שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9
April 10th, 2018
עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשיג שיבוש גנים מהיר ויעיל באמצעות CRISPR/Cas9 ותאי אב המטופויאטיים ראשוניים באמצעות גישת ריבונוקלאופרוטאין. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחומי המטופואיזיס נורמלי וממאיר, כגון מהן ההשלכות המולקולריות והפנוטיפיות של אובדן הגן X.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה, מהירה וחסכונית במיוחד. הזמן המשוער הדרוש משלב הרעיון של הניסוי ועד לביצועו קצר משבוע.
למרות ששיטה זו עברה אופטימיזציה עבור תאי אב המטופויאטיים, ניתן ליישם אותה על סוגי תאים אחרים, כגון תאי T ראשוניים, קווי תאים המטופויאטיים של עכברים ובני אדם ודגימות לוקמיה ראשוניות. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהבנו כיצד גישות אחרות של מתן CRISPR/Cas9, כולל פלסמידים ווירוסים, היו רעילות לתאים שלנו או שזמני האספקה שלהן היו איטיים. על מנת לעצב RNA מדריך יחיד מעניין, נווט תחילה לאתר CRISPRscan.
בהתבסס על התא המבוקש, לחץ על כפתור העכבר או האדם ולאחר מכן הזן את הגן המעניין בתיבת החיפוש של UCSC ולחץ על בצע. לאחר מכן, התקרב לאקסון שאליו ברצונך למקד. בדוק אם רצפי יעד RNA חד-מובילים רשומים תחת תחזיות CRISPRscan בכותרת גנים.
לאחר מכן, לחץ על RNA מוביל יחיד מטרה המסומן כמלבן ירוק והעתק את הרצף המלא המוצג תחת רצף אוליגו. לאחר מכן הדבק את הרצף במסמך טקסט. לאחר מכן, הוסף את הנוקלאוטידים ATAGC לשלושת הקצה הראשוני של הרצף.
בצע את ההזמנה עבור הרצף באורך מלא. כעת, כדי לסנתז את תבנית ה-DNA עבור ה-RNA היחיד-מדריך, יש להמיס ולאחר מכן לדלל את ה-RNA החד-מוביל קדימה ואת הפריימרים ההפוכים האוניברסליים. לאחר מכן הוסף את כל הריאגנטים בצינור PCR כדי לבצע את ה-PCR החופף.
לאחר יצירת תגובת ה-PCR, הנח את הצינור בתרמו-סייקלר והפעל את התוכנית. לאחר סיום התוכנית, טהר את מוצר ה-PCR באמצעות עמודות טיהור DNA. לדלל את ה-DNA ב-11.5 מיקרוליטר של מאגר פליטה.
לאחר מכן, השתמש במאגר הפליטה כריק בספקטרופוטומטר. מדוד את ריכוז ה-DNA של הדגימה על הספקטרופוטומטר. ראשית, מערבבים את ה-DNA המנומק, פוספטים דאוקסי-נוקלאוטיד, מאגר התגובה ותערובת האנזים T7 RNA פולימראז בצינורות רצועת ה-PCR.
לאחר מכן דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר מכן, מרחו את חומר הניקוי RNase כדי להסיר RNase מהכפפות בשימוש. לאחר מכן, התאם את הנפח של כל דגימת RNA ל-50 מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז.
טהר את ה-RNA בהתאם להוראות היצרן. לבסוף, יש להוציא את ה-RNA ב-50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. ראשית, השתמש במים נטולי נוקלאז כדי לרוקן את הספקטרופוטומטר ולאחר מכן למדוד את ריכוז ה-RNA המנופח.
השתמש באי-הכללה של טריפן כחול כדי לספור את מספר התאים. עבור כל שכפול, אסוף 200,000 תאים ברי קיימא לכל שכפול, ולאחר מכן הוסף מי מלח חוצץ פוספט כדי לשטוף את התאים. ואז סובב את הצינור ב -300 פעמים גרם למשך שבע דקות.
לאחר צנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט. במהלך הצנטריפוגה, דגרו 1.5 מיקרוגרם של Cas9 עם מיקרוגרם אחד של RNA יחיד בצינור PCR למשך 20 עד 30 דקות. זאת כדי להכין את מתחמי Cas9-sgRNA RNP עבור כל שכפול.
לאחר חישוב נפח מאגר ההשעיה T הנדרש, ממיסים את כדור התא המתקבל במאגר ההשעיה T.לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים המומס בצינור ה-PCR עם מתחמי Cas9-sgRNA RNP. לאחר מכן, הפעל את יחידת האלקטרופורציה. החלק את הקובטה למחזיק הקובטה.
לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של מאגר E.הגדר את התנאים במכשיר האלקטרופורציה. כדי לבצע את האלקטרופורציה, החזק תחילה את פיפטת האלקטרופורציה ולאחר מכן הושיט את הטופר ותפס את הדיסק בתוך קצה הפיפטה, ולאחר מכן לחץ בחוזקה על הפיפטה כלפי מטה כדי להדק את הקצה. לאחר מכן, מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
צייר 10 מיקרוליטר מהדגימה וודא שאין בועות אוויר. לאחר מכן, הכנס את הקצה ישירות למאגר האלקטרוליטי בקוביית האלקטרופורציה. לאחר מכן לחץ על התחל על המסך.
