Name: 一种基于管尖的液滴微流化平台种子细胞的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 了解如何使用管尖加载技术将稀有细胞高效封装于液滴微流控装置中。该方法利用PDMS芯片生成液滴，适用于Jurkat T细胞及浆细胞样树突状细胞等稀有细胞类型，助力系统免疫学研究中细胞异质性与细胞间通讯的分析。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢埃因霍温理工大学的大力支持。

1. 三入口聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置的制备
<ol>
	<li>在调理混合杯中称取40 g PDMS基液，并使用滴管小心地向杯中的基液加入4 g PDMS固化剂。</li>
	<li>将杯子放入调理混合器的支架中，测量杯子与支架的总重量，并相应地设置调理混合器的离心平衡配重值。</li>
	<li>在调理混合器中以2,000 rpm转速混合基液与固化剂2分钟，随后以2,000 rpm转速脱泡2分钟。</li>
	<li>准备一个直径约与100 mm硅片相当的铝舟。将用于复制模塑工艺的硅片放入铝舟中，并将此装置置于培养皿中（直径 = 120 mm，高度 = 20 mm）。 
	注意：培养皿的尺寸取决于硅片的尺寸。</li>
	<li>将杯子从支架上取下，并小心地将预固化PDMS混合物（杯内内容物）倒入硅片上。</li>
	<li>将含有带预固化PDMS混合物硅片的培养皿放入真空干燥器中约20分钟，以去除所有气泡。</li>
	<li>20分钟后取出培养皿，检查是否仍有可去除的残留气泡。</li>
	<li>将培养皿放入设定为65 °C的烘箱中，至少加热3小时。</li>
	<li>3小时后从烘箱中取出培养皿，并小心地将固化的PDMS从硅片上剥离。</li>
	<li>使用刀片或手术刀沿切割线切割PDMS器件。使用1.2 mm打孔器在每个器件的入口和出口处打孔。用透明胶带清洁每个PDMS器件，以去除灰尘或残留的PDMS碎屑。
	<ol>
		<li>可选步骤：用氮气吹扫以去除残留的PDMS碎屑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过使用肥皂水清洗玻璃载片，随后用异丙醇清洗，并用氮气吹干，以准备玻璃载片。</li>
	<li>在等离子体灰化仪中将洁净的PDMS器件与洁净的玻璃载片键合，以封闭流道。使用以下参数：功率：50 W，时间：45 s，排气延迟时间：2 s，工艺气体：气体1（空气），通气：两个阀门，受限通气时间：60 s，泵降速时间：10 s，通气保持时间：0 s，气体关闭时间：1 s，启用涡轮抽气：0。断开所有其他气体管线。 
	注意：等离子体灰化仪所用参数可能因仪器品牌不同而有所变化。</li>
	<li>通过将50 µL硅烷（1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷）加入950 µL氟化油中，配制硅烷溶液。 
	注意：硅烷具有毒性，请在通风橱中操作。</li>
	<li>用连接聚四氟乙烯（Teflon）管路的注射器吸取已配制的硅烷溶液。</li>
	<li>通过器件出口冲洗已配制的硅烷溶液，对器件进行硅烷化处理。</li>
	<li>将器件放入设定为65 °C的烘箱中，加热30分钟。</li>
	<li>从烘箱中取出硅烷化处理后的器件，并用氟化油冲洗以去除器件内多余的硅烷。</li>
	<li>将器件重新放回设定为65 °C的烘箱中，至少加热1小时，以完成键合过程。 
	注意：此处可暂停本实验方案。</li>
</ol>
2. 无损耗细胞封装
<ol>
	<li>细胞收获
	<ol>
		<li>将Jurkat T细胞重悬于Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中，浓度分别为1.0×106 个细胞/mL、2.0×106 个细胞/mL、4.0×106 个细胞/mL和8.0×106 个细胞/mL；将pDCs细胞重悬于无血清造血细胞培养基（例如X-VIVO 15）中，浓度分别为1.3×106 个细胞/mL、3.0×106 个细胞/mL和13.0×106 个细胞/mL；将A549细胞重悬于Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，浓度为1.0×106 个细胞/mL。 
		注意：细胞类型和细胞浓度可根据实验需求调整。细胞标记也可根据实验设计进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于水相液滴生成的吸头装载
	<ol>
		<li>通过将3&#160;mL生物相容性表面活性剂加入2&#160;mL氟化油中，配制含3%表面活性剂的氟化油混合液。 
		注意：添加至氟化油中的表面活性剂浓度决定了乳液在不同孵育时间下的稳定性。表面活性剂的浓度需根据特定细胞类型所用培养基的不同而调整。</li>
		<li>用注射器（1 mL）吸取油相混合液，去除注射器中的气泡，并将其连接至适当长度的聚四氟乙烯（Teflon）管路。</li>
		<li>用另一支注射器吸取生物相容性矿物油作为样品注射器，去除气泡后连接至适当长度的Teflon管路。</li>
		<li>从已固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）平板上打取直径为5 mm的PDMS塞。 
		注意：固化PDMS平板可按照步骤1.1至1.9制备。此处使用普通硅片而非图案化硅片。</li>
		<li>使用直径1 mm的打孔器在该塞子中心再打一个孔。</li>
		<li>从较大一端将PDMS塞插入200 µL移液吸头中，确保其紧密贴合。 
		注意：对于较大样品体积或较大细胞，可使用1,000 µL移液吸头。对于1,000 µL吸头，可使用直径在5 mm至7 mm之间的PDMS塞。使用直径5 mm的塞子时，可在吸头中吸取约400 µL样品；若使用更大直径（7 mm）的塞子，则可吸取更多样品（约900 µL）。</li>
		<li>将连接至注射器的管路插入已置于移液吸头内的PDMS塞中，缓慢推动注射器活塞，使矿物油充满连接的移液吸头，并排出所有残留空气。</li>
		<li>将连接注射器的移液吸头浸入样品溶液中，吸取约150 µL样品至吸头内。</li>
		<li>重复步骤2.2.4至2.2.8，制备第二个样品注射器。</li>
		<li>小心地将三个已准备好的注射器放置于注射泵上。</li>
		<li>将两个含有样品的移液吸头分别插入PDMS芯片的两个内侧进样口，将含有油相混合液的管路插入外侧进样口。</li>
