Name: 等离子体医学基础研究--从液体到细胞的吞吐量方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 了解冷物理等离子体对细胞氧化应激和生物反应的高通量检测方法。本研究利用光学发射光谱和流式细胞术分析黑色素瘤细胞的代谢活性与免疫原性死亡，为肿瘤治疗提供新思路。

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感谢德国联邦教育与研究部（BMBF 资助编号 03Z22DN11 和 03Z22DN12）的资助。

1. 血浆物种监测与治疗设置
<ol>
	<li>等离子体物种监测
	<ol>
		<li>使用常压等离子体射流，并以每分钟不超过两个标准升的进气流量供给气体。</li>
		<li>将射流垂直于羽流轴线放置在光学发射光谱仪前方，使用专用软件记录光发射强度及波长（200 -&#160;1,000 nm）。</li>
		<li>向干燥或加湿（5%湿度）的进气气体中分别加入0.5%的氮气或氧气。</li>
		<li>针对每种气体条件重复进行光发射光谱分析。</li>
		<li>使用适合数据图形化显示的软件进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等离子体处理装置设置
	<ol>
		<li>将射流固定在由计算机控制的xyz位移台上。</li>
		<li>确定各孔的位置，并编写计算机脚本，控制与位移台相连的射流在各孔中心上方按设定的处理时间移动。</li>
		<li>在超净工作台内，向多个孔中各加入104个任意类型的贴壁哺乳动物细胞，悬浮于100 µL完全细胞培养基（RPMI1640含10%胎牛血清、2%谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素）中。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、5%二氧化碳的湿润环境中孵育过夜，使其充分贴壁。</li>
		<li>在不同高度（z轴方向，间隔250 µm）对细胞进行20秒的等离子体处理。</li>
		<li>向每孔中加入25 µL溶于细胞培养基中的碘化丙啶。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞，确定不会因进气气流将培养基推离细胞表面而导致细胞坏死的特定处理高度。 
		注：对于较长的处理时间，需通过等离子体开启和关闭模式下处理前后称量培养板的方式，识别该高度下液体蒸发量，并据此确定需补充的双蒸水微升数，以恢复处理孔内的渗透稳态。</li>
		<li>为xyz位移台制定最终操作方案，包括相应的处理时间（本例中为20 s、40 s、60 s等离子体处理及60 s气体对照）和孔位坐标，并准备好多通道移液器和储液槽，用于后续实验中96孔板的液体操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 等离子体处理液体中主要活性成分的分析
<ol>
	<li>等离子体处理过氧化氢的分析
	<ol>
		<li>在平底96孔板中，以磷酸盐缓冲液（PBS）100 µL在三个重复样本中进行等离子体处理。</li>
		<li>通过向100 µL PBS中加入10 U辣根过氧化物酶和5 µM过氧化氢检测试剂，配制主混合液（足够一个孔使用；根据需要相应放大）。</li>
		<li>向每个孔中加入95 µL主混合液。 
		注意：上一步应在洁净台或远离等离子体源的房间内操作，因环境空气中的臭氧可能降低检测灵敏度。</li>
		<li>在另一块板中，用100 µL PBS配制一系列两倍稀释的过氧化氢标准品，起始浓度为100 µM。</li>
		<li>向含有检测试剂的孔中加入5 µL样品或过氧化氢标准品。</li>
		<li>设置仅含检测试剂的孔作为空白对照，用于读数后背景扣除。</li>
		<li>将板在室温下避光孵育15分钟。</li>
		<li>将板放入微孔板读板仪，于激发波长λex 535 nm、发射波长λem 590 nm处测定荧光。 
		注意：若样品中过氧化氢浓度较高，需增加样品稀释倍数或缩短孵育时间，以避免检测信号饱和。</li>
		<li>从所有样品中扣除空白值，绘制过氧化氢标准曲线，并根据该基线曲线定量未知样品中的过氧化氢浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等离子体处理亚硝酸盐的分析
	<ol>
		<li>在平底96孔板中，以100 µL PBS在三个重复样本中进行等离子体处理。</li>
