Name: 준비 번데기 기간 및 초파리 guttifera 의 날개 색소 측정 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 배우세요 Drosophila guttifera의 준비 번데기 기간 분류 및 날개 색소 정량화 방법을 통해 진화발생생물학에서 성체 형질의 발달 메커니즘을 연구하고 종 간 비교 분석을 수행하는 기술을 익히세요.

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우리 감사 Sean B. Carroll와 토마스 베르너 비행 주식, 장비에 대 한 나 오 유키 퓨즈, 촬영, 멘토링에 대 한 Kiyokazu 아가타와 엘리자베스 나카지마 영어 편집을 위한 그의 지원에 대 한 병 석 진 제공. 이 작품은 KAKENHI에 의해 지원 되었다 17 K 19427와 다케다 과학 재단.

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저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.

설명 여기 번데기 단계의 정의 대 한 프로토콜 번데기 단계의 기간 및 디 guttifera에서 날개에 검은 반점의 강렬의 측정 측정 자세한 관찰에 대 한 puparium를 제거 합니다. 이러한 프로토콜 많은 초파리 에 대 한 적용할 수 있으며 비행 종, 특히 종 날개 색소와 관련.
깊이 있는 관찰과 자세한 개발 이벤트의 설명 것 하위 단계의 추가 사용. 많은 경우에, 요구 해 부 나는 번데기의 단면 발달 이벤트 단계 정의에 적합 하지 않습니다, 그리고 개별 어렵다 하나 준비에 대 한 번데기를 죽 일 하 여 추가의 사용 때문에. 새로운 초파리 의 사용에 대 한 첫 번째 단계로 발달 이벤트는 puparium 외부에서 구별할 수를 고용 해야 하나. 연구의 목적에 따라 하나 수 있습니다 다음 더 세분화 단계 특정 organogenesis 또는 다른 발달 이벤트에 따라.
여러 단계의 inte...

초파리 의 형태학 특성 중 일부는 종1,2,3,,45중 다양. 우리는 질문에 접근할 수 있다 어떻게 형태학 상 다양성의이 형태학의 세대의 메커니즘을 비교 하 여 발생. 이러한 형태학의 예로 애벌레 trichomes, 성인 섹스 빗, 외부 생식 기 기구, 복 부 착 색, 및 날개 염색6,7,,89, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. 성인 간의 형태학 적 차이 연구, 관찰 및 번데기 단계 분석, 때문에 중요 하다 성인 특성의 운명을 후반 애벌레 단계에서 결정 되 고 후속 morphogenesis 번데기 기간 동안 진행.
초파리 melanogaster의 발달 생물학 연구에서 "시간 APF" (번데기 형성 후 시간)16번데기 단계 표시 하는 일반적인 방법입니다. 이 시스템 번데기 형성 후 절대 시간을 고용 하 고 일상적인 실험에 대 한 매우 편리 하다. 그러나, 발달 속도 pupae, 사이 다를 수 있습니다 약간의 유전적, 후 또는 microenvironmental 차이 의해 영향을 받을 수 있고 따라서 같은 데 번데기 형성 후 절대 시간을 보장 하지 않습니다 pupae 동시는 발달 단계입니다. 대부분의 경우, 형태학 상 특징에 의해 정의 하는 단계는 여러 개인 비교를. 특히, 종 사이 비교에 해당 (동종) 단계 중 비교 정확한 준비 필요합니다.
베인 브리지 및 Bownes17 인식 20 번데기 단계 (P15(ii)) P1 초파리 melanogaster pupae의 형태학 적 특징에 따라. 이 발판은 형태학 상 발달 준비18의 가장 널리 사용 되는 시스템 이다. 이전 연구에서 우리는 날개 염색 연구19에 대 한 기초 확립 초파리 guttifera 의 번데기 준비 수행. D. guttifera 그것의 날개에 검은 물방울 패턴 있으며 날개 색소 형성20모델 종 중 하나입니다. 우리가 형태학 기준에 설명 된 간주 브릿지 Bownes' 연구17, 우리는 직접 직렬 관찰19, 베인 브리지 및 Bownes의 추정 단계 기간을 사용 하는 대신 단계 기간을 측정 주파수를 관찰 했다. 여기 우리가 번데기 준비의 방법 및 측정의 Fukutomi 외19에 사용 되는 초파리 의 번데기 단계의 기간을 설명 합니다.
날개 착 색의 개발 메커니즘 연구, 번데기 또는 성인 단계에서 색소 발생 시 알아야 합니다. Fukutomi 외. 19 날개 이미지의 이미지 분석에 의해 번데기 및 성인 단계 동안 착 색의 광학 밀도 (ODs)을 측정할. 초파리 날개의 착 색 검은 멜 라 닌21의 축적으로 인 한 것으로 생각 된다. ODs의 정량화, 그레이 스케일 이미지와 ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)22 사용 되었다. 인식 하 고 계량 자리 전용 착 색 (ΔOD), 우리는 세 자리 세 자리 내부에서 외부 감. 확인 하려면이 방법을 재현 하 고 객관적인, OD 측정의 랜드마크로 서 날개 정 맥을 사용 하 여 결정 한다. 이 문서에서는, 우리가 자세히 설명 초파리 guttifera착 색 날개의 정량화의이 방법.

