Name: 2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学ぶ2光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法。ジスフェリン症患者線維芽細胞の膜再封入能をリアルタイムで定量化し、筋ジストロフィーの病態理解と治療開発に貢献する技術を習得できます。

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この作品は、技術革新 (CFI) のアルバータ大学学部医学と歯学、友人のギャレット カミング研究椅子基金、HM のトゥーピン神経科学研究の椅子基金、筋ジストロフィー カナダ、カナダの財団によって支えられました。アルバータ州の高度な教育と技術 (AET)、カナダ保健研究 (機構)、ジェシーの旅 - 遺伝子と細胞療法、女性と子供の健康研究所 (WCHRI) のための基礎機構とアルバータ州革新健康ソリューション (AIHS).
博士スティーブン ラヴァルをありがとうフルレングス ジスフェリン プラスミドをご提供したいと思います。技術的助言の Katsuya Miyake 先生に感謝も申し上げます。

本研究で使用されるひと線維芽細胞は、医学部・歯学部アルバータ大学で人間の倫理委員会から承認を得て使用されました。
1. フルレングスの DYSF プラスミドを細胞のトランスフェクション
<ol>
	<li>成長媒体 - 36 mL ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)、ウシ胎児血清 (FBS) の 4 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) - 37 ° C で CO2インキュベーターの 20 μ L の 40 mL を含む T225 フラスコ培養線維芽細胞 注: セルは約 70-80% の confluency に培養する必要があり、なって完全に合流するべきではないです。</li>
	<li>シードの細胞を準備をするには、40 ml のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のセルを 2 回、リンス セルをデタッチする 0.05% トリプシンの 5 mL を追加します。37 ° c CO2インキュベーターのセルを返すし、5 分のセルを孵化させなさい。<ol>
		<li>セルは完全に独立した、トリプシン反応を停止する成長媒体の 40 mL を追加します。</li>
		<li>診断を使用してセルまたはデバイスを数える別のセルをカウントします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>35 mm コラーゲン被覆ガラス底皿に5セル/mL の 1 x 10 のセルの 2 mL をシードします。37 ° C で CO2インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。 注: セルする約 50-60% 合流次の日する必要があります。</li>
	<li>成長媒体を取り外して 2 ml の血清を奪われたメディア (FBS なし成長媒体)。</li>
	<li>フルレングス ジスフェリン プラスミド lipotransfection を使用してセルを transfect します。<ol>
		<li>1.5 mL チューブ (トランスフェクションするのに各料理の 1 つの管) の血清を奪われたメディアの 150 μ L を準備します。</li>
		<li>血清を奪われたメディアを含む各 1.5 mL チューブにトランスフェクション試薬の 3 μ L を追加します。それは室温で少なくとも 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>別 1.5 mL チューブに 175 μ L の血清を奪われたメディアとプラスミド DNA の 3.5 μ g を追加します。 注: は、トランスフェクションするのに各追加料理の上記金額を乗算します。</li>
		<li>150 μ L の血清を奪われたメディアとトランスフェクション試薬の 150 μ L でチューブにプラスミド DNA を含むメディアを組み合わせます。室温で 20 分間インキュベートそれ。</li>
		<li>プラスミド、トランスフェクション試薬とメディアの 300 μ L を料理に均等に分散します。37 ° C で CO2インキュベーターで 24 h の料理を孵化させなさい</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血清を含む新鮮な成長媒体でメディアを交換し、37 ° C で CO2インキュベーターでさらに 24 時間インキュベート</li>
</ol>
2 セルの 2 光子負傷試金のための準備
<ol>
	<li>ピペッティングでメディアを削除、タイロード溶液 1 mL と 1 回細胞を洗浄し、2.5 ミリメートル FM の 1 μ L を含む新鮮なタイロード溶液の 1 mL を追加 4 64 染料。 注: FM 4-64 の染料の最終濃度は 2.5 μ M です。</li>
	<li>カルシウムの欠乏した環境で細胞膜修復の評価が必要な場合は、1 ml の PBS のセルをすすいで 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸を含む PBS の 1 つの mL を追加します。 注: PBS は、細胞が時間の経過を切断すると負傷のアッセイは、できるだけ早く完了する必要があります。</li>
</ol>
3. 2 光子レーザー負傷アッセイ
<ol>
	<li>倒立の共焦点顕微鏡と関連付けられたプログラム ソフトウェアを使用して、0.2 μ x 2 μ m ターゲットを作成し、細胞膜の端にそれを置き、ターゲット ラインと重なるし、細胞膜 (図 2) の方向に垂直であります。</li>
	<li>FM 色素信号を励起し、600-760 nm の検出範囲の設定 543 nm HeNe レーザーを使用します。GFP 信号 (図 4) をエキサイト 500 550 nm の検出範囲を設定し、488 nm アルゴン レーザーを使用します。<ol>
		<li>作成の 5 分の時系列連続画像スキャン、イメージ投射セルのすべての 5 s。</li>
		<li>膜病変を生成するには、820 nm、15% を使用してに設定 2 光子レーザーを用いた漂白剤細胞はレーザ 10 の反復処理で出力と時系列の初めの後細胞 25 s をブリーチします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FM 4-64 色素蛍光を定量化するには、ソフトウェアを使用して、利益 (率 ROI) の 6 μ x 6 μ m 領域を描画し、負傷の場所と (図 3) のセル内に配置。 注: ソフトウェアで-このアプリケーションで「範囲インジケーター」関数を使用してピクセル過飽和のサンプリング エリアを避けるために、赤いピクセルは、過飽和ピクセルを表します。統計分析のための電子スプレッドシートに未加工の蛍光値をエクスポートします。</li>
	<li>(膜を傷つける前に縦長の平均蛍光値) バック グラウンド値を減算して各時点の相対的な蛍光値を計算し、t 増加額を割って、蛍光値 = 0 (図 5, 6).</li>
</ol>