		<li>在注射泵上设定流速如下：连续相溶液流速为600 µL/h，每个细胞样品流速为100 µL/h。输入并设定注射器的尺寸参数。 
		注意：注射器直径设置需根据所用注射器类型进行调整。</li>
		<li>启动泵，使样品溶液流经装置的内侧通道，油相流经外侧通道，进行冲洗。</li>
		<li>在出口处连接适当长度的管路，待液滴形成稳定后开始收集液滴。收集时间根据实验需求而定。</li>
		<li>将液滴收集至锁扣管中。在收集的液滴上方加入200 µL不含血清的RPMI培养基，并孵育样品。 
		注意：收集液滴的孵育时间根据实验需求而定。当需要通过破乳释放细胞后进行流式细胞术分析或细胞分离时，应将液滴收集于锁扣管中。若实验需进行液滴内显微观察，也可将液滴收集于玻璃腔室中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乳液破乳与细胞回收用于流式细胞术分析
	<ol>
		<li>通过将2 mL 1H,1H,2H,2H-全氟辛醇（PFO）加入10 mL氟化油中，配制20%（v/v）PFO溶液。</li>
		<li>使用注射器从含有液滴的收集管底部去除多余的油相。</li>
		<li>向乳液中加入100 µL 20% PFO溶液以破坏乳液结构，释放包封的细胞至水相中。轻弹并短暂混匀。此时切勿涡旋。孵育1–2分钟。 
		注意：PFO的添加量取决于所生成液滴的数量。需持续添加PFO直至油层完全溶解。需注意PFO对细胞具有毒性，过高浓度的PFO或过长的孵育时间可能导致细胞死亡率升高。</li>
		<li>以尽可能低的相对离心力（rcf）短暂离心30秒。</li>
		<li>配制100 mL含2%胎牛血清（FCS）的冷磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（在98 mL PBS中加入2 mL FCS）。</li>
		<li>离心后立即吸取550 µL水相部分，转移至另一新锁扣管中，该管内已预加500 µL按步骤2.3.5配制的含2% FCS的冷PBS溶液。让任何残留油相沉降至新锁扣管底部。</li>
		<li>小心吸取该锁扣管中含细胞的水相950 µL，避免吸入残留油相，并将溶液转移至另一新锁扣管中。</li>
		<li>在新锁扣管中将细胞以10分钟离心沉淀。</li>
		<li>用300 µL按步骤2.3.5配制的含2% FCS的冷PBS溶液重悬细胞。 
		注意：根据实验需求，细胞也可重悬于其他适宜溶液（如培养基）中。根据实验设计对细胞进行染色，用于流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞配对
<ol>
	<li>细胞收获与染色
	<ol>
		<li>计数培养瓶中的Jurkat T细胞，并在1,500 rpm下离心5分钟。</li>
		<li>去除上清液，重悬 1.0x106 1 mL PBS 中的细胞，使其浓度为 1.0×106 细胞/毫升。加入的PBS体积取决于细胞数量。</li>
		<li>重复步骤 3.1.1 至 3.1.2，制备第二份具有相同细胞浓度的 Jurkat T 细胞样品。</li>
		<li>用1 mL PBS以1,500 rpm离心洗涤两个样品，每次5分钟，重复两次。</li>
		<li>用1.25 µM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染料重悬一个细胞样品，用1.25 µM远红染料或1.25 µM细胞增殖染料重悬另一个细胞样品，细胞浓度为1.0×10⁶个/mL6 细胞/mL。每1.0×10⁶细胞使用1 mL总染色溶液6 细胞 
		注意：可根据流式细胞仪或荧光显微镜所配备的滤光片，使用不同的染料对细胞进行标记。</li>
		<li>将细胞样品与染料在37 °C下孵育10分钟。</li>
		<li>10 分钟后加入 1 mL 冰冷的 FCS 以终止染色反应。</li>
		<li>用1 mL PBS以1,500 rpm离心5分钟，洗涤细胞样品两次。</li>
		<li>用 RPMI 培养基重悬细胞样品，浓度为 10.0×106 每种颜色的细胞数/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尖端加载法用于生产琼脂糖水凝胶微滴以实现细胞配对 
	注意：使用琼脂糖水凝胶液滴进行细胞配对时，在液滴生成和收集的整个过程中，需将系统温度维持在 27 °C 至 37 °C 之间，以防止水凝胶过早凝固，并保证细胞活性9.
	<ol>
		<li>将超低凝胶温度琼脂糖在 PBS 中加热至 75 °C，配制成 4% (w/v) 浓度的溶液，并搅拌 20 分钟。</li>
		<li>将琼脂糖溶液与标记的Jurkat T细胞混合，使琼脂糖终浓度为2%（w/v）。对另一份含有不同标记细胞的样品重复此操作。</li>
		<li>将20 mL表面活性剂加入30 mL氟化油中，配制含2%表面活性剂混合物的氟化油（油相混合物）。</li>
		<li>按照步骤 2.2.2 - 2.2.14 操作。 
		注意：由于低熔点琼脂糖具有较高的黏度，为确保液滴稳定生成，将注射泵的流速设置如下：油相混合物：2,000 µL/h，细胞样品：200 µL/h。输入并设置注射器的尺寸。</li>
		<li>将液滴收集到锁紧管中，在 4 °C 下孵育 60 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乳液破乳及琼脂糖微珠回收用于流式细胞术分析
	<ol>
		<li>孵育液滴60分钟后，使用注射器从含有液滴的锁管中移除多余的油相。</li>
		<li>加入 200 µL PFO 以去除液滴中的油相界面。 
		注意：加入试管中的PFO量取决于生成的液滴数量。持续添加PFO，直至油层完全溶解。</li>
		<li>将收集的琼脂糖珠用1 mL冰冷的PBS洗涤两次，每次在1,500 rpm下离心10分钟，以彻底去除油相。</li>
		<li>使用流式细胞术分析收集的琼脂糖微珠。 
		注意：也可在荧光显微镜下观察珠子。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yin, H., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for single cell analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture+Models+in+Microfluidic+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell Culture Models in Microfluidic Systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).</li>