		<li>通过将1 µL定量试剂加入99 µL双蒸水中，配制亚硝酸盐检测试剂主混合液（足够一个孔使用；根据需要相应放大）。</li>
		<li>向每个透明平底96孔板的孔中加入100 µL主混合液。根据所需孔数相应放大体积。</li>
		<li>在双蒸水中配制一系列亚硝酸盐标准品的稀释液。</li>
		<li>向96孔板的主混合液中加入10 µL标准品或样品。</li>
		<li>将板在室温下避光孵育10分钟。</li>
		<li>向每个孔中加入5 µL亚硝酸盐定量显色液。</li>
		<li>使用微孔板读板仪在激发波长λex 365 nm、发射波长λem 450 nm处读取荧光信号。</li>
		<li>从所有样品中扣除空白值，绘制亚硝酸盐标准曲线，并根据该基线曲线定量未知样品中的亚硝酸盐浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等离子体处理超氧阴离子的分析
	<ol>
		<li>在PBS中配制含氧化型细胞色素c（1 mg/mL）和过氧化氢酶（20 µg/mL）的主混合液。</li>
		<li>向透明平底96孔板的各孔中加入100 µL主混合液。</li>
		<li>在每种处理条件下，对主混合液进行等离子体处理，设三个重复。</li>
		<li>使用微孔板读板仪在550 nm处测定吸光度，并绘制数据图。</li>
		<li>利用细胞色素c的摩尔消光系数及孔内液体的光程长度，计算生成的超氧阴离子量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞暴露于等离子体后的生物学响应
<ol>
	<li>等离子体处理细胞的多维读出：代谢活性
	<ol>
		<li>所有后续操作均需在层流罩中进行。</li>
		<li>将 104 个细胞（B16 小鼠黑色素瘤细胞）接种于平底 96 孔板中，每孔加入 100 µL 完全补充的细胞培养基。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C、含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中过夜，使其充分贴壁。</li>
		<li>使用 xyz 平台按照预设方案对孔内细胞进行等离子体或仅气体处理，随后将细胞放回培养箱继续培养 20 小时。 
		注意：如需分析胞外产物，可在 20 小时后收集上清液；之后每孔补加 100 µL 新鲜培养基。</li>
		<li>向每孔加入 25 µL 含 500 µM resazurin 的细胞培养基（终浓度为 100 µM）；另设三孔仅含 resazurin 而无细胞的培养基作为背景对照，用于背景荧光扣除。</li>
		<li>在培养箱中孵育 3 小时。</li>
		<li>使用酶标仪在激发波长 λex 535 nm、发射波长 λem 590 nm 条件下检测荧光强度。</li>
		<li>从所有样本中扣除背景荧光，并将数据归一化至对照组数值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等离子体处理细胞的多维读出：图像分析
	<ol>
		<li>取自步骤 3.1.7 的培养板，弃去上清液。</li>
		<li>每孔加入 100 µL 含 1 µg/mL 碘化丙啶（propidium iodide）的新鲜细胞培养基。</li>
		<li>将培养板置于配备电动载物台的显微镜下，对每个孔进行成像。 
		注意：成像参数取决于具体实验目的；本实验中使用高内涵成像系统，采用 20X 物镜，在明场、数字相差以及荧光（碘化丙啶）通道下，对每个孔采集 3×3 视场图像，并使用适当的激发光源和发射滤光片。</li>
		<li>使用定量图像分析软件，测定每个孔所有视场的数字相差图像中的总胞质面积。 
		注意：可根据需要进一步分析其他参数，例如活细胞和/或死细胞数量，或利用特异性染料检测线粒体活性。若使用本研究未描述的其他染料，需确保显微镜所用荧光染料的光谱不与后续流式细胞术实验中使用的荧光染料发生重叠。</li>
		<li>绘制数据图表，如有需要，可检验其与代谢活性测定结果之间的相关性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等离子体处理细胞的多维读出：流式细胞术
	<ol>
		<li>本分析使用步骤 3.2.5 中的培养板。</li>
		<li>弃去上清液，用含钙（0.9 mM）和镁（0.5 mM）的 PBS 溶液清洗两次，每次 200 µL。 
		注意：如需进行本研究未涵盖的其他生物学检测（如细胞内抗原染色或细胞周期分析），可在该阶段对细胞进行固定和/或通透处理。</li>