תן להודעה המלאה להופיע על המסך. ואז הסר את הפיפטה מהקובטה. לאחר מכן, הוציאו תכולה מהקובטה לבאר המלאה במדיום תרבית HSPC חדש.
כדי לחקור את היעילות של אלקטרופורציה של Cas9-sgRNA RNP, HSPCs שבודדו מהעכברים עוברים אלקטרופורטציה עם RNase מדריך יחיד המכוון ל-GFP או tdTomato. HSPCs אלה ביטאו בכל מקום GFP או tdTomato. ניתוח זרימה ציטומטרי מראה כ-75 ו-74% אובדן של ביטוי GFP או tdTomato ב-HSPCs ברמת החלבון.
לאחר מכן, בדיקה מבוססת T7 endonuclease one מבוצעת עם DNA מוגבר PCR ממיקום ה-GFP של התאים האלקטרופורטיים. זאת כדי לכמת את יעילות שיבוש הגנים של GFP. תוכנת ImageJ משמשת לחישוב היחס בין העוצמות של הרצועות השסועות לרצועות הבלתי מחורצות כדי לחשב את אחוז המחשוף.
היעילות של שלושה RNA מובילים יחידים שונים המכוונים ל-CD45 אנושי נבדקת בקו התאים HL-60 AML. ציטומטריית זרימה מציגה את RNA1 עם מדריך יחיד כיעיל ביותר עם יעילות נוקאאוט של 98% בהשוואה לבקרה. לאחר מכן, נוקאאוט CD45 מבוצע גם ב-HSPCs חיוביים ל-CD34 בדם טבורי אנושי ראשוני באמצעות RNA1 מוביל יחיד.
ניתוח ציטומטריית זרימה מראה כמעט 80% תאים עם אובדן CD45 ללא שינוי בביטוי CD34 בהשוואה ל-Cas9 בלבד. על מנת לחקור השתלה של HSPCs אנושיים מסוג CD45, תאי מח עצם וטחול נקצרים מעכברי NSG חיוביים ל-CD34 שעברו טרנספטציה רטרו-אורביטלית לניתוח, ומראים תאים ערוכים כחיוביים ל-HLA-ABC ו-CD45 שליליים. לאחר השליטה, ניתן להשלים פרוטוקול זה תוך שלושה ימים, אם הוא מבוצע מתוקן.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על כל המשטחים והריאגנטים נקיים מ-RNase, לוודא שיבוש גנים יעיל בטכניקות מרובות ולהשתמש בבקרות הניסוי המתאימות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן, לסנתז ולהעביר ריבונוקלאופרוטאינים Cas9-sgRNA לתאי אב המטופויאטיים כדי להשיג שיבוש גנים מהיר ויעיל.
סקירה
מאמר זה מתאר פרוטוקול לשיבוש גנים מהיר באמצעות CRISPR/Cas9 בתאים המטופויטיים ראשוניים של עכבר ובני אדם באמצעות גישה של ריבונוקלאופרוטאין. השיטה מאפשרת יעילות עריכה גבוהה עם מינימום זמן ועלות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- עריכת גנים
- ביולוגיה של תאים המטופויטיים
- טכנולוגיית CRISPR/Cas9
רקע
- CRISPR/Cas9 הוא כלי רב עוצמה לשיבוש גנים.
- תאים המטופויטיים ראשוניים חיוניים לחקר ההמטופואזה.
- שיטות משלוח מסורתיות ל-CRISPR יכולות להיות רעילות או איטיות.
- פרוטוקול זה נועד לשפר את היעילות ולהפחית עלויות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה מהירה ויעילה לשיבוש גנים.
- לחקור את ההשפעות של אובדן גנים בתאי מקדם המטופויטיים.
- לספק פרוטוקול שיחול על סוגי תאים שונים.
שיטות ששימשו
- תכנון RNA מנחה יחיד באמצעות CRISPRscan.
- סינתזת RNA והכנת קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין Cas9-sgRNA.
- אלקטרופורציה של תאים המטופויטיים ראשוניים עם קומפלקסים של RNP.
- הערכת יעילות שיבוש הגנים באמצעות ציטומטריה של זרימה ובדיקות אנזים T7 אנדונוקלאז.
תוצאות עיקריות
- הושג אובדן של כ-75% בביטוי הגן המטרה ב-HSPC.
- הוכחה יעילות נוק-אאוט של 98% בקו תאים HL-60 AML.
- הוכח שיבוש גנים יעיל בתאי דם טבורי ראשוניים של בני אדם.
- אושר השתלה של תאים ערוכים בעכברי NSG.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל וניתן להשלים אותו תוך שבוע.
- הוא חל על סוגים שונים של תאים המטופויטיים.
- שמירה על תנאים ללא RNase חיונית להצלחה.
שאלות נפוצות
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
sgRNA Fwd Primer Design, DNA Template Synthesis, and ln Vitro Transcription of sgRNA
3:38
Cas9-sgRNA Complexing and Electroporation
5:45
Results: Use of Cas9-sgRNA Electroporation Protocol to Study Efficient Knockout of Target Gene
7:48
Conclusion