<ol><li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li>
<li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li>
<li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emergency+response+team+for+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li>
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<li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+free+Ca2%2B+and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li>
<li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li>
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<li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li>
<li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li>
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</ol>

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2 光子レーザーの細胞膜の負傷は、再シールする体外膜のダイナミクスを評価するため正確で汎用性の高い手法です。この記事で dysferlinopathy 患者細胞アッセイが負傷した二光子励起レーザーを使用しての能力を再シールする細胞膜を決定するプロトコルについて述べる。Dysferlinopathy 患者の細胞は細胞膜が再シールに欠陥が他の研究者による調査結果に一貫しているし、筋肉間の原動力を再シールする細胞膜の顕著な類似性をさらに強調することが分かったと非筋細胞の3、11,15,22 を種類します。またフルレングス ジスフェリン シーケンスを含むプラスミドをトランスフェクトした患者の細胞表現型を再シールの欠陥膜から救出されたことを認め、そのフルレングス ジスフェリン プラスミドは非筋の表現型を救うことができますを示す筋27</su...

真核細胞の細胞膜は、細胞の内か細胞外の環境を定義し、細胞の恒常性と細胞の生存を維持するために不可欠ですタンパク質がちりばめられたリン脂質の二重層で構成されます。機械的又は化学的侮辱から生じる細胞膜損傷、様々 な哺乳類の細胞のタイプで平凡、骨格を含む、心筋、胃、肺細胞は1,2,3,4。毎日生理機能の結果としての傷害、に加えては、環境の侮辱、細菌毒素、虚血再灌流5によって細胞膜を破損ことができます。細胞膜の破裂を再シールに失敗につながる細胞外 Ca2 +- - その他の潜在的に有害細胞コンポーネントと共に無秩序な流入、細胞へ細胞になることができますすぐに下流の信号カスケードをトリガー死1,4,5,6。
日には、細胞膜修復のためいくつかの提案されたモデルがずっとあります。サイズや膜破裂の性質に応じて異なる修復メカニズムが起動できます。たとえば、側方流動や目詰まり小さな混乱を修復するタンパク質が細胞膜を利用することが示唆された (&#60; 1 nm)。側面の融合モデルを提案する膜が破裂するがジスフェリン含む横募集を通して出される急速に膜7、蛋白質モデルの目詰まり小さな穿孔がタンパク質集計を出されることを示唆しています。(大抵アネキシン)8します。 逆に、大きい膜病変を引き起こす Ca2 +-依存、ジスフェリンを介した小胞融合し修復パッチの形成。修理パッチ モデルでセルに急速な Ca2 +流入トリガー形複合体や細胞内小胞の融合と共に「パッチ」複数のタンパク質 (ジスフェリン、アネキシン、mitsugumin-53、EDH 蛋白質) の募集やリソソーム膜のサイトで4,9,10、11,12に損傷を与えます。これらのモデルは必ずしも相互に排他的ではありませんし、膜の修復を容易にするコンサートで動作可能性がありますに注意してくださいすることが重要です。細胞膜の損傷を正しく再シールに失敗した筋ジストロフィー (dysferlinopathy - 三好ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィーのタイプ IIB、前方脛骨発症型ミオパチーなど) を含む複数の病気の状態に関連付けられています。13、心筋症の14、および Chediak-東症候群 (CHS)15。