<table><tbody><tr><td>Drosophila guttifera</td><td>The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego</td><td>15130-1971.10</td><td>Drosophila guttifera, 이 기사에 사용된 초파리 종</td></tr><tr><td>플라스틱 바이알</td><td>Hightech</td><td>MKC-30</td><td>플라스틱 바이알, 플라이 스톡 유지 관리용</td></tr><tr><td>Buzz plugs 바이알 및 병 마개 유리 바이알용</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-271</td><td>셀룰로오스 플러그, 플라이 스톡 유지 관리 용</td></tr><tr><td>백색 연질 설탕</td><td>Mitsui Sugar</td><td>J-500g</td><td>백색 연질 설탕, 표준 옥수수 가루 / 설탕 / 효모 / 한천 식품</td></tr><tr><td>옥수수 가루</td><td>Nippon Flour Mills</td><td>F</td><td>옥수수 가루, 표준 옥수수 가루 / 설탕 / 효모 / 한천 식품</td></tr><tr><td>옥수수 가루 - C</td><td>Nippon Flour Mills</td><td>GC</td><td>옥수수 가루 - C, 표준 옥수수 가루 / 설탕 / 효모 / 한천 식품</td></tr><tr><td>한천 분말</td><td>마츠키 칸텐 산업</td><td>No.602</td><td>한천 분말, 표준 옥수수 가루/설탕/효모/한천 식품</td></tr><tr><td>드라이 맥주 효모</td><td>아사히 식품 & 헬스케어</td><td>Y2A</td><td>건조 맥주 효모, 표준 옥수수 가루/설탕/효모/한천 식품용</td></tr><tr><td>부틸 p-하이드록시벤조에이</td>트 <td>Nacalai Tesque</td><td>06327-02</td><td>부틸 p-하이드록시벤조에이트, 표준 옥수수 가루/설탕/효모/한천 식품용</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Wako</td><td>057-00456</td><td>에탄올, 표준 옥수수 가루/설탕/효모/한천 식품용</td></tr><tr><td>플랫 바텀 마이크로튜브</td><td>Ina Optica</td><td>CF-0150</td><td>1.5mL 마이크로튜브, 용 번데기</td></tr><tr><td>수집 CAPSULEFUGE</td><td>Tomy</td><td>PMC-060</td><td>미니 마이크로 원심 분리기, 번데기 수집용</td></tr><tr><td>멸균 샬레 NB</td><td>Sansei Medical</td><td>01-013</td><td>플라스틱 페트리 접시(직경 90mm x 높이 15mm)</td></tr><tr><td>세럼 튜브 랙</td><td>이와키</td><td>9796-050</td><td>번데기 관찰용 습한 챔버로 사용</td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip 조직 배양 접시</td><td>코닝</td><td>353001</td><td>플라스틱 페트리 접시 (지름 35mm × 높이 10mm)</td></tr><tr><td>팔콘 표준 조직 배양 접시</td><td>코닝</td><td>353002</td><td>플라스틱 페트리 접시 (지름 60mm × 높이 15mm)</td></tr><tr><td>푸시 핀</td><td>Kokuyo</td><td>51233709</td><td>푸시 핀, 마이크로 튜브 뚜껑에 핀 홀 만들기용</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>실체 현미경, 형태 관찰</td></tr><tr><td>용 디지털 카메라</td><td>Olympus</td><td>DSE-330-A</td><td>디지털 카메라, 이미징용</td></tr><tr><td>NICETACK 양면 테이프</td><td>니치반</td><td>NW-15SF</td><td>양면 테이프, 번데기 제거용</td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>집게, 번데기 제거용</td></tr><tr><td>Van Gogh VISUAL 페인트 브러시</td><td>Talens Japan</td><td>GWVR-#5/0</td><td>페인트 브러시, 번데기 제거용</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 12 웰 세포 배양 플레이트</td><td>Merck</td><td>665-180</td><td>12웰 세포 배양 플레이트, 번데기 주기 지속 시간 측정용</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>NaCl, PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque</td><td>285-14</td><td>KCl, PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td>Na2HPO4&middot; 12H2O, PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28721-55</td><td>KH2PO4용, PBS</td></tr><tr><td>Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0</td><td>Edmund Optics</td><td>64-384</td><td>Stepped density filter용, 색소 침착 측정 보정 용</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>NIH</td><td>1.8.0-101</td><td>ImageJ 소프트웨어, 날개 (https://imagej.nih.gov)의 검은 반점 강도 측정용</td></tr> <tr><td>FINE FROST 유리 슬라이드</td><td>Matsunami Glass Ind</td><td>FF-001</td><td>유리 슬라이드, 날개의 검은 반점 강도 측정</td></tr><tr><td>용 사각형 현미경 커버 유리 18 x 18</td><td>Matsunami Glass</td><td>Ind C018181</td><td>커버 슬립, 날개의 검은 반점의 강도를 측정하기 위한 것입니다.</td></tr></tbody></table>

