Name: Purificazione di DNA virale per lidentificazione delle proteine virali e cellulari associate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri la purificazione del DNA di Herpes Simplex virus tipo 1 dalle cellule infette per analisi proteomica delle proteine associate al genoma virale. Questo metodo rivela il ruolo dei fattori cellulari nell'infezione.

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Riconosciamo Hannah Fox per aiuto nella preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIH concedere R01AI030612.

1. colture cellulari, infezione virale e l'EdC etichettatura ( Figura 1) il seguente protocollo coinvolge funzionare con virus. Fare riferimento al proprio Istituto &#39; protocolli di biosicurezza di s per quanto riguarda la manipolazione sicura di virus e altri agenti biologici. Questo protocollo è stato approvato da Institutional Review Board dell'Università di Pittsburgh.
<ol><li>Tripsinizzano un pallone di coltura tissutale 2 cm 150 confluenti di cellule MRC-5 e trasferire le cellule ad una piastra di coltura del tessuto di 2 600 cm contenente 100 mL DMEM con 10% FBS. Incubare a 37 ° C in presenza di 5% CO 2 per 3-4 giorni per raggiungere la fase stazionaria ed confluenza. Un piatto di 2 cm 600 confluenti contiene ~ 7 x 10 7 cellule. Preparare 1 piastra per ogni condizione e 1 piatto per ogni controllo negativo corrispondente. 
	Nota: Le cellule devono raggiungere la fase stazionaria per inibire la replicazione del DNA cellulare per garantire che solo vDNA viene etichettato e purificata nei passaggi successivi. 
	Nota: Ogni campione richiede un accesso senza etichetta di controllo negativo, preparato con le stesse condizioni di infezione e il punto di tempo senza l'aggiunta di EdC. 
	Nota: Una versione ridimensionata di questo esperimento dovrebbe essere effettuata in tandem per testare per l'etichettatura del DNA cellulare da formazione immagine usando crescita cellulare paragonabile, infezione, EdC condizioni, di etichettatura e intervalli di tempo (vedi passo 2).</li>
	<li>Diluire 7 x 10 8 PFU HSV-1 in 7 mL di freddo Buffered Saline (TBS). Rimuovere il mezzo di crescita e conservare a 37 ° C. Per infettare, aggiungere 7-mL diluito virus alle cellule MRC-5 e rock per 1 h a temperatura ambiente. A seguito di adsorbimento, rimuovere inoculo, sciacquare con temperatura ambiente 50 mL TBS e sostituire il mezzo di crescita originale. Incubare a 37 ° C in presenza di 5% CO 2. Questo passaggio deve essere effettuato per ogni condizione sperimentale ed il controllo negativo. 
	Nota: Maggiore EdC etichettatura possa essere acquisito utilizzando HSV-1 mutanti difettosi per l'espressione del dUTPase virale (gene UL50) e/o uracile glicosilasi (gene UL2). HSV-1 dUTPase ha specificità di substrato basso e può fare diminuire l'attivazione di alcuni inibitori nucleosidici analoghi 25 , 27.</li>
	<li>Genomi virali di etichetta con EdC. Seguire le indicazioni per etichettare in arrivo genomi (1.3.1.), la replica di genomi (1.3.2.), o forche di replicazione virale (1.3.3.). 
	Nota: Solo un passo 1.3.1, 1.3.2 o 1.3.3 deve avvenire, a seconda se in arrivo genomi, genomi replicati o forcelle replica devono essere analizzati nei passaggi successivi, rispettivamente. 
	Nota: EdU o f-ara EdU può essere sostituito per EdC. La tossicità di analoghi nucleosidici deve essere monitorata e ridotto al minimo.
	<ol><li>Uso prelabeled scorte per realizzare l'infezione nel punto 1.2 e procedere al passaggio 2 o 3 all'interno di 4 h post infezione (hpi) per studiare non replicata vDNA ( Figura 1A). 
		Nota: Preparare prelabeled virus scorte utilizzando il protocollo descritto in precedenza 25. Stock di virus deve essere passato attraverso una colonna di G-25 per rimuovere qualsiasi residuo EdC.</li>
		<li>Etichetta replicante vDNA aggiungendo 5-25 µM EdC al terreno di coltura delle cellule delle cellule infettate per 2-4 h ( Figura 1B). Prima di aggiungere, diluire EdC in 1 mL di terreno di coltura.</li>
		<li>Per etichettare le forcelle di replicazione virale, dopo l'inizio della replica vDNA (&#8805; 4 hpi), etichetta di impulso replica vDNA con 5-25 µM EdC per 5-20 min. Per inseguire, sciacquare 3 x con mezzo di chase contenente 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) e poi incubare in presenza di medium di chase per altri 20-40 min ( Figura 1). 