		<li>向每孔加入 50 µL 含钙和镁的 PBS 溶液，其中包含 50 ng/mL 抗小鼠钙网蛋白（calreticulin）单克隆抗体。</li>
		<li>在培养箱中孵育 15 分钟。</li>
		<li>用 200 µL 完全补充的细胞培养基清洗两次，并弃去孔内液体。</li>
		<li>每孔加入 100 µL 细胞解离溶液，在培养箱中孵育 20 分钟。</li>
		<li>使用另一组未染色的悬浮 B16 细胞设置流式细胞术采集参数，包括设门策略以及光电探测器的增益和电压。</li>
		<li>将培养板载入配备自动进样器的流式细胞仪中。</li>
		<li>采集前向散射和侧向散射图中通常对应于活细胞的群体，至少获取 1,000 个细胞。</li>
		<li>使用专用于流式细胞术数据分析的软件打开 .fcs 文件，设门圈定目标细胞群，并测定钙网蛋白的平均荧光强度。</li>
		<li>绘制数据图表，如有需要，可检验其与代谢活性、成像结果和/或氧化物沉积量测定值之间的相关性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基础研究对于理解等离子体医学在临床前和临床研究中的有效性及其作用机制至关重要。基础研究还推动了对新型治疗方法的探索。尽管已明确等离子体主要通过产生活性氧和活性氮物种介导其生物学效应19，但该领域仍面临三大主要挑战。第一，哪些物种起关键作用？这一问题可通过调节等离子体的进气气体成分，并结合光学诊断与生物学检测手段部分解答20。第二，在细胞等生物靶标中可观察到哪些效应？这一问题至少在一定程度上可通过细胞培养实验和多种检测方法加以研究。在真核细胞中，这些效应具有多效性，包括细胞周期阻滞21、凋亡22、坏死23以及皮肤细胞的刺激作用24,25,26，同时还可能促进或抑制细胞迁移能力或代谢活性27,28,29。第三个挑战与上述多效性效应相关，即识别决定细胞对等离子体源性氧化剂产生响应的关键分子，以解释不同细胞类型中常观察到的不同效应。这可通过组学技术30,31,32，以及利用siRNA、氧化还原信号通路抑制剂、抗氧化剂和抗氧化酶对靶基因进行上调或下调，并结合调控等离子体活性物种的输出来实现33,34,35。因此，亟需建立标准化的检测流程，以支持对大量样本进行高通量重复实验。
本研究展示了一种高效的实验工作流程，从物理学延伸到生物学，以应对上述挑战，适用于等离子体医学研究。有关等离子体源及等离子体生成的工程细节此前已有描述36,37,38。所有这些检测均在96孔板中进行，具有多项优势。例如，可轻松将细胞培养上清液等样品从一个检测转移至收集板，以通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测蛋白质浓度。若具备可直接读取96孔板数据的科研设备，则该方法可降低每个样品的成本和人工操作时间，并通过从同一样品中并行开展多种检测而最大化检测结果。使用多通道移液器还可进一步加快样品处理速度。原则上，此处所述检测也可采用孔径更大的孔板规格进行，但后续检测将需要额外的移液步骤，将样品转移至其他离心管或容器中。然而，孔数更多、孔径更小的板型（如384孔板）并不适用于使用大流量进气喷射装置的生物医学等离子体研究，因为无法保证处理过程中仅单个孔被影响，而相邻孔不受干扰。
液体分析对于研究等离子体诱导的物种沉积至关重要。在专业分析中，通过并行设置多种检测方法，可同时表征经等离子体处理的液体中不同氧化性物质的含量。这种多重检测方法有助于全面揭示等离子体来源的活性物种。所描述的方法对过氧化氢浓度具有高度敏感性39，尽管这通常是必要的，但并不总能充分解释等离子体效应40,41,42。生物相关的效应也可通过未包含在此处的谷胱甘肽检测在液体中进行评估43。由于灵敏度高出10倍（数据未显示），建议优先采用特异性亚硝酸盐检测而非传统的Griess检测法。经等离子体处理的液体还可通过DTNB检测法检测次氯酸的生成。然而，先前的研究结果并未表明使用我们的等离子体源会产生该类物质19,39,44。等离子体处理结束后，活性物种会随时间逐渐降解。亚硝酸盐会转化为硝酸盐，过氧化物也会随时间被消耗。然而，这些过程通常需要数小时35。细胞色素c的吸光度在数小时内也保持稳定。因此，若相关过程发生在处理后的前30分钟内，则此处所述长寿命物种的浓度变化可忽略不计。然而，在检测某些类型的培养基（例如，Dulbecco改良Eagle培养基）时需格外注意，因其成分可在1小时内清除高达90%的过氧化氢（数据未显示），从而导致对等离子体向液体中沉积过氧化物的低估。