<li>Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+technology+for+manipulation+and+analysis+of+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells.</a> Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).</li>
<li>Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+cell+array+with+individually+addressable+culture+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers.</a> Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+microenvironment+for+cellular+studies+via.+microfluidics-generated+double+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions.</a> Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).</li>
<li>Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab on a chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell+pairing+in+droplets+using+dual-color+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting.</a> Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Chokkalingam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+heterogeneity+in+cytokine-secreting+immune+cells+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 13 (42), 4740(2013).</li>
<li>den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activation+of+the+adaptive+immune+system%3A+Cross-talk+between+antigen-presenting+cells%2C+T+cells+and+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells.</a> Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).</li>
<li>Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -Y., Wu, M. C., Kim, C. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWOD-driven+droplet+microfluidic+device+integrated+with+optoelectronic+tweezers+as+an+automated+platform+for+cellular+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis.</a> Lab on a Chip. 9 (12), 1732(2009).</li>
<li>Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturising+the+laboratory+in+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Miniaturising the laboratory in emulsion droplets.</a> Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).</li>
<li>Lagus, T. P., Edd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+co-encapsulation+of+self-ordered+cell+trains%3A+cell+pair+interactions+in+microdroplets%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets.</a> RSC Advances. 3, 43(2013).</li>
<li>Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+modeling+of+single+target+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Statistical modeling of single target cell encapsulation.</a> PLoS ONE. 6 (7), (2011).</li>
<li>Abate, A. R., Chen, C. -H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).</li>
<li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poisson+distribution+and+beyond%3A+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li>
<li>Kemna, E. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+cell+ordering+and+deterministic+cell-in-droplet+encapsulation+using+Dean+flow+in+a+curved+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel.</a> Lab on a Chip. 12 (16), 2881(2012).</li>