		Nota: Pulse e chase medio dovrebbe essere equilibrato al 37 ° C e 5% CO 2 prima dell'uso. 
		Nota: Per esperimenti di pulse chase, è importante considerare la quantità di tempo che necessaria per nucleosidi entrare nella cellula ed essere fosforilato prima che queste possano essere incorporate nella replica del DNA. Questo deve essere determinato empiricamente. 
		Nota: Per determinare la risoluzione di esperimenti di pulse chase, calcolare il tasso di replicazione virale nelle circostanze sperimentali utilizzati. Questo può essere determinato mediante PCR quantitativa di genomi virali durante un singolo passaggio crescita tempo corso 26. 
		Nota: Per l'imaging di genomi virali procedere al passaggio 2 e per la purificazione di genomi virali, procedere al passaggio 3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Formazione immagine di EdC DNA ( Figura 2A) contrassegnato Nota: è utile effettuare imaging in tandem con il metodo di purificazione del genoma virale per verificare che il DNA cellulare non è etichettato in esperimenti. La formazione immagine può essere utilizzata anche per visualizzare la natura di vDNA con etichetta e per convalidare i dati di proteomica. Esempi di DNA virale e cellulare modelli di macchiatura sono mostrati nella Figura 3.
<ol><li>Svolgere infezioni ed EdC etichettatura come indicato nel passaggio 1, ad eccezione di utilizzando ridimensionato condizioni sulle lamelle in un piatto di coltura del tessuto 12-pozzetti contenente 1 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Fix cellule con 1 mL 3,7% paraformaldeide in PBS 1X per 15 minuti a TA. Dopo la fissazione, risciacquo celle 2 volte con 1 mL 3% BSA in PBS. 
	Attenzione: Paraformaldeide può causare lesioni gravi o permanenti. Attenersi alle precauzioni di sicurezza. 
	Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e le lamelle possono essere memorizzate a 4 ° C nel secondo lavaggio per fino a 3 giorni.</li>
	<li>Permeabilize le cellule con 1 mL di tampone di permeabilizzazione [vedi Tabella materiali] per 20 min a temperatura ambiente mentre dondolo.</li>
	<li>Lavare con 1 mL di 3% BSA e quindi blocco con 1 mL 3% BSA in PBS per 30 min a temperatura ambiente mentre dondolo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL della reazione clicca cocktail [vedi Tabella materiali] alle lamelle di coniugare covalentemente Alexa Fluor 488 azoturo di EdC DNA contrassegnato. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti mentre a dondolo. Aspirare e lavare due volte con 1 mL di PBS.</li>
	<li>Macchia DNA cellulare con 1 mL di una diluizione di 1:2,000 di Hoechst in PBS per 30 min a temperatura ambiente mentre a dondolo. Aspirare e lavare due volte con 1 mL di PBS.</li>
	Immunofluorescenza indiretta <li>macchia con gli anticorpi primari e secondari secondo standard di protocolli 25. 
	Nota: VDNA con etichetta colocalizza con ICP8, ICP4 o UL42 ed etichettati cellular DNA colocalizza con macchia di Hoechst.</li>
	<li>Montare vetrini coprioggetti sui vetrini e immagine celle utilizzando un microscopio a fluorescenza. 
	Nota: I vetrini possono essere conservati a 4 ° C per diverse settimane.</li>
</ol> 3. Purificazione di vDNA e proteine associate Nota: diversi aspetti del presente protocollo sono stati adattati da Leung et al. 22 Nota: tutti i buffer e i reagenti devono essere refrigerati il ghiaccio prima dell'uso e tutti i passaggi devono essere effettuati sul ghiaccio se non diversamente indicato.
<ol><li>Raccogliere nuclei. 
	Nota: Prima di isolamento dei nuclei, formaldeide può essere utilizzato per crosslink proteine a DNA. Condizioni più rigorose di lavare quindi possono essere utilizzate durante la purificazione del DNA su perline rivestite con streptavidina. Per crcondizioni di osslinking e lavaggio vedere Sirbu et al. 21. <ol><li>sostituire crescita medio con 20 mL di tampone di estrazione di Nuclei (NEB) e incubare per 20 min a 4 ° C con occasionali a dondolo. I nuclei diventano visibili al microscopio.</li>
		<li>Raschiare i nuclei dalla piastra con un raschietto in cella e trasferire in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare per 10 min 2.500 x g a 4 ° C per a pellet di nuclei, scartare il surnatante. 
		Nota: Trypan blu colorazione può essere utilizzato per verificare l'isolamento dei nuclei da cellule.</li>
		<li>Delicatamente sloggiare la pallina nucleare in 10 mL di PBS, trasferirlo in una provetta conica 15 mL e pellet mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere PBS. 