준비 번데기 기간 및 초파리 guttifera 의 날개 색소 측정 방법

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

다양 한 종의 초파리 (과일 파리) 개발 및 유전자 변화 진화 변화에 대 한 책임의 메커니즘을 연구 하는 기회를 제공 합니다. 특히, 성인 무대 날개 착 색 비교를 포함 하 여 interspecific 비교 형태학 상 특성의 풍부한 원천입니다. 공부 하 고 종 간의 발달 차이, 자세한 관찰과 적절 한 준비는 정확한 비교 필요 합니다. 여기 우리가 번데기 기간의 준비 및 폴카 점 과일 파리, 초파리 guttifera착 색 날개의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 첫째, 자세한 형태 관찰 및 형태학에 따라 번데기 단계의 정의 방법을 설명 합니다. 이 방법은 외부 chitinous 사건의 번데기, 번데기 형태학의 상세한 관측을 사용 하는 puparium를 제거 하기 위한 기술을 포함 합니다. 둘째, 우리는 정의 된 번데기 단계 기간을 측정 하기 위한 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 디지털 이미지 및 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 분석에 따라 날개 염색의 정량화에 대 한 방법을 설명 합니다. 이러한 방법으로, 우리는 번데기 단계 동안 성인 특성의 발달 과정을 비교 하기 위한 견고한 기초를 설정할 수 있습니다.

D. guttifera 의 번데기 기간 17 단계 (P1-P15(ii), 단계 (P1, P5-6, P10) 그림 3, 그리고 모든 17 단계는 그림 4에 나와 있는 표시 됩니다 3 명의 대표자의 이미지)으로 나누어져 있습니다. 베인 브리지 및 Bownes17 20 단계 D. melanogaster인정, 이러한 단계 중 일부 수 하지에 적용할 D. guttifera. 2 개의 발달 이벤트의 순서, 노란 몸 (midgut26내 창 고 세포의 질량)의 모양 및 녹색, 터 닝 말 tubules의 타이밍 제어 되지 않습니다 엄격 하 게 D. guttifera에 그리고 그러므로 우리가 P5를 분리할 수 없었다 (i ), P5(i...

번데기 기간 및 측정 초파리 guttifera 의 날개 염색의 준비에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 준비와 염색의 정량화 성인 특성의 발달 기계 장치를 공부에 대 한 견고한 기초를 제공 하 고 특성 개발의 interspecific 비교 사용.