<li>Köster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drop-based+microfluidic+devices+for+encapsulation+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells.</a> Lab on a Chip. 8 (7), 1110(2008).</li>
<li>Mazutis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+ex+vivo.+blood+myeloid+and+plasmacytoid+dendritic+cells+after+infection+with+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus.</a> Virology. 383 (2), 207-215 (2009).</li>
<li>Tel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+drug+oxaliplatin+differentially+affects+blood+DC+function+dependent+on+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).</li>
<li>Wimmers, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+that+stochasticity+and+paracrine+signaling+control+interferon-alpha+production+by+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 3317(2018).</li>
<li>Gong, J., Kim, C. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-electronic+droplet+generation+on-chip+with+real-time+feedback+control+for+EWOD+digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (6), 898(2008).</li>
<li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+epitaxy+by+acoustic+picolitre+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets.</a> Lab on a Chip. 7 (9), 1139(2007).</li>
<li>Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -W., Gardeniers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Delivery+of+Reagents+from+a+Pipette+Tip+to+a+PDMS+Microfluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+and+Tips%22%5BJournal%5D)">Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device.</a> Chips and Tips. , (2015).</li>
<li>Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Pressure-+And+Electrokinetically+Driven+Flows+through+Open+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries.</a> Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).</li>
<li>Whitesides, G. M., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+methods+for+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Today%22%5BJournal%5D)">Flexible methods for microfluidics.</a> Physics Today. 54, 42(2001).</li>
<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-proinflammatory+Effects+of+Iodixanol+%28OptiPrep%29-Based+Density+Gradient+Purification+on+Human+Islet+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations.</a> Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).</li>
<li>Dura, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+lymphocyte+interactions+at+the+single-cell+level+by+microfluidic+cell+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).</li>
<li>Dura, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+multiparameter+assay+of+lymphocyte+interactions+from+onset+by+microfluidic+cell+pairing+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).</li>