		Nota: I Nuclei possono essere congelati e il protocollo può essere sospesa a questo punto. A tale scopo, Risospendere delicatamente la pallina nucleare in 500 µ l di congelamento nel buffer e incubare la provetta in un bagno di ghiaccio di etanolo/a secco. Memorizzare i nuclei congelati a-80 ° C. Prima dell'uso, scongelare i nuclei a temperatura ambiente, trasferire rapidamente di ghiaccio, aggiungere 10 mL di PBS, roccia delicatamente per mescolare, pellet mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C e rimuovere completamente PBS. I nuclei di congelamento può provocare ridotta resa.</li>
	</ol></li> <li>Covalentemente coniugato biotina-azoturo di EdC etichettato vDNA.
	<ol><li>Risospendere il pellet nucleare in reazione clicca 10ml mescolare [vedi Tabella materiali] pipettando delicatamente su e giù 5 volte con una pipetta da 10 mL. 
		Nota: È importante che i reagenti inclusi nella combinazione di reazione di clic vengono aggiunti nell'ordine indicato.</li>
		<li>Ruotare per 1h a 4 ° C. Durante la rotazione preparare e chill buffer B1, B2 e B3 [vedi Tabella materiali].</li>
		<li>Pellet nuclei mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere fare clic su mix di reazione e lavare la pallina delicatamente risospendere in 10 mL di PBS e centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere delicatamente la pallina nucleare in 1 mL di PBS e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,5 mL utilizzando un puntale di grande diametro. Pellet di nuclei mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere PBS e freeze flash in azoto liquido. 
		Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e nuclei congelati possono essere conservati a-80 ° C. gelo disgelo aiuta con conseguente lisi quindi è consigliabile che i nuclei essere flash congelati anche quando si procede a passo 3.3 nello stesso giorno.</li>
	</ol></li> <li>Lyse nuclei e il frammento di DNA.
	<ol><li>Scongelare i nuclei su ghiaccio e risospendere in 500 µ l di Buffer B1 pipettando su e giù. Incubare in ghiaccio per 45 min.</li>
		<li>Sonicate campioni 6 volte per 30 s ogni ampiezza 40% usando una sonda del microtip di 3 mm. Posizionare il campione sul ghiaccio per 30 s tra gli impulsi. Dopo sonicazione, campioni dovrebbero apparire chiaro, non nuvoloso. 
		Nota: Condizioni di sonicazione devono essere ottimizzate per sonicatori individuali. Per istruzioni dettagliate su come ottimizzare le condizioni di sonicazione riferirsi a Leung et al. 22.</li> <li>pellet detriti cellulari mediante centrifugazione a 14.000 x g per 10 min a 4 ° C. Il formato della pallina dovrebbe diminuire sostanzialmente. Filtrare il surnatante con colino di cella 100 µM e mantenere il flusso attraverso.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l tampone B2 per il surnatante filtrato. 900 µ l di questo esempio verrà utilizzato nel passaggio 3.4.2.</li>
		<li>Prendere una parte aliquota di ciascuna condizione per isolamento del DNA (50 µ l o 1/20th volume) e aggiungere 50 µ l 2 x soluzione SDS-bicarbonato [vedi Tabella materiali]. Procedere con il protocollo di isolamento del DNA (punto 3.6).</li>
		<li>Prendere una parte aliquota di ciascuna condizione per ingresso proteina (50 µ l o 1/20th volume) e aggiungere 50 µ l 2 x tampone di Laemmli, congelato in azoto liquido e conservare a -80 ° C. uso nel passaggio 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Bind biotinylated del DNA di streptavidina rivestito perline.
	<ol><li>Preparare Streptavidin T1 biglie magnetiche trasferendo 300 µ l di liquami tallone ad un tubo di microfuge 1,5 mL. Preparare una provetta di perline per campione. Lavare 3 volte con 1 mL di Buffer B2 su vortex per risospendere, applicando un magnete per separare le perline, e aspirando il tampone di lavaggio delle perle. 
		Nota: Ottimizzato vincolante il risultato di condizioni nel fondo minimo legame e resa ingrandita. È stato determinato sperimentalmente che biglie magnetiche Streptavidin T1 hanno una capacità di associazione significativamente maggiore rispetto dell'agarosi branelli, come pure altri branelli di streptavidina e meno sfondo vincolante di perle di streptavidina C1 ( Figura 4A ).</li>
		<li>Aggiungere 900 µ l di campione dal punto 3.3.4. ai branelli lavati e ruotare durante la notte a 4 ° C. 
		Nota: Non non perle di vortice, una volta che il campione viene aggiunto a loro. 