その適切な細胞膜の完全性と演劇を再シール健康と病気、そのような重要な役割細胞膜修復の分子機構の解明理解有益となる新しい治療戦略の検索で。したがって、速度を監視し、細胞膜修復の能力を評価する適切な実験技術を保有する必要は。細胞膜修復をモデル化するためいくつかの培養方法を設計されています。1 つの戦略には、機械的損傷、細胞をこするピペット/手術/刃またはセル16のガラスビーズの寝返りによってを通じて促進することができますが含まれます。ただし、機械的損傷のこのタイプはより大きな病変を生成し、細胞損傷、内や文化の間の変化の高度を作成します。
膜の傷を生成する別の方法は、二光子励起顕微鏡法によるレーザーアブレーションです。単一光子励起を採用し従来のレーザー共焦点顕微鏡と対照をなして 2 光子レーザーは同時に17の高エネルギー電子の励起を容易にするのに 2 つの長波長、低エネルギーの光子を使用します。この非線形プロセス結果励起焦点面でのみ、全体の光路17 (図 1) にはないです。これは、削減励起ボリューム イメージングの生きているセル18,19時に光損傷を最小限に抑えることです。研究者は、細胞膜とモニター膜は蛍光染料を使用し、細胞膜が破裂し、reseals としての蛍光強度の変化を観察することによってリアルタイムで再封止の正確な病変を生成することが従って。
このアプローチは、 in vitroとin vivoが負傷した膜を研究に使用されました、複数セルのタイプ20,21。たとえば、膜は、線維芽細胞および dysferlinopathy この技術22,23を行った患者由来細胞の欠陥を修復します。また、マウスから隔離された単一の筋線維は、修復パッチ形成13,24,25を監視する使用されました。9単一の筋線維の細胞膜修復中の蛍光付けられた蛋白質の動きを観察することも。さらに、ゼブラフィッシュ胚における二光子励起レーザーが負傷した後, 修復のプロセスは、26リアルタイム体内で観察できます。
この記事で私たちは能力を再封止膜の定量化を目的として様々 な細胞タイプにこの方法論を適用できますが、2 光子レーザーの負傷を使用して線維芽細胞細胞膜修復の動態を評価するための方法論を概説します。生体外で。FM4 64 セルに孵化するこの方法では、すぐに否定的に連結され、蛍光を発する脂溶性、細胞不浸透性染料の帯電膜病変から細胞に入ると細胞質内リン脂質 (図 2&#38;3). 色素蛍光膜病変に隣接の定量化により細胞膜自体を封印するためにかかる時間を監視するため。このメソッドの有用性を実証するため細胞膜修復の救助を評価するのに GFP 共役フルレングス ジスフェリン (DYSF) プラスミドをトランスフェクトした dysferlinopathy 患者線維芽を使用します。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ修正イーグルミディアム(DMEM)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'S Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35mm コラーゲンコーティングガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>血清欠乏培地</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfection 試薬</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 Dye</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode's Salts Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>カメレオン 2光子レーザー</td><td>Coherent</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

数多くの病態生理学的侮辱は細胞膜に損傷を与えることができるし、細胞膜修復または整合性の生来欠陥と相まって病で発生する可能性が。周囲の細胞膜修復基盤となる分子機構の解明は、したがって、機能不全の細胞膜の動態と関連する疾患の新規治療戦略の開発に重要な目的。細胞膜を再シールするさまざまな疾患のコンテキストで理解することを目的とした多くのin vitroとin vivoの研究は、次の実験的治療機能の結果を決定するための標準として 2 光子レーザー焼灼を利用します。この分析では、細胞膜が破裂し、細胞に侵入する蛍光色素細胞膜をおこす二光子励起レーザーと負傷にさらされます。セル内での蛍光の強度は、自体を再シールする細胞の能力を定量化する監視できます。アプローチ自体が負傷した二光子レーザーで大きな変化と同様、傷害、細胞膜の応答を評価するためのいくつかの方法があります、したがって、セルが負傷したの単一の統一されたモデルは有益減少になるだろう、これらの方法のバリエーション。この記事では、細胞膜修復体外の両方の健康と dysferlinopathy 患者線維芽細胞細胞トランスフェクション フルレングス ジスフェリン プラスミドの有無を評価するためのプロトコルが負傷した単純な二光子励起レーザーを概説します。