<li>Yamanaka, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+dynamics+and+functional+outcomes+of+interactions+between+human+natural+killer+cells+and+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells.</a> Integrative Biology. 4 (10), 1175(2012).</li>
<li>Satija, R., Shalek, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+immune+responses%3A+From+populations+to+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells.</a> Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

在本实验方案中，我们展示了一种高效且简便的技术，用于将细胞加载并封装到液滴中，以实现高通量的单细胞分析，并进行可控的细胞配对，用于细胞相互作用研究。此外，我们比较了多种将细胞加载至微流控装置的传统方法，结果表明，与其它方法相比，我们所采用的尖端加载法是一种更为高效的细胞加载技术。
通过基于液滴的微流控技术研究临床样本或数量稀少的稀有细胞类型存在一些固有挑战。正如我们已证实的，细胞倾向于在注射器及管路表面发生沉降，从而导致细胞包封效率无法达到预期预测值。为避免这一问题，一些研究团队在注射器中使用搅拌子。然而，当处理稀有且数量有限的细胞群体时，总体细胞体积也十分有限，因而难以使用大体积注射器和搅拌子。此外，我们曾尝试用聚四氟乙烯（Teflon）涂层管路替代常用的普通管路以减少细胞黏附，但该方法并未改善实验结果；若管路过长，细胞黏附问题反而更加严重（数据未显示）。作为替代方案，我们采用垂直管路加样法，将细胞直接加载至管路中而非注射器内，以避免细胞在大体积注射器中损失。利用该技术，可实现小体积样本的加样，例如数量稀少且有限的浆细胞样树突状细胞（pDCs）。同时，样本通过垂直方向从管路加载至微流控装置，以防止细胞沉降。用于细胞接种的管路尺寸较小，可类比于微通道。管路内的流动由压力驱动，并遵循抛物线速度分布26。这意味着管路中心处流速最大，而管壁边缘处流速最小27。当细胞群体随流体通过管路时，速度梯度会将细胞推向流速接近于零的管壁边缘，导致细胞在边缘处沉降。因此，细胞在管路内的沉降或积聚会降低包封效率，这一点在代表性结果中已得到体现：实验数据与理论预测模型并不吻合。
科学家在进行液滴微流控实验时，另一种常用的解决方案是通过添加密度匹配试剂（如碘克沙醇）来增加细胞培养基的密度，以防止细胞在注射器中发生沉降19。然而，密度匹配试剂可能影响细胞行为，并对细胞的细胞因子分泌产生不利影响（数据未显示）28。
尽管对传统细胞加载技术进行了一些大大小小的改进，使包封效率略有提升，但实验结果仍未能达到理论计算值。然而，通过尖端加载法，我们能够克服先前方法的局限性，突破由泊松统计规律主导的包封效率限制。该技术不仅适用于悬浮细胞的加载，还可应用于贴壁细胞（如原代角质形成细胞和A549细胞）在微流控芯片上的加载。当使用大量细胞系（例如A549、K562）时， 等等。，可以使用更大的样品体积。因此，根据样品体积的不同，也可选用不同规格的移液器吸头，该简单技术可适用于单细胞封装和多细胞封装。
虽然低细胞浓度有助于确保液滴中包裹单个细胞，但为了提高每个液滴中平均包裹的细胞数量以用于细胞配对相关研究，通常需要较高的细胞浓度。已有多种单细胞方法被报道，可用于在微流控芯片或微加工纳米孔中实现免疫细胞的配对。29,30,31在液滴微流控技术中，泊松统计学表明，通过优化两种不同类型细胞的浓度，可实现1:1的细胞配对。根据泊松分布预测，液滴中也可能存在其他细胞组合形式。尽管1:1细胞配对有利于在单细胞水平研究细胞间相互作用，并有助于加深对细胞行为的理解，但多细胞配对同样具有重要优势。它能够揭示一种细胞类型的多个细胞对另一种细胞类型的影响。不同免疫细胞之间的相互交流有助于针对多种感染和病原体产生有效的免疫应答，同时增强免疫系统的稳健性。32因此，可以在不同背景下以高精度探究细胞间通讯。 例如， 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, 等等从而加深了对单个或成对细胞如何调控免疫反应启动机制的理解。这一现象尤其适用于研究自然杀伤细胞或细胞毒性T细胞连续杀伤其相应靶细胞的能力。
如前所述，为了在液滴中实现多重细胞包封，需要更高的细胞浓度。然而，当从单一入口加载细胞进行包封时，较高的细胞样品浓度可能导致细胞在入口处发生聚集，从而降低包封效率，并使实验结果与理论值产生较大偏差。为避免这一问题，可同时从两个独立的入口加载细胞。理论上，还可设计具有更多入口的微流控装置，以实现更高的细胞包封水平，满足平均包封 x 个细胞的需求。在本研究中，我们在保持总浓度相同的条件下，分别比较了从单一入口和双入口加载Jurkat T细胞的包封效率，结果表明两者的包封效率相似。该改进方法使研究人员能够在芯片上组合不同类型的细胞。
尽管该方法有助于在无显著细胞损失的情况下将细胞加载至微流控装置，但仍需注意某些事项。在用矿物油填充注射器以及用移液器吸头吸取细胞样品时，应避免混入气泡，确保整个系统无空气。还需注意，矿物油不应与样品混合。含有样品的移液器吸头应牢固插入微流控装置的入口，并采取最大程度的预防措施，以防止泄漏及进一步引入气泡。总之，尖端加载法是一种简单而稳健的技术，能够以经济高效的方式实现细胞的高通量行为分析，通过细胞封装且无显著细胞损失。当在入口处使用最佳样品浓度时，这种利用移液器吸头加载细胞的方法具有很高的灵活性，可适用于不同类型的细胞，特别是稀有的原代免疫细胞，从而获得接近理论预测模型的更高封装效率。

近年来，微流控技术作为一种强大且多功能的单细胞水平细胞分析平台，其应用迅速增加1这些平台利用极小的样本量，以高通量方式对单个细胞和生物分子进行高精度、高灵敏度的筛选。2,3,4在各类微流控设计中，基于液滴的平台通过将单个细胞分离至由不相混相包围的水相液滴中，实现了对细胞微环境的精确且准确的控制，从而支持高通量的单细胞分析5,6基于液滴的微流控技术具有灵活性，可将单个或多个细胞分离至水相或水凝胶液滴中，在研究复杂的细胞行为（如蛋白质分泌或细胞间相互作用）方面具有重要价值7,8,9. 免疫细胞之间的信号传导与相互作用可受到微环境中其他细胞相互作用的影响10在液滴中分离单个细胞可提供一个有效的无噪声分析实验室环境，避免外部环境因素的干扰，从而获得更高效、更准确的结果11,12通过修改具有多个入口的液滴微流控平台设计，可实现多种细胞类型的包封，以研究细胞间相互作用 通过 细胞配对12,13.