		Nota: Se gli importi significativi di DNA o proteine sono isolati nel controllo negativo senza etichetta, questo passaggio può essere ridotto da pernottamento a 4 h per ridurre rilegatura.</li>
	</ol></li> <li>Lavare perline ed eluire vDNA e proteine associate. 
	Nota: Si consiglia di utilizzare puntali con filtro per i passaggi rimanenti.
	<ol><li>Campioni di posto in una cremagliera del tubo magnetico microfuge, Rimuovi sovranatante, Risospendere delicatamente in 1 mL di Buffer B2, ruotare a 4 ° C per 5 min</li>
		<li>Ripetere tre volte il punto 3.5.1.</li>
		<li>Posizionare i campioni in una cremagliera del tubo magnetico microfuge, rimuovere il surnatante, risospendere in 1 mL di Buffer B3, delicatamente e ruotare a 4 ° C per 5 min.</li>
		<li>Miscela di microsfere di trasferire 100 µ l (volume di th 1/10) ad un nuovo tubo per isolamento del DNA associato. Applicare questo tubo al magnete, rimuovere il surnatante, risospendere perline in 100 µ l 1 x soluzione SDS-bicarbonato e procedere con il protocollo di isolamento del DNA (punto 3.6).</li>
		<li>Applicare il tubo contenente la miscela di microsfere di 900 µ l restante dal punto 3.5.3. al magnete, rimuovere il surnatante e risospendere perline in 50 µ l 2 x Laemmli buffer del campione per eluire complessi della DNA-proteina e proteina.</li>
		<li>Campioni di ebollizione a 95 ° C per 15 min, vortice, rapidamente nel microfuge e applicare il magnete. Trasferire l'eluato a un nuovo tubo, congelamento flash e conservare a -80 ° C. 
		Nota: Uso cap blocchi per garantire che i tubi non pop aprire durante la cottura. 
		Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e campioni possono essere conservati a-80 ° C per diverse settimane.</li>
		<li>Analizza campioni di proteine di Blue di Coomassie macchiatura, macchiarsi occidentale o spettrometria di massa di procedure standard 25. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4 e Figura 5. 
		Nota: Per determinare se il rendimento di proteina è sufficiente per la spettrometria di massa, 7,5 µ l di ogni campione viene utilizzato per l'analisi di macchiatura blu di Coomassie e 7,5 µ l per macchiarsi occidentale di un genoma virale rappresentanza associato la proteina (ICP4, ICP8 o UL42). Lo stesso volume di lisati dal passaggio 3.3.6. vengono eseguiti a fianco al controllo per i livelli della proteina di input. Il campione rimanente (35 µ l) viene poi analizzato dalla massa spettrometria come descritto in precedenza 25.</li>
	</ol></li> <li>Isolamento del DNA <ol><li>Incubare i campioni da passaggi 3.3.5. e 3.5.4. a 65 ° C per 4-16 h. Rimuovi il campione dai branelli magnetici, se necessario.</li>
		<li>Estrarre campioni con 150 µ l fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (PCI) e trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo.</li>
		<li>Estrarre la rimanente PCI con 100 µ l Tris-EDTA (TE) e aggiungere la fase acquosa ad un nuovo tubo.</li>
		<li>Estrarre campioni con 200 µ l cloroformio: alcool isoamilico (24:1).</li>
		<li>Purificare la fase acquosa utilizzando il Kit di purificazione di PCR secondo il produttore &#39; protocollo s. 
		Nota: L'indicatore di pH nel Buffer PB diventerà viola quando aggiunto al campione. Aggiungere 10 & n.181; PH di L 3m NaOAc 5.0 per diminuire il pH del campione.</li>
		<li>Concentrazione di DNA determinare utilizzando un fluorometro. 
		Nota: Questo protocollo produce in genere 100-400 ng associato a perlina del DNA. Nessun DNA dovrebbe essere rilevato nell'eluito del controllo negativo in cui EdC non è stato aggiunto al passaggio 1.3.</li>
		<li>DNA può essere conservato in un grippaggio del DNA basso tubo a 4 o - 20 ° C e può essere utilizzato per PCR in tempo reale o analisi di sequenziamento di throughput elevato.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo include più passaggi che, se non seguite con attenzione, possono provocare rese significativamente riduttrice della proteina o contaminazione con DNA cellulare. È fondamentale che cellule stazionarie sono utilizzate per tutti gli esperimenti per garantire che DNA cellulare non è etichettato e purificato. Questo può essere confermato dall'assenza di polimerasi del DNA cellulare del campione di proteine perché HSV-1 non utilizzare il cellulare DNA polimerasi per la sintesi di genoma. Durante EdC etichetta...