健康な線維芽細胞、dysferlinopathy の非投与患者線維芽細胞、フルレングス ジスフェリン シーケンス機能を再封止膜を評価するために負傷した二光子レーザーを受けたを含むプラスミドをトランスフェクトした患者線維芽細胞リアルタイムで.正常ひと線維芽細胞がレーザーが負傷した FM 4-64 蛍光活性の低レベルを表示し、非投与患者線維芽細胞展示相対蛍光強度損傷の高度 (図 5&amp; 6).フルレングス ジスフェリン プラスミドを導入させた患者の細胞を示し減少の相対的な FM 4-64 の蛍光強度非投与患者のコントロールと比較して健康管理 (図で観察された蛍光値と同等であった5&amp; 6)。
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2 光子レーザーを介して細胞膜が負傷した膜を再シール能力評価に広く使われている方法で、複数の細胞のタイプに適用できます。ここでは、体外でライブ イメージング dysferlinopathy 2 光子レーザー アブレーション患者細胞の膜を再シールするためのプロトコルについて述べる.

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

この手順の全体的な目標は、筋ジストロフィー患者細胞の原形質膜修復能を定量化することです。この方法は、特定の突然変異と膜再封鎖動態との関係など、筋ジストロフィーの重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、生細胞における膜再封鎖速度のリアルタイム定量化が可能になることです。まず、40ミリリットルの増殖培地が入ったT225フラスコで、37°Cの二酸化炭素インキュベーターで線維芽細胞を培養します。培養物が70〜80%のコンフルエントに達したら、洗浄ごとに40ミリリットルのPBSで細胞を2回すすぎ、続いて5ミリリットルの0.05%トリプシンを摂氏37度で5分間追加します。細胞が分離したら、40ミリリットルの新鮮な増殖培地で反応を停止し、100,000細胞/ミリリットルの濃度で2ミリリットルの細胞を35ミリメートルのコラーゲン被覆ガラス底プレートに播種し、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベーションします。トランスフェクション培養物1本につき1.5ミリリットルのチューブ1本に、150マイクロリットルの新鮮な血清欠乏培地を添加します。次に、各チューブに3マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加え、チューブを室温で少なくとも5分間インキュベートします。チューブのインキュベーション中に、175マイクロリットルの血清由来培地と3.5マイクログラムのジスフェリンプラスミドDNAを、プレートあたり1.5ミリリットルのチューブに追加して加えます。次に、150マイクロリットルのプラスミドDNA溶液と150マイクロリットルのトランスフェクション試薬を1プレートあたり1本の新しいチューブに組み合わせ、室温で20分間インキュベートします。翌朝、成長培地を2ミリリットルの血清由来培地と交換します。インキュベーションの終了時に、300マイクロリットルのプラスミド溶液全体を各プレートに均等に分配し、プレートを二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、プラスミド上清を新鮮な増殖培地と交換し、プレートをさらに24時間インキュベーターに戻します。2光子創傷アッセイ用の細胞を調製するには、トランスフェクションした培養物を1ミリリットルのTyrode溶液で1回すすぎます。次に、1ミリリットルの新鮮なチロード溶液に1マイクロリットルの2.5ミリモルFM4-64色素を補充して細胞に加えます。次に、倒立共焦点顕微鏡を使用して、顕微鏡のソフトウェアで0.2 x 2ミクロンのターゲットを作成し、ターゲットラインが重なり合って細胞膜に対して垂直になるように、ターゲットを細胞膜の端に配置します。FM色素信号を励起するには543ナノメートルのヘリウムネオンレーザーを、GFP信号を励起するには488ナノメートルのアルゴンレーザーを選択し、検出範囲をそれぞれ600〜760ナノメートルと500〜550ナノメートルに設定します。次に、5 分間の時系列の連続画像スキャンを作成します。膜病変を作製するには、2光子レーザーを15%のレーザー出力で820ナノメートルまで10回の反復で使用して、時系列の開始から25秒後に細胞を漂白します。FM4-64色素の蛍光を定量するには、ソフトウェアを使用して6 x 6ミクロンの関心領域を描画し、その関心領域を細胞内の創傷位置に隣接して配置します。次に、バックグラウンド値を減算し、正味の増加を時間ゼロでの蛍光値で除算して、各時点の相対的な蛍光値を計算します。健康なヒト線維芽細胞は、レーザー創傷後に低レベルのFM4-64蛍光活性化を示しますが、未治療の患者線維芽細胞は、損傷後に高度の相対蛍光強度を示します。全長ジスフェリンプラスミドをトランスフェクションした患者細胞は、未治療の患者対照と比較して相対的なFM4-64蛍光強度が減少しましたが、健康な対照で観察された蛍光値と同様です。この手順を試みる際には、細胞が緩衝液中でゆっくりと死滅するため、迅速に作業し、定期的に新鮮な細胞に変化させることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、2光子顕微鏡を使用して膜病変を再生する方法と、膜再封止をリアルタイムで定量化する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