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

이 실험의 전반적인 목표는 번데기 기간을 단계화하고 Drosophila guttifera의 날개 색소 침착을 측정하는 것입니다. 이 방법은 초파리에서 색소 패턴이 어떻게 발달하는지와 같은 진화 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형태 학적 발달 및 색소 형성 과정에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있다는 것입니다.이 방법은 Drosophila guttifera의 형태학적 발달 및 색소 형성 과정에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 초파리 종에도 적용할 수 있습니다. 번데기 제거를 시작하려면 종이 타월 조각에 양면 테이프 조각을 부착하십시오. 양면 테이프에 번데기를 배쪽이 위로 향하게 놓습니다.번데기의 앞쪽과 내부 번데기 사이의 공간을 찾습니다. 집게를 사용하여 이 틈 주위의 번데기를 잡고 제거합니다. 그리고 번데기 머리의 앞쪽을 노출시킵니다.집게의 끝을 전후 축과 평행하게 움직여 삽입합니다. 집게 끝을 들어 올려 번데기를 국부적으로 부수십시오. 파손이 번데기의 뒤쪽 부분에 도달 할 때까지이 작업을 반복하십시오.번데기와 번데기 다리 사이에 틈이 생기는지 확인하십시오. 그리고 번데기의 복부 쪽을 부러뜨리면서 내부 번데기의 손상을 최소화합니다. 번데기를 최대한 부순 후 고운 페인트 브러시를 사용하여 번데기를 꺼냅니다.ddH2O를 적신 티슈 조각에 번데기를 놓고 플라스틱 페트리 접시에 담습니다. 노출된 번데기는 취약하고 쉽게 건조하므로 즉시 사진을 찍으십시오. 이미지 준비를 진행하고 집게로 번데기의 앞부분을 제거합니다.번데기를 꺼내 플라스틱 페트리 접시에 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣습니다. 다음으로 날개의 기저 관절을 자릅니다. 날개가 접히면 ddH2O로 채워진 플라스틱 페트리 접시에 넣어 삼투압으로 확장합니다.스톡 파일에서 10분마다 한 번씩 새로 닫힌 성체를 수집합니다. CO2 마취 패드를 사용하여 파리를 마취합니다. 부동성에 의한 마취를 확인하고 날개의 기저관절을 절단합니다.유리 슬라이드에 10마이크로리터의 PBS를 떨어뜨립니다. 드롭에 날개를 놓습니다. 그리고 커버 슬립으로 드롭을 덮으십시오.그런 다음 실체 현미경의 조명을 켜고 최대로 설정합니다. 대물 렌즈를 11.5x로 설정하고 조리개를 가장 열린 상태로 설정합니다. 그런 다음 카메라를 켜고 카메라를 설정합니다.샘플에 초점을 맞춥니다.amp현미경의 초점 손잡이를 움직여 le. 리모콘의 셔터 버튼을

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

특성에 대한 Phenotypic 변형 CIS - 규제 요소 (CRE) 시퀀스 제어하는​​ 유전자 발현 패턴의 변이에서 발생할 수 있습니다. Drosophila melanogaster에 사용하기 위해 파생된 방법은 양적 수정하거나 자연 발생 CRE 변종으로 인한 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴의 수준을 비교할 수 있습니다.

의 양적 비교 CIS</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster</em

의 유충과 pupae에 chordotonal 장기 immunostain하고 시각화하는...

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

이 기사에서는 번데기 내부를 그대로 유지하면서 곤충의 번데기를 제거하는 기술에 대해 설명하므로 추가 조사에 적합합니다. 예시 프로토콜은 Drosophila guttifera를 사용한 절차를 보여줍니다. 그러나 이 기술은 다른 초파리 종에 적용할 수 있습니다.

곤충 번데기 제거: 번데기 조사 방법

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

여기, 우리 라이브 이미징 일반 및 근육-힘 줄 morphogenesis 개발 프로세스의 특히 생활에서 수행 하는 쉬운--사용 하 고 다양 한 방법 제시 초파리 번데기.

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

여기에서는 번데기를 완전히 제거하는 번데기 단계에서 초파리 다리의 장기 라이브 이미징을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.

번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

초파리는 근발생의 기본 메커니즘을 이해하는 강력한 모델입니다. 흉부 반절편 절편을 해부 및 준비하기 위한 이 프로토콜은 번데기 및 성인 단계 모두에서 간접 비행 근육의 현미경 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 세포 형태, 단백질 국소화, 근육 구조 및 근형성의 기타 여러 측면의 공초점 이미징을 가능하게 합니다.

현미경 접근을 위한 Drosophila melanogaster 간접 비행 근육의 해부

배우세요 Drosophila guttifera의 준비 번데기 기간 분류 및 날개 색소 정량화 방법을 통해 진화발생생물학에서 성체 형질의 발달 메커니즘을 연구하고 종 간 비교 분석을 수행하는 기술을 익히세요.

준비 번데기 기간 및 초파리 guttifera 의 날개 색소 측정 방법

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