I virus hanno una limitata capacità di svolgere le funzioni essenziali e pertanto dipendono da fattori dell'ospite per facilitare gli aspetti critici dell'infezione compreso trasporto, replica, riparazione, ricombinazione ed espressione genica virale. Le attività di questi fattori dell'ospite sono spesso aumentate di proteine codificate virally. Inoltre, virus deve evitare il rilevamento e interferenze di risposte cellulari all'infezione virale. Di conseguenza, interazioni ospite virus dettano l'esito dell'infezione. Di fondamentale importanza è capire come virus alterano l'ambiente cellulare per adattare il macchinario cellulare per facilitare processi virali. Di particolare interesse è identificare i fattori e i processi agiscono sui genomi virali durante tutto il ciclo infettivo.
Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) è che una doppia elica del DNA virus che infetta una parte sostanziale della popolazione umana. Entro la prima ora di infezione, il genoma virale entra nel nucleo, dove una cascata ordinata dell'espressione genica virale ensues in coordinamento con virale del DNA (vDNA) replica1. Nel nucleo, genomi sono soggetti a regolazione epigenetica, sottoposti a riparazione e ricombinazione e sono confezionati in capsidi, tale che i primi virioni di progenie sono prodotte in meno di sei ore. La valutazione completa delle proteine del genoma virale associato durante tutto il corso dell'infezione getterà le basi per indagare i dettagli molecolari dei processi che agiscono sui genomi virali e forniranno la comprensione di quali fattori virali e cellulari sono coinvolti nelle varie fasi dell'infezione.
Metodi precedenti per l'indagine sui fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione virale includono purificazione di affinità delle proteine virali per l'analisi di proteine cellulari associati2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. questi saggi sono stati strumentali per l'identificazione di fattori cellulari coinvolti nella risposta antivirale ospite, così come modifica virale della cromatina, espressione genica, e riparazione del DNA. Tuttavia, è difficile da accertare se interazioni dipendono l'associazione con vDNA e proteomica solo consentono di comprendere le interazioni che si verificano in funzione di uno specifico fattore virale. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stato utilizzato per identificare dove specifiche proteine virali e cellulari legano al genoma virali10,11,12,13,14 , 15 e ibridazione in situ fluorescente (FISH) combinato con immunocitochimica ha permesso la visualizzazione dei fattori cellulari che colocalize con vDNA16,17,18, 19 , 20. queste analisi consentono analisi spazio e temporale. Tuttavia, le limitazioni comprendono la necessità per gli anticorpi altamente specifici, sensibilità limitata e la necessità di approfondimenti precedenti interazioni ospite di virus. Abbiamo pertanto sviluppato un metodo basato su iPOND (isolamento delle proteine sul DNA nascente)21 e aniPOND (accelerata nativo iPOND)22 per selettivamente etichettare e purificare vDNA da infettato le cellule per l'imparziale identificazione del genoma virale proteine associate mediante spettrometria di massa. iPOND è stato determinante per l'indagine delle dinamiche di forcella di replicazione cellulare.
Per la purificazione selettiva di genomi virali da cellule infette, la replica di vDNA è etichettata con nucleosidi Etinil per volta, 5-Etinil-2-deoxyuridine (EdU) o 5-Etinil-2-deoxycytidine (EdC) (Figura 1), seguita da covalente Coniugazione di azoturo di biotina tramite clic su chimica per facilitare purificazione singolo passo del genoma virale e proteine associate su perline rivestite con streptavidina (Figura 2B). D'importanza, le infezioni avvengono nelle cellule fisse, che non sono impegnate nella replicazione del DNA cellulare per attivare specifici di etichettatura di vDNA. Inoltre, l'infezione HSV-1 provoca l'arresto del ciclo cellulare ed inibisce cellular DNA replica23,24. Virus può essere prelabeled prima dell'infezione per l'analisi di proteine associate con genomi virali in ingresso (Figura 1A) o con l'etichetta durante la replicazione del DNA per l'analisi di proteine associate con vDNA recentemente sintetizzato (Figura 1B) 25. Inoltre, analisi di inseguimento di impulso possono essere utilizzato per indagare la natura di proteine associate con replicazione virale forcelle (Figura 1)26. Inoltre, vDNA Etinil-modificato può essere coniugato covalentemente a un fluoroforo per indagine spaziale della dinamica della proteina (Figura 2A e Figura 3). Formazione immagine permette la visualizzazione diretta del vDNA è un approccio gratuito per la validazione delle interazioni della proteina-vDNA e può essere adattata per tenere traccia di genomi virali durante l'infezione. Ci aspettiamo che questi approcci potrebbero essere ulteriormente modificati per studiare qualsiasi aspetto dell'infezione herpesviral, compresa la latenza e riattivazione e di studiare altri virus a DNA. Inoltre, etichettatura con uridina 5-Etinil potrebbe consentire l'analisi di genomi virali RNA (UE).