本文介绍了一种多重检测方法，可用于研究细胞的代谢活性、细胞面积（形态学）以及细胞表面标志物表达等多个方面。结合使用这些检测方法可揭示出有趣的结果。例如，我们先前在THP1单核细胞中已表明，经等离子体处理后，细胞代谢活性和细胞数量的下降并非呈线性关系45。相反，随着等离子体处理时间的延长，观察到细胞体积增大且线粒体质量增加，从而导致单个细胞的代谢速率升高。本质上，多孔板读数仪、显微镜和流式细胞术的联合使用，可对等离子体处理后的细胞反应提供多维度的信息。在黑色素瘤细胞中，我们重点关注由钙网蛋白介导的细胞毒性效应及其免疫原性46。原则上，该方法还可用于将代谢活性与成像及流式细胞术结果关联起来，以回答许多其他科学问题。例如，可对经等离子体处理的细胞进一步研究细胞分化（例如 巨噬细胞极化）、线粒体膜电位、细胞周期分析、细胞运动性、生物力学特性或微核形成（用于遗传毒性分析）。多色流式细胞术还可同时在不同细胞群体中拓展更多应用，包括信号通路蛋白（如转录因子）的磷酸化状态分析、mRNA定量、细胞内细胞因子检测，以及单细胞水平上总还原型硫醇的评估。每份样本所获得的额外生物学相关信息，有助于进一步阐明等离子体氧化还原效应，从而更好地理解当前及未来等离子体的应用前景。

活性物质是包括异常伤口愈合1和癌症2在内的多种疾病的重要的氧化还原调节因子。重要的是，这些物质既参与疾病的发生发展，也参与其治疗过程中的缓解机制3,4。冷物理等离子体是一种可释放多种活性物质的电离气体5。自能够在体温条件下运行的所谓冷等离子体技术问世以来6，冷等离子体已可安全应用于细胞和组织而不会造成热损伤。通过在临床前和临床观察中验证等离子体设备的有效性和安全性，已有三种设备在德国获得医疗器械认证7。特别是关于基因毒性安全性方面，多项研究已证实，使用第一种设备——常压氩气等离子体射流——不会引发致突变事件8,9,10。另外两种设备为所谓的介质阻挡放电（DBD）装置，其工作原理与等离子体射流不同。具体而言，射流型设备适用于表面和腔隙的手术刀式精细处理，而DBD等离子体则更适用于较大面积且相对平坦的组织区域的处理。该技术旨在利用细胞内的氧化还原信号通路11，将等离子体产生的活性物质应用于生物医学领域12。临床等离子体治疗中一个极具前景的应用方向是促进伤口愈合13,14,15。此外，研究还表明等离子体在动物模型中具有抗肿瘤作用16,17,18。
在验证血浆应用在动物模型甚至人体中的有效性和安全性之前，必须使用血浆设备开展标准化的体外研究。这些实验对于探索血浆的应用以及阐明其作用机制至关重要。此外，基础研究还有助于理解活性物质组成及其后续生物学效应的影响。本研究展示了如何将血浆整合到生物医学研究中，以更深入地理解并控制其对细胞的作用。文中描述了调节进气气体成分、监测活性物质输出、将血浆应用于液体、细胞和组织，以及由此产生的化学和生物学结果。此外，还提供了有关血浆处理标准化及下游生物学检测方法的示例，重点介绍了在96孔板中进行的血浆医学研究。该方法具有明显优势：i）可最大限度减少每种实验条件下所需的细胞数量、试剂成本以及每个样本的操作时间；ii）便于设置重复或三重复处理，从而提高实验结果的准确性；iii）便于在96孔板格式的酶标仪、成像和流式细胞术实验中无缝进行后续检测。

<table><tbody><tr><td>accutase</td><td>BioLegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed 检测试剂盒（包含辣根过氧化物酶和 H2O2）</td><td>Thermo</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>氩气</td><td>Air Liquide</td><td>N50</td><td></td></tr><tr><td>B16F10 小鼠黑色素瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C30</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养孵育箱</td><td>Binder</td><td>CB210</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养塑料器皿</td><td>NUNC</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>细胞色素 c（氧化型）</td><td>Sigma</td><td>C2037</td><td></td></tr><tr><td>数据分析</td><td>GraphPad 软件</td><td>Prism 7.03</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td></td><td>经批次检测</td></tr><tr><td>精密天平</td><td></td><td></td><td>分辨率可达 