止膜電位が制御条件下での細胞外挙動をどのように調節しているかといった、さらなる疑問を明らかにすることが可能です。本手法は、生殖生物学分野の研究者が、精子の成熟や父親から受け継がれる獲得形質の遺伝における精巣上体上皮細胞の電気生理学的特性を探索するための道を切り開くものです。このビデオを視聴することで、ラットの精巣上体から上皮細胞を単離する方法、およびホールセルパッチクランプ法を用いてこれらの細胞の電気的特性を測定する方法について、十分に理解できるはずです。