<table><tbody><tr><td>Cellule MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Sostituito con il 10% di FBS, 2 mM di L-glutammina, 12 mM&nbsp; (per la crescita in fiasche) o 30 mM (per la crescita in piastre) bicarbinato di sodio</td></tr><tr><td>600 cm2 piatto per coltura tissutale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS), pH 7,4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricina</td></tr><tr><td>HSV-1 stock</td><td></td><td></td><td>Stock con titoli superiori a 1x109 PFU/mL funzionano meglio</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&nbsp; colonna (PD-10 Colonna di desalinizzazione)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&acuto;-Etinil-2&acuto;-deossicitidina (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>Sciogliere in DMSO per preparare 40 mM di stock, aliquotare e conservare a -20 °C; C&nbsp;</td></tr><tr><td>2&acuto;-deossicitidina (deossiC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>Sciogliere in acqua per preparare 40 mM di stock, aliquotare, e conservare a -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampone di estrazione nucleare (NEB)</td><td></td><td></td><td>Preparare fresco (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Saccarosio, 0,5% Igepal)</td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Bellco glass</td><td>7731-22000</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Soluzione di tripano</td><td>blu Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1,37 m NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (diluire a 1 volta in acqua sterile prima dell'uso)</td></tr><tr><td>Solfato di rame (II) pentaidrato (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>Preparare 100 mM di stock e conservare a 4 gradi; C per un massimo di 1 mese</td></tr> <tr><td>(+) Sodio L-ascorbato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Preparare appena 100 mM di stock e conservare in ghiaccio fino all'uso</td></tr><tr><td>Biotina azide</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>Preparare 10 mM di stock in DMSO, aliquota e conservare a -20 &deg; C per un massimo di 1 anno&nbsp;</td></tr><tr><td>Fare clic sulla miscela</td><td></td><td></td> di reazione <td>Preparare immediatamente prima dell'uso aggiungendo i reagenti nell'ordine indicato (10 mL: 8,8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25 mL 10 mM Biotina azide, 1 mL 100 mM ascorbato di sodio)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>Sciogliere in 1 ml di acqua per preparare 50 volte il brodo, può essere conservato a 4 gradi C per un massimo di 1 settimana, o aggiungere direttamente 1 pillola a 50 ml di tampone Tampone</td></tr><tr><td></td><td></td><td>di congelamento</td><td>Preparare fresco (7 ml di glicerolo al 100%, 3 ml di NEB, 200 &mu; L 50x inibitore della proteasi)</td></tr><tr><td>Tampone B1</td><td></td><td></td><td>Preparare fresco (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x inibitore della proteasi)</td></tr><tr><td>Tampone B2</td><td></td><td></td><td>Preparare fresco (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% Igepal, 1x inibitore della proteasi)</td></tr><tr><td>Tampone B3</td><td></td><td></td><td>Preparare fresco (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x inibitore della proteasi)</td></tr><tr><td>Processore ultrasonico Vibra Cell dotato di una sonda a micropunta da 3 mm</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr>2x tampone <td></td><td></td><td>per campioni Laemmli</td><td>Mescolare 400 mg di SDS, 2 mL di glicerolo al 100%, 1,25 mL di 1 M Tris (pH 6,8) e 10 mg di blu di bromofenolo in 8 mL di acqua. Negozio a 4&nbsp; &deg; C per un massimo di 6 mesi. Prima dell'uso aggiungere 1 M DTT a una concentrazione finale di 200 mM.</td></tr><tr><td>Tappi di bloccaggio per provette da 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti</td><td></td><td></td><td></td>standard per western blotting</tr><tr><td>Kit di colorazione blu colloidale NOVEX</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 15710</td><td>Diluire al 3,7% in 1x PBS prima dell'uso</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>Preparare il 3% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Tampone di permeabilizzazione (0,5% Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Preparare 0,5% Triton-X 100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Cocktail di reazione a clic - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit</td><td>di imaging Sonde molecolari</td><td>C10337</td><td>Preparare secondo il protocollo del produttore</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Preparare 10 mg/mL in acqua, può essere conservato a 4 &deg; C per un massimo di 1 anno</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-ICP8 di topo</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Utilizzare una diluizione 1:200 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-UL42 di topo (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Utilizzare una diluizione 1:200 in 1x anticorpo secondario coniugato 594 anti-topo PBS</td></tr><tr><td>Goat</td><td>Life Technologies</td><td>a11005</td><td>Utilizzare una diluizione 1:500 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr>2x soluzione <td></td><td></td><td>SDS-bicarb</td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Fenolo:cloroformio:alcol</td><td></td><td></td> isoamilico <td>Mescolare 25:24:1 almeno 1 giorno prima dell'uso, conservare a 4 gradi; C al buio</td></tr><tr><td>cloroformio:alcol</td><td></td><td></td> isoamilico <td>Mescolare 24:1 almeno 1 giorno prima dell'uso, conservare a temperatura ambiente al buio</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (diluire a 1x prima dell'uso)</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR kit di purificazione</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M acetato di sodio pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorimetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Provette per test Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza dotato di software</td><td></td><td></td><td></td>di imaging</tr><tr><td>Microcentrifuga per provette</td><td></td><td></td><td></td>da 1,5 mL</tr><tr><td>Centrifuga da tavolo per provette</td><td></td><td></td><td></td>da 15 e 50 mL</tr><tr><td>Cella incubatore</td><td></td><td></td><td></td>per colture</tr><tr><td>Armadio</td><td></td><td></td><td></td>di biosicurezza</tr><tr><td>Blocchi</td><td></td><td></td> di calore <td>65 &deg; C e 95 gradi E</td></tr></tbody></table>

purificazione di dna virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

L'obiettivo del presente protocollo è per isolare il virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) DNA da cellule infettate per l'identificazione di associato virale e proteine cellulari di spettrometria di massa. Anche se le proteine che interagiscono con genomi virali svolgono un ruolo importante nel determinare l'esito dell'infezione, un'analisi completa delle proteine del genoma virale associato non era in precedenza fattibile. Qui dimostriamo un metodo che consente la purificazione diretta del genoma di HSV-1 da cellule infette. Replica del DNA virale in modo selettivo è etichettata con nucleotidi modificati che contengono un gruppo funzionale di alchini. Con etichetta DNA quindi è specificamente e irreversibilmente contrassegnato tramite il legame covalente di azide biotina tramite un rame (I)-catalizzato reazione di cicloaddizione o clic di azide-alchino. Biotina-etichetta DNA viene purificata su rivestite di streptavidina e proteine associate sono eluite e identificate mediante spettrometria di massa. Questo metodo consente il targeting selettivo e l'isolamento di HSV-1 replica forchette o interi genomi da ambienti biologici complessi. Inoltre, l'adattamento di questo approccio vi permetterà per l'indagine sui diversi aspetti della infezione herpesviral, nonché l'esame dei genomi di altri virus a DNA.

L'uso della chimica clicca per la purificazione di DNA dalle cellule è stata compiuta in primo luogo il metodo di iPOND21. Lo scopo di iPOND è quello di purificare le forcelle di replicazione cellulare per l'identificazione di proteine associate. Abbiamo adattato questa tecnica per studiare specificatamente interazioni proteina vDNA durante l'infezione. Manipolazione dell'approccio di etichettare genomi virali con EdC (Figura 1), combi...

L'obiettivo del presente protocollo è specificamente tag e isolare selettivamente il DNA virale da cellule infettate per la caratterizzazione delle proteine del genoma virale associato.

Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di purificare il DNA del virus Herpes Simplex di tipo uno da cellule infette per l'analisi proteomica delle proteine associate al genoma virale. Questo metodo fornisce informazioni chiave sul coinvolgimento dei fattori cellulari e sull'infezione da virus dell'herpes. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere adattata per purificare direttamente diverse popolazioni di DNA virale da cellule infette, consentendo l'analisi di molteplici aspetti dell'infezione.Iniziare questa procedura con la coltura di cinque cellule MRC come descritto nel protocollo di testo. Quindi, diluire HSV-1 in soluzione salina tris-tamponata a freddo o TBS. Per i passaggi successivi, è importante spegnere il soffiatore e la cappa di coltura tissutale per evitare che le cellule si secchino.Utilizzare una pipetta per trasferire il terreno di coltura dalle cellule MRC 5 a un flacone sterile da aggiungere nuovamente alle cellule dopo l'infezione. Infettare le cellule aggiungendo sette millilitri di virus diluito alle cellule. Scuotere le celle ogni 10 minuti per un'ora a temperatura ambiente.Dopo l'assorbimento, aspirare l'innoculum, sciacquare le cellule con 50 millilitri di TBS a temperatura ambiente e sostituire il terreno di coltura originale. Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica. Dopo l'inizio della replicazione del DNA virale, circa quattro ore dopo l'infezione, etichettare il DNA virale replicante.Per fare ciò, diluire l'EdC in un millilitro di terreno di crescita e aggiungerlo al terreno di coltura cellulare delle cellule infette per due o quattro ore. Per raccogliere i nuclei, sostituire il terreno di coltura con 20 millilitri di tampone di estrazione dei nuclei e incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius con oscillazione occasionale. Dopo l'incubazione, raschiare i nuclei dalla piastra utilizzando un raschietto cellulare e trasferirli in una provetta conica da 50 millilitri su ghiaccio.Centrifugare per 10 minuti a 2, 500 x g e quattro gradi Celsius per pellettare i nuclei. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante. Staccare delicatamente il pellet nucleare in 10 millilitri di soluzione salina tampone fosfato o PBS e trasferirlo in una provetta conica da 50 millilitri.Quindi, centrifugare il campione come prima. Dopo aver rimosso completamente il PBS, risospendere il pellet nucleare in 10 millilitri di miscela di reazione a scatto, pipettando delicatamente su e giù cinque volte con una pipetta da 10 millilitri. Ruotare il campione per un'ora a quattro gradi Celsius, prima di pellettare i nuclei come prima.Rimuovere completamente la miscela a reazione rapida, quindi lavare il pellet rimettendolo delicatamente in 10 millilitri di PBS e centrifugando nuovamente. Ora, risospendere con cura il pellet nucleare in un millilitro di PBS e trasferire la soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo la centrifugazione, rimuovere completamente il PBS e congelare il pellet in azoto liquido.A questo punto, il pellet può essere conservato a 80 gradi Celsius oppure la procedura può essere continuata. Per lisare i nuclei e frammentare il DNA, risospendere i nuclei scongelati in 500 microlitri di tampone B1 pipettando su e giù. Incubare la sospensione con ghiaccio per 45 minuti.Quindi, sonicare i campioni sei volte per 30 secondi ciascuno al 40% di ampiezza, utilizzando una sonda a micropunta da tre millimetri. Posizionare i campioni sul ghiaccio per almeno 30 secondi tra gli impulsi. Dopo la sonicazione, i campioni dovrebbero apparire limpidi, non torbidi.Pellettare i detriti cellulari centrifugando a 14.000 x G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. La dimensione del pellet dovrebbe diminuire notevolmente, filtrare il surnatante attraverso un filtro cellulare da 100 micron e trattenere il flusso. Quindi, aggiungere 500 microlitri di Buffer B2 al surnatante filtrato.Per legare il DNA biotinilato alle perle rivestite di streptavidina, preparare le perle magnetiche di streptavidina trasferendo 300 microlitri di impasto liquido di perle in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Preparare un tubo di perline per campione. Lavare le perle tre volte con millilitro di Buffer B2 vorticando per ri-suspendare, applicandole a un magnete per separare le perle e aspirando il tampone di lavaggio.Quindi, aggiungere 900 microlitri di campione alle perle lavate. Il resto del campione sarà utilizzato per l'isolamento del DNA e delle proteine. Ruotare la sospensione durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, posizionare i campioni in un rack magnetico per provette a microfusibile e rimuovere il surnatante. Risospendere delicatamente le perle in un millilitro di Buffer B2, prima di ruotare a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere nuovamente il surnatante utilizzando il portaprovette magnetico per microfuge.Questa volta, risospendere delicatamente le perle in un millilitro di Buffer B3 e ruotarle a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante dalla miscela di perle utilizzando il magnete, risospendere le perle in 50 microlitri di tampone campione 2x Laemmli per alludere ai complessi proteici del DNA. Quindi, far bollire i campioni a 95 gradi Celsius per 15 minuti.Agitare una miscela prima di far girare rapidamente i campioni in una microfuga. Applicare i campioni al magnete e trasferire l'assegnazione su un nuovo tubo. Infine, congelare i campioni e conservarli a 80 gradi Celsius.Eseguire l'analisi delle proteine come descritto nel protocollo di testo. La marcatura EdC è stata effettuata per zero, 20, 40 o 60 minuti, seguita dalla purificazione del DNA virale e delle proteine associate. Le proteine eluite sono state sottoposte a colorazione blu coomassie e western blotting con l'anticorpo specifico per le proteine leganti il DNA virale, ICP4 e UL42.La freccia indica la streptavidina che è stata rimossa dalle perle durante l'eluizione, che è presente in tutte le condizioni. Le proteine isolate con questo metodo sono poi sottoposte a spettrometria di massa. Il grafico a torta illustra il numero di proteine in ciascuna categoria funzionale che sono risultate associate al tipo di virus Herpes Simplex sui genomi a sei ore dall'infezione.Uno sguardo più approfondito alle interazioni proteina-proteina tra le proteine identificate è stato effettuato utilizzando il database della rete di associazione proteica funzionale a stringa. I risultati rivelano sottocomplessi di proteine che funzionano insieme nello stesso processo biologico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare il DNA virale dalle cellule infette per l'indagine proteomica delle proteine associate al genoma virale.Questa tecnica può essere completata in tre o quattro giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prendere precauzioni per prevenire la contaminazione da DNAsi o proteasi dei campioni. Oltre a questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunofluorescenza per verificare la natura del DNA virale marcato con EdC.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della virologia dell'herpes, per esplorare le funzioni delle proteine dell'ospite e dell'infezione virale.

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