0.01 mg 的任意型号</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CytoFlex S</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术数据分析</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Kaluza 1.5a</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>成像定量分析软件</td><td>PerkinElmer</td><td>Harmony 4.5</td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>Thermo</td><td>Maxisafe 2020</td><td></td></tr><tr><td>质量流量控制器</td><td>MKS</td><td>G系列</td><td></td></tr><tr><td>Measure-iT 亚硝酸盐检测试剂盒</td><td>Thermo</td><td>M36051</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>PerkinElmer</td><td>Operetta CLS</td><td></td></tr><tr><td>光学发射光谱仪</td><td>Avantes</td><td>AvaSpec-DDDD-2-USB2</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf/Brand</td><td>单通道/多通道</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Tecan</td><td>M200pro</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr><tr><td>刃天青</td><td>VWR</td><td>B21187.06</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 细胞培养基</td><td>PanbioTech</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>xyz 位移平台</td><td>CNC step</td><td>HIGH-Z S-400/T&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

等离子体医学中的基础研究——从液体到细胞的高通量方法

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

在等离子体医学中，将温度接近脊椎动物系统的电离气体应用于细胞和组织。冷等离子体可产生活性物质，这些物质已知能够通过氧化还原调控健康和疾病状态下的生物学过程。临床前和临床证据表明，等离子体治疗在皮肤慢性溃疡愈合中具有有益作用。其他新兴研究方向，如等离子体癌症治疗，也正受到越来越多的关注。等离子体医学研究需要物理学、化学和生物医学等多学科的专业知识。等离子体研究的一个目标是表征在多种特定应用中经等离子体处理的细胞。这包括例如细胞计数与活力、细胞氧化状态、线粒体活性、细胞毒性及细胞死亡方式、细胞周期分析、细胞表面标志物表达以及细胞因子释放等指标。本研究描述了开展等离子体生物医学研究所需的基本设备和工作流程。文中介绍了常压氩气等离子体射流的正确操作方法，特别是监测其基本发射光谱和进气参数设置，以调控活性物质的输出。利用高精度xyz位移台和计算机软件，可将等离子体射流以微米级精度悬停于96孔板各孔上方，并实现毫秒级时间控制，以确保最大可重复性。文中展示了对液体中氧化还原活性分子进行分析的后续检测方法，并对靶细胞进行了等离子体处理。具体而言，对黑色素瘤细胞采用一系列高效连续检测方法（使用同一批细胞）进行分析：代谢活性测定、总细胞面积测定，以及钙网蛋白表面标志物表达检测——钙网蛋白是癌细胞免疫原性死亡过程中的关键分子。这些检测方法可从单个培养板中获取丰富的生物学信息，全面反映等离子体的作用效应。总体而言，本研究系统阐述了等离子体医学研究所需的关键步骤和实验方案。

本研究描述了一种针对血浆效应的医学研究简化工作流程。该多学科方法分析了等离子体射流的基本光发射谱、液体中的主要活性成分，以及经等离子体处理后细胞的生物学反应（图1）。