细胞在液滴中的包封过程是随机的，其包封率可通过泊松分布公式进行统计学确定14,15。该包封率可通过考虑细胞到达液滴连接处的平均到达速率，并假设每个细胞的到达与其他细胞的到达相互独立来估算16。尽管无法完全保证细胞到达的独立性，但在细胞分布稀疏的情况下，可近似认为满足独立性假设，并可将液滴中含有一个或多个细胞的概率表示为每个液滴中细胞数量及每液滴平均细胞数的函数16,17。由于对液滴中细胞包封的这一估算依赖于每个液滴中存在的细胞数量，因此可以推断，提高入口处的细胞浓度将增加每液滴中平均存在的细胞数量16。因此，为确保单细胞包封，必须降低细胞浓度，但这通常会导致大量液滴为空液滴18。
在将细胞加载至注射器、管路或生产装置的过程中，由于细胞黏附、沉降和/或聚集导致的细胞损失，是造成实际包封率与预测包封率出现偏差的常见问题19。当接种稀有免疫细胞或临床样本时，这一问题尤为突出，因为这些细胞本身数量稀少，若包封的细胞数量远低于预期，则无法为实验分析提供足够的数据。浆细胞样树突状细胞（pDCs）是一类稀有的免疫细胞亚群，仅占全部白细胞总数的约0.2%–0.6%20。这类细胞在激活后可分泌大量I型干扰素，因此在免疫应答中发挥关键作用21。在研究此类稀有细胞于液滴中的细胞行为时，必须避免在细胞接种和包封过程中发生细胞损失22。近年来已有多种基于设计的改进方法，通过主动包封技术结合声学或电学等不同物理力，实现了单细胞液滴的生成与包封23,24。然而，这些方法在液滴生成效率方面仍存在一定的局限性16。
本研究建立了一种稳健且简便的方法，克服了传统方法在将单个或多个细胞加载至微流控装置时存在的不足。该方法借鉴了 Rho et al. 的思路，利用不同尺寸的移液器吸头，将少量稀有免疫细胞接种至液滴微流控平台，避免了显著的样品损失，所得结果与理论预测一致25。该技术可轻松且成功地适用于多种基于液滴的微流控应用，并可用于多种细胞类型甚至微粒。

<table><tbody><tr><td>1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>171468-5G</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷</td><td>Fluorochem/UK</td><td>S13150</td><td>硅烷（有毒）</td></tr><tr><td>琼脂糖（超低凝胶温度）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;带鲁尔锁头的一次性注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>10630694</td><td>注射器</td></tr><tr><td>1.2 mm 活检穿孔器</td><td>Harris Uni-Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞增殖染料 eFluro 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace 远红细胞染料</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Eppendorf 管</td><td></td><td>Safe-Lok 管，1 mL 和 2 mL</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS294775X38-72EA</td><td>Corning 显微镜载玻片，平片，长 &amp;times; 宽 75&amp;nbsp;mm &amp;times; 38&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>哈佛泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>C-400750; C-400727</td><td>注射泵</td></tr><tr><td>HFE-7500 3M Novec 工程流体</td><td>Fluorochem/UK</td><td>51243</td><td>氟化油</td></tr><tr><td>5 mm Kai 活检穿孔器</td><td>Amstel Medical</td><td>1980130</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔短管接头</td><td>Instechlabs/USA</td><td>LS20S</td><td>鲁尔短管接头，20 号（粉红色）× 0.5 英寸（12 