Записи цельного клеточного зажима с изолированными первичными эпителиальными клетками от эпидидимиса

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать эпителиальные клетки из придатка яичка крысы и измерить электрические свойства этих преимущественно диссоциированных клеток с помощью метода патч-зажима для целых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репродуктивной биологии, такие как функция придатка яичка, которая важна для созревания сперматозоидов и наследования отцовских признаков. Этот метод позволяет пользователю прижигать электрические свойства изолированных эпителиальных клеток придатка яичка, чтобы затем можно было проиллюстрировать неизвестную физиологическую функцию этих клеток.

Демонстрировать процедуру будет Бао Ли Чжан, аспирант из моей лаборатории. Чтобы начать процедуру, продезинфицируйте инструменты для вскрытия путем погружения в 70% этанол. Затем дайте им высохнуть на воздухе.

Далее подготовьте полный IMDM. После этого создайте аликвоты объемом 50 мл в асептических условиях, запечатайте парапленкой и храните при температуре четыре градуса Цельсия. После этого приготовьте раствор для расщепления коллагеновых ферментов путем растворения коллагеназы типа I и коллагеназы типа II в RPMI, в результате чего в растворе образуется один миллиграмм на миллилитр каждой коллагеназы.

Отфильтруйте раствор через мембрану толщиной 0,22 микрометра. Затем отметьте его как раствор коллагеназы и держите раствор при комнатной температуре до использования. Далее отрегулируйте объем раствора фермента исходя из веса фермента.

Минимальный объем, необходимый для обоих придатков придатков от одной крысы, составляет два миллилитра. Чтобы препарировать придатки придатков крысы, принесите животное в жертву либо с помощью пентобарбитала натрия путем инъекции IP, либо с использованием изофлурановой камеры до тех пор, пока животное не перестанет реагировать на стимуляцию щипывания хвоста с последующим вывихом шейки матки. После этого продезинфицируйте нижнюю часть живота, протерев ее 70% этанолом.

Осторожно надавите на два семенника вниз к нижней части живота, а затем откройте нижнюю часть живота возле мошонки. Впоследствии удалите жир придатка яичка и рассеките все репродуктивные органы. После этого переложите их в тарелку с помощью RPMI.

На чистой рабочей станции с контролируемым потоком воздуха отделите придатки придатков из соединительных и жировых тканей и капсулы придатка яичка. Поместите один придаток яичка с 0,2 миллилитров раствора коллагеназы в 1,5 миллилитровую пробирку. Чтобы отделить отдельные клетки от придатков придатков, разрежьте эпидидимиды в растворе коллагеназы с помощью тонких ножниц до тех пор, пока ткань не превратится в пастообразную жидкость.

Затем аккуратно промойте ножницы остатком ферментного раствора в тюбике. После этого поместите трубку на металлический термомиксер на 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью встряхивания 1 000 оборотов в минуту. Затем центрифугируйте ферментную тканевую смесь при комнатной температуре в течение трех минут.

После этого сцедите липкую надосадочную жидкость, которая содержит в основном сперму. Далее суспендируйте гранулу в одном миллилитре полной IMDM, чтобы погасить всю ферментативную активность. Затем перенесите клеточную суспензию в 50-миллилитровую пробирку, содержащую 49 миллилитров RPMI.

Центрифугируйте клеточную смесь и сцедите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре полного IMDM с помощью мягкого растирания в течение не менее пяти минут для диссоциации отдельных клеток из ферментативно обработанной смеси тканей придатка яичка. Отделите эпителиальные клетки от других клеток в асептических условиях и культивируйте клеточную суспензию на 10-сантиметровой чашке Петри, содержащей полный IMDM, в течение не менее восьми часов или в течение ночи в инкубаторе при температуре 32 градуса Цельсия.

На следующее утро приготовьте стерильные покровные листы, погрузив их в 100% спирт. Обсушите на воздухе, а затем опустите их в небольшое количество питательной среды. Затем поместите покровные листы в шестисантиметровые посуды для культуры или в одиночные лунки 24-луночной тарелки.

Теперь соберите диссоциированные эпителиальные клетки, аккуратно собрав клеточную суспензию из чашки Петри, которая состоит в основном из эпителиальных клеток. Центрифугируйте клеточную суспензию при 30-кратном G при комнатной температуре в течение пяти минут, а затем сцеживайте надосадочную жидкость. После этого повторно суспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах полной IMDM.

Семян по 0,2 миллилитра собранной клеточной суспензии нанесите на центр каждой стерильной покровной суспензии. Дайте клеточной суспензии осесть в капле жидкости не менее 10 минут, чтобы клетки могли неплотно прилипнуть к стеклам крышки. Затем осторожно добавьте один миллилитр полного IMDM на край шестисантиметровой посуды или 0,3 миллилитра полного IMDM в каждую лунку 24-луночного планшета, не нарушая клетки.