为了实施该工作流程，需要多个组件以正确设置等离子体源（图2）。不同气体（此处主要为氩气、氧气和氮气）由多个质量流量控制器供给并进行控制。通过一个中央控制面板，可对质量流量控制器进行数字化调节，以设定预设的进气流量。为了获得特定的进气气体组成，利用一个阀门面板将来自多个质量流量控制器的气体进行物理混合（图2A）。启动等离子体源后，将等离子体射流输出端置于一台USB光谱光度计（图2B）前方，该仪器的光学检测范围为200 nm至1,000 nm。在液体和细胞处理方面，采用96孔板描述了一种高效的工作流程。多孔板通过一个塑料支架固定，该支架通过与底板上预设孔位相匹配的插销固定在基板上（图2C）。整个装置置于超净工作台内（图2D）。该系统包含一个xyz三维移动平台，手持式等离子体喷枪安装于其上。若工作台具备足够大的线缆通孔，则电机控制元件可置于工作台外部。重要的是，该平台由计算机控制，可编程设定喷枪以微米级精度在每个孔的中心上方停留指定时间。此外，起始位置（如本实验设置中的A1孔）可自由选择（图2E）。结合塑料板支架，该配置实现了可重复的等离子体处理，日常差异仅来源于液体和生物学实验本身的设置差异。
采用光发射光谱法（OES）检测不同进气条件下与活性等离子体组分相关的特征峰（图3A）。例如，氮气的第二正带系在330 nm至380 nm范围内的峰代表活性氮物种，而309 nm处的峰代表羟基自由基（图3A中的箭头）。与单独使用氩气相比，当进气中加入氮气时，活性氮物种的信号增强；而加入氧气或湿度则分别导致其信号减弱或降低。相比之下，羟基自由基的信号在加入氧气或氮气时减少，但当使用加湿氩气作为进气时则显著增加。在对液体进行等离子体处理时，首先测定了氩气和氩等离子体引起的蒸发效应（图3B）。重要的是，这两种条件并未产生相似的结果，因为等离子体还会对温度产生影响。与羟基自由基的OES结果一致，过氧化氢的沉积量在加入氧气或氮气时显著减少，而在使用加湿进气时则增加（图3C）。此外，与仅使用氩等离子体处理的液体相比，向进气中添加氮气显著提高了亚硝酸盐浓度（图3D）。该工作流程也可用于研究等离子体对不同成分液体的影响。例如，在PBS和RPMI1640细胞培养基中，过氧化氢浓度似乎不受胎牛血清存在的影响（图3E）。在同一组样品中，与不含血清的对照组相比，血清的存在降低了PBS和细胞培养基中的亚硝酸盐浓度（图3F）。超氧阴离子主要在干燥氩气条件下产生，而加入氧气和/或氮气会显著抑制超氧阴离子的生成，但加湿的氩-氧等离子体除外（图3G）。
对于多孔板中细胞的等离子体处理，将前一天接种细胞的培养板从培养箱中取出，并放入塑料支架中。应用预设的处理程序，补偿蒸发损失后，将培养板放回培养箱中继续孵育20小时。需注意，孵育结束后，可将细胞培养上清液收集至新的空96孔板中，并于-80 °C保存，用于后续目标蛋白的检测。随后，向每孔细胞中加入刃天青（resazurin）。非荧光性的刃天青转化为荧光性的试卤灵（resorufin）仅由具有活性的NADPH生成酶催化完成，其转化程度与细胞整体代谢活性呈正相关（图4A）。荧光强度结果与肉眼观察的培养板状态一致，表明长时间等离子体处理具有细胞毒性效应（图4B）。加湿气体条件下的处理比干燥气体条件更具损伤性。同一批培养板中的细胞被用于后续下游实验。对培养板中的细胞进行显微镜观察（图4C）。利用成像软件，对多个孔进行定性比较分析（图4D）。该软件可量化各孔视野中细胞所占的总面积，并将所得数据相对于对照组进行归一化处理（图4E）。在等离子体处理组中观察到细胞总面积减少，尤其在加湿进气条件下更为明显。成像后，细胞经洗涤，使用抗小鼠钙网蛋白（calreticulin）抗体染色，消化脱离后进行流式细胞术分析（图4F）。计算并比较各组样品中活细胞的钙网蛋白染色平均荧光强度（图4G）（图4H）。等离子体处理诱导小鼠黑色素瘤细胞表面钙网蛋白表达上调，且在干燥进气条件下，上调程度随处理时间延长而增加。而在加湿进气条件下，20秒和40秒的处理诱导的钙网蛋白暴露强于更具杀伤性的60秒处理。这表明钙网蛋白的暴露水平与递送至细胞的氧化剂总量之间存在非线性调控关系。