動物全体でMG53を介した細胞膜修復のと細胞​​レベルで動的なプロセスを視覚化するために使用されるプロトコルは、ここで説明する。これらのメソッドは、細胞膜の再シール性と再生医療の細胞生物学を調査するために適用することができます。...

使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

このビデオは、哺乳類細胞における原形質膜の再封鎖効率を研究するためのアッセイを示しています。細胞は細菌の細孔形成毒素にさらされ、細胞膜に細孔を形成します。細胞外カルシウムイオンの存在下では、細孔がカルシウムの流入を引き起こし、膜の再封入イベントを誘発します。再封止効率は、DNA結合性ヨウ化プロピジウム色素を用いて評価されますが、これは再密封された膜がない細胞にのみ入ります。...

原形質膜の再封止効率を測定するためのin vitro蛍光ベースのアッセイ

親油性色素FM1-43に曝露された細胞のライブイメージングは​​、孔形成毒素は原形質膜から除去されることにより、反応速度の正確な決定を可能にする。これは、Ca 2 +、スフィンゴミエリナーゼおよび原形質膜の修復に関する他の要因のための要件を評価するために使用できる高感度のアッセイである。...

カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる<sup&gt; 2 +</sup孔形成毒素の傷の修復&gt;とスフィンゴミエリナーゼ

治癒損傷した細胞の処理は細胞膜の損傷部位に特異的なタンパク質および細胞内コンパートメントの輸送を伴う。このプロトコルは、これらのプロセスを監視するためのアッセイを説明しています。...

イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

レーザーはしばしばDNA損傷に対する細胞応答の研究で使用されています。しかし、彼らは、その間隔は、周波数、および複製フォークとの衝突はめったに特徴付けされていない病変を生成します。ここでは、レーザーローカライズ間架橋と、これらのパラメータの決意を可能にアプローチを説明します。...

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

このプロトコルの目標はレーザー microirradiation を使用してさまざまな種類の比較的単純な鎖切断と被害サイト体内に DNA 損傷シグナル伝達と修復因子アセンブリを勉強する、複雑な損傷を含む DNA の損傷を誘発する方法を記述することです。.

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA 損傷を誘発するおよび選択したサブ核領域の DNA 修理蛋白質の応答を監視するための共焦点レーザー蛍光顕微鏡とレーザ...

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

ここで細胞の蛍光イメージング解析による効率を再封止膜を測定する高スループット蛍光を用いた測定について述べる。この試金は、薬や哺乳類細胞における原形質膜を再シールするターゲット遺伝子をスクリーニングするために使用できます。...

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

AlPcS2aを介した発色団支援レーザー不活性化(CALI)は、生細胞の細胞内小胞(IV)の時空間的損傷を研究するための強力なツールです。...

細胞内小胞破裂の機能を調べるための光力学的アプローチ

このプロトコルでは、蛍光顕微鏡を使用して再構成された膜テザー細胞骨格ネットワークのダイナミクスを研究するための、支持された脂質二重層の形成、および細胞骨格フィラメントとモータータンパク質の添加について説明します。...

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

サーモプラズモニック穿刺法は、共焦点顕微鏡、光ピンセット、金ナノ粒子を統合して、細胞や巨大な単層小胞の原形質膜修復中のタンパク質応答を研究します。この技術により、迅速かつ局所的な膜穿刺が可能になり、複雑な原形質膜修復機構における重要なタンパク質とその機能的役割を同定することができます。...

生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

学ぶ2光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法。ジスフェリン症患者線維芽細胞の膜再封入能をリアルタイムで定量化し、筋ジストロフィーの病態理解と治療開発に貢献する技術を習得できます。

2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法

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