Храните изолированные одиночные клетки на покровных стеклах в инкубаторе при температуре 32 градуса Цельсия до проведения экспериментов с патч-зажимом. В день эксперимента с пластырем разморозьте одну аликвоту внутриклеточного раствора на льду и держите его охлажденным во время эксперимента с пластырем, чтобы предотвратить деградацию. Далее перенесите культивирующие эпителиальные клетки на стеклянной крышке в записывающую камеру, заполненную стандартным PSS при комнатной температуре.

Осторожно меняйте ПСС для купания не менее двух раз с помощью пипетки перед любыми экспериментами с пластырем. Чтобы установить конфигурацию целых клеток, погрузите пипетку в раствор ванны с максимальной скоростью микроманипулятора. Найдите наконечник для дозатора на экране, подключенном к цифровой камере.

Затем снизьте скорость микроманипулятора до средне-высокого режима. Быстро проверьте сопротивление микропипетки с помощью команды интерфейса сбора данных, подав шаг напряжения, генерируемый усилителем, управляемым компьютером. Перейдите на новую микропипетку, если сопротивление значительно выходит за пределы этого диапазона.

И установите потенциал перехода жидкости между пипеткой и раствором для ванны равным нулю с помощью команды смещения пипетки в интерфейсе управления программного обеспечения. Контролируйте сопротивление с помощью мембранного теста. Если сопротивление больше 500 мегаом, но меньше одного гигаома, примените отрицательный потенциал, чтобы помочь сформировать гигауплотнение.

В то же время компенсируйте переходный емкостный ток микропипетки. В этот момент примените гиперполяризационный шаг 10 мВ от удерживающего потенциала ноль милливольт для определения сопротивления уплотнения. Сразу после достижения успешной конфигурации целого элемента примените гиперполяризационный шаг в 10 милливольт от удерживающего потенциала в минус 60 милливольт.

Переключите режим напряжения в режим нулевого тока и выполните 10-секундную запись без зазоров для измерения потенциала мембраны покоя ячейки. После этого быстро переключитесь обратно в режим напряжения и оставайтесь в нем. Применяйте протоколы напряжения в соответствии с запланированными экспериментами и измеряйте отклики тока.

Вот примеры эпителиальных клеток, выделенных из эпидидимидов cauda крысы до и после повторного сбора ночной культуры на чашке перед экспериментами с патч-зажимом. На этом рисунке показаны типичные полноклеточные токи, зарегистрированные из отдельных эпителиальных клеток придатка яичка с использованием протокола, вызывающего пульс. Пунктирной линией обозначены нулевые уровни тока.

Ниже приведена зависимость токовых характеристик от напряжения тока, измеренная в указанные моменты времени. Это репрезентативная трассировка мембранного потенциала покоя основных клеток, диализованных раствором пипетки, либо с АТФ, либо без АТФ. И этот гистограмма не показывает существенной разницы между начальным потенциалом мембраны покоя плюс АТФ и минус АТФ.

Цифры в скобках внутри столбцов указывают на количество протестированных клеток как минимум от трех животных. А вот корреляционный анализ сопротивления уплотнения и входного сопротивления всех ячеек, или только основных ячеек, в зависимости от потенциалов покоя, измеренных в зажиме нулевого тока вскоре после создания целой ячейки, и величин тока, измеренных на гиперполяризационной ступени до отрицательных 100 милливольт от удерживающего потенциала. После освоения этой техники ее можно выполнить за девять часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости немедленно остановить ферментативное расщепление на этапах выделения клеток. В противном случае может произойти переваривание, что может привести к затрудненному формированию гигаомного уплотнения и неудаче экспериментов с патч-хомутом. Для поддержания здоровья культуры важно откручивать ферментативно диссоциированную клеточную смесь с низкой скоростью 30 G в течение двух-трех минут, а затем сцеживать липкую надосадочную жидкость, которая содержит в основном сперматозоиды.

После этих процедур могут быть выполнены другие методы, такие как визуализация живых клеток и методы культивирования одной клетки, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как потенциал мембраны покоя в наивных эпителиальных клетках может регулировать внеклеточное поведение в контролируемых условиях. Этот метод открывает исследователям в области репродуктивной биологии путь к изучению электрофизиологических свойств эпителиальных клеток придатка яичка для регуляции созревания сперматозоидов и наследования отцовских признаков. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделить эпителиальные клетки из придатков яичек крыс и как измерить электрические свойства этих клеток с помощью метода патч-зажима для всей клетки.