<img alt="等离子体光谱示意图；进气混合；细胞功能；活性成分分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：从物理学到生物学的等离子体医学研究工作流程。通过调节进气气体来调控常压氩等离子体射流产生的活性物质输出。利用光谱技术监测等离子体气相中的特定分子。使用等离子体处理液体，并研究氧化剂的沉积情况。在微孔板中培养的细胞接受等离子体处理，并进行生物学检测。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="配备气体供应、等离子体射流、96孔板和计算机控制的光发射光谱系统示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：等离子体实验平台的装置示意图。（A）多种气体通过不锈钢管道导入多个质量流量控制器，由中央控制面板进行调控。随后通过阀门面板混合各路进气气体组分。（B）可利用光发射光谱监测等离子体中的部分活性组分，以研究不同进气气体组分之间的差异。（C）为实现高通量等离子体研究，采用96孔微孔板。为确保程序化和自动化等离子体处理具有恒定的起始条件，将微孔板装入一个固定框架中，以保证每日实验时微孔板的绝对位置一致。（D）等离子体射流固定于层流罩下方的计算机控制xyz位移台上。所有96个精确位置及等离子体在每孔上方的停留时间均写入程序文件，用于引导等离子体源的运动。等离子体射流装置的主外壳及电机控制器均就近安置。（E）96孔板的自动化等离子体处理过程。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="等离子体气体分析图，显示光子计数、蒸发速率和化学浓度数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3等离子体射流与液体分析 (A) 显示了不同进气条件下光学发射光谱的结果。氮气的第二正带系统（330 nm 至 380 nm）在添加氮气时增强，在添加氧气时消失，而在湿化氩气条件下显著减弱（左侧面板）。羟基自由基在 309 nm 处的峰（箭头）在氮气和氧气条件下减弱，但与纯氩气相比，在湿化氩气条件下显著增强。B液体暴露于气体中会导致蒸发。通过使用精密天平称量96孔板在等离子体和单独氩气处理前后的重量，确定了每孔的蒸发量。等离子体处理样品中的蒸发量高于氩气处理样品中的蒸发量。C等离子体处理液体中过氧化氢的生成在一定程度上与（A）中羟基自由基在309 nm处的峰相关。加湿（5%）氩等离子体使过氧化氢浓度增加约4倍。D) 当向进料气体中添加氮气时，亚硝酸盐含量升高，且在使用加湿氩等离子体时该效应增强。添加氧气可减少亚硝酸盐的生成，但降低幅度不显著。E, F过氧化氢和亚硝酸盐浓度显示于不同类型的液体中，即含胎牛血清（R10F）和不含胎牛血清（R0F）的RPMI1640细胞培养基，以及含或不含胎牛血清（FCS）的PBS。不同培养基之间的过氧化物水平无显著差异E而亚硝酸盐水平在血清存在时显著降低。G) 超氧阴离子的生成在使用干燥氩气作为进气时最高；加入氮气、氧气或湿化氩气后，液体中沉积的超氧阴离子减少。所示数据（B-G) 是两到三次实验的平均值±标准误。统计分析已进行（C，D) 采用单因素方差分析，将干燥或湿润进气条件下的全组均值与各自对照组进行比较（** p &lt;0.01；*** p &lt;0.001）。此外，采用整个组的均值并结合t检验对仅使用氩气等离子体的条件进行了比较（### p &lt;0.001）。进一步的统计分析（F）采用 t 检验，比较含 FCS 与不含 FCS 样品中各等离子体处理组与培养基条件的数值（* p &lt;0.05；** p &lt;0.01）；此外，使用t检验比较了每种血浆处理时间下含FCS与不含FCS的溶液（# p &lt;0.05；## p &lt;0.001). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微孔板荧光检测；柱状图；流式细胞仪设置；气体等离子体处理；细胞活力。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：等离子体处理及其对细胞的影响。（A）细胞接受等离子体处理后，20 小时加入刃天青以评估代谢活性。（B）与气体对照组相比，经等离子体处理的样本活性显著降低。在载气加湿条件下活性下降更为明显，而在干燥和加湿的氩气条件下，添加氧气和/或氮气均导致毒性效应。（C）加入含碘化丙啶（PI）的培养基。（D）图示为微孔板各孔的概览，其中数字相位对比图像（橙色）代表每个细胞的胞质区域，PI（绿色）用于识别死亡细胞。成像工具可量化每个孔视野范围内被细胞覆盖的总面积。（F）随后将细胞洗涤，并与抗体或其他细胞标志物孵育，以通过流式细胞术表征等离子体的生物学效应。（G）采用设门策略进行标志物分析，并在不同样本间进行比较。所展示的数据（B, E, H）表示三次独立实验中一次的代表性结果，误差条表示均值 ± 标准误（SEM）。比例尺 = 200 µm（D）。采用双因素方差分析进行统计学比较（B, H），针对每种气体条件，将每种等离子体处理组与其相应的气体对照组进行比较（* p &lt;0.05；** p &lt;0.01；*** p &lt;0.001）。此外，分别对干燥和加湿条件下氮气和/或氧气混合组的数值与纯氩气等离子体组的数值进行双因素方差分析比较（### p &lt;0.001）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

展示了一种高通量的液体与细胞冷物理等离子体处理方案。该方案包括设置不同的进气气体组分以实现等离子体点火，测量等离子体的发射光谱，以及对经等离子体处理后的液体和细胞活性进行后续分析。

在等离子体医学中，将温度接近脊椎动物系统的电离气体应用于细胞和组织。冷等离子体产生活性……

这些基于多孔板的序列检测方法的总体目标是，通过光学发射光谱、液体分析以及细胞活性检测、显微镜观察和流式细胞术分析，更深入地理解冷物理等离子体产生的氧化剂对体外生物反应的影响。该方法有助于解答等离子体医学领域中的关键问题，特别是关于由等离子体产生的活性物质在诱导免疫原性癌细胞死亡中的重要作用。该技术的主要优势在于其半自动化操作流程。该技术采用96孔板，以提高研究的速度和效率。该方法的应用前景可拓展至未来的等离子体治疗领域，例如皮肤病学或肿瘤学。此外，该技术能够鉴定出与生物响应相关的等离子体衍生活性物质。演示该实验操作的是本实验室的技术员 Felix Niessner。进行等离子体物种监测时，将大气压等离子体射流置于光学发射光谱仪前方，使其与羽流轴线垂直，并使用专用软件记录在每分钟两标准升进气流量条件下，每种气体状态的光发射强度及其波长。对于等离子体处理后的超氧化物分析，请为 XYZ 平台设置最终实验方案，明确相应的处理时间及孔位。然后，将100 µL新配制的预混液以每孔三个复孔的方式加入透明平底96孔板的孔中，并使用酶标仪在550 nm处测定吸光度。为了分析等离子体处理对细胞代谢反应的影响，在超净工作台中，将1×10⁴个目标细胞接种于含100 µL完全培养基的平底96孔板中，每孔接种量为100 µL，过夜培养。在细胞培养箱中过夜培养后，使用XYZ载物台根据实验设计对孔板施加等离子体处理或仅气体处理，随后将细胞放回培养箱继续培养20小时。第二次孵育结束时，向细胞以及三个仅含刃天青的背景对照孔中各加入25微升新鲜细胞培养基，培养基中需添加500微摩尔刃天青。将细胞放回孵育箱，继续孵育3小时。随后，在酶标仪中检测荧光信号。对于等离子体处理细胞的成像，在读取荧光信号后，将上清液更换为100微升新鲜细胞培养基，其中添加1微克/毫升的碘化丙啶。将培养板置于电动显微镜载物台上，选择20倍物镜对细胞进行成像。然后，使用适当的定量图像分析软件，基于每个孔中所有视野的数字相差图像，确定总的细胞质面积。对于等离子体处理细胞的流式细胞术分析，在成像后，用200微升含钙和镁的PBS溶液洗涤每孔细胞两次，每次洗涤后在50微升含钙和镁的PBS中加入15微克/毫升的抗小鼠钙网蛋白单克隆抗体进行标记，每孔加入50微升。在细胞培养箱中孵育15分钟后，用200微升完全细胞培养基将细胞洗涤两次，每孔加入100微升细胞解离溶液，在37摄氏度下作用20分钟。当细胞完全解离后，将培养板置于流式细胞仪上，获取前向散射和侧向散射群体中至少1,000个事件，该群体通常对应于活细胞。然后，使用适当的流式细胞术分析软件对目标细胞群进行设门，并确定钙网蛋白表达的平均荧光强度。光学发射光谱可用于监测在不同进气条件下与活性等离子体组分相关的特征峰。对于液体的等离子体处理，需首先确定氩气及氩等离子体引起的蒸发情况，不同条件会导致不同的蒸发结果，因为等离子体也会对温度产生影响。与羟基自由基的光发射光谱结果类似，加入氧气或氮气会显著降低过氧化氢的沉积量，而使用加湿的进气气体则会增加过氧化氢的沉积。此外，与氩等离子体处理的液体相比，向进气气体中添加氮气会导致硝酸盐浓度显著升高。超氧阴离子主要在干燥的氩气条件下产生，而加入氧气和/或氮气会显著抑制超氧阴离子的生成，但在加湿的氩气-氧气等离子体条件下除外。Resazurin 和等离子体处理细胞的荧光强度与细胞培养上清液中肉眼观察到的物理变化相似，证实了长时间等离子体处理的细胞毒性作用。在等离子体处理的样品孔中也观察到总细胞面积减少，尤其是在加湿进气条件下，miren 黑色素瘤细胞上的钙网蛋白染色总体上调，这是对较短时间等离子体处理的响应。若操作得当，mytoplex 细胞检测及其读数可在数小时内完成。在完成该操作步骤后，还可进行其他方法，例如与免疫细胞的共培养，或对细胞培养上清液的分析。这有助于回答有关DAMPs、细胞因子或氧化还原蛋白的释放，以及经等离子体处理的黑色素瘤细胞被免疫系统识别的相关问题。该技术建立后，为进一步研究黑色素瘤细胞周期铺平了道路，例如利用三维肿瘤球体进行研究。观看本视频后，您应能充分理解如何开展等离子体医学的基础研究，从等离子体气相、活性分子与液体，到黑色素瘤细胞中的生物学响应。

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