mm），非无菌</td></tr><tr><td>矿物油（轻质）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>片剂</td></tr><tr><td>Pico-Surf 1（Novec 7500 中 5%）</td><td>Sphere Fluidics</td><td>020317-09</td><td>表面活性剂</td></tr><tr><td>等离子体灰化仪</td><td>Emitech</td><td>K1050X&amp;nbsp;</td><td>等离子体灰化仪</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>硅弹性体基础剂 184</td><td>Sylgard</td><td>9355218</td><td>PDMS 基础剂</td></tr><tr><td>硅弹性体固化剂&amp;nbsp;</td><td>Sylgard</td><td>9355218</td><td>固化剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>不锈钢导管连接器</td><td>Instechlab/USA</td><td>SC20/15</td><td>20 号 × 15 mm，非无菌</td></tr><tr><td>TFE 聚四氟乙烯管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58696-U</td><td>PTFE 管&amp;nbsp; 长 &amp;times; 外径 &amp;times; 内径 50 英尺 &amp;times; 1/16 英寸 &amp;times; 0.031 英寸</td></tr><tr><td>Thinky 混合器 ARE-250</td><td></td><td>EX-4025F</td><td>预混处理</td></tr></tbody></table>

一种基于移液枪头的细胞接种至液滴微流控平台的方法

A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms

在常用于细胞分析的各种微流控平台设计中，液滴微流控技术通过消除外部因素对细胞微环境的影响，为在单细胞水平上分离和分析细胞提供了一种强有力的工具。细胞在液滴中的封装遵循泊松分布，取决于每个液滴中细胞的数量以及单位体积液滴内的平均细胞数。原代细胞，特别是免疫细胞或临床样本，往往数量有限，实现无细胞损失的封装仍具挑战性。本文中，我们提出一种新方法，利用移液枪头将细胞加载至基于液滴的微流控装置，从而避免细胞的显著损失。通过对多种细胞类型的实验，我们展示了液滴中高效的细胞封装效果，其结果与泊松分布预测的封装效率高度一致。该方法确保了细胞向微流控平台的无损加载，且可轻松适用于后续的单细胞分析，e.g., 解析不同类型细胞之间的细胞相互作用。

在实验中，我们使用了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的三入口微流控装置，其高度为25 µm（图1）。在此装置设置中，外侧入口用于冲洗含表面活性剂的油相，两个内侧入口用于冲洗含有细胞悬液或培养基的水相。液滴生成并收集后，在进行下游流式细胞术分析之前，需在芯片外孵育数小时。在孵育期间，培养基中存在的血清成分可能与表面活性剂发生相互作用，导致液滴不稳定并发生破裂。因此，向氟化油中添加优化浓度的表面活性剂至关重要。我们测试了含有添加2%人血清的无血清造血培养基的单分散液滴在不同表面活性剂浓度的氟化油中的稳定性。从图2可以推断，当油相中表面活性剂浓度至少为3%时，这些单分散液滴在24小时内具有高度稳定性。使用含或不含10%胎牛血清（FCS）的RPMI培养基也获得了类似结果（数据未显示）。因此，当使用不同来源的培养基和血清成分时，液滴的稳定性高度依赖于表面活性剂的最佳浓度。
为了验证本方法的包封效率，我们首先使用连接至注射器的管路接种细胞，这是最常规的细胞接种方法（图3A）。我们将Jurkat T细胞以1.0×106 cells/mL、2.0×106 cells/mL和4.0×106 cells/mL的不同浓度进行收获，结果获得的包封效率低于理论预测值（图3B）。在1.0×106 cells/mL浓度下，含有单个细胞的液滴比例为2.5%，即使提高细胞浓度，该比例也未增加。为了提高细胞加载效率，我们改进了先前的方法，将管路长度减半并将其固定在升高的三脚架上，同时将细胞悬液加载至连接PDMS装置的一半管路中（图4A）。采用该方法，我们分别以1.0×106 cells/mL、2.0×106 cells/mL和4.0×106 cells/mL的浓度包封了Jurkat T细胞，并以1.0×106 cells/mL、2.0×106 cells/mL和12.0×106 cells/mL的不同浓度包封了稀有的pDCs细胞。我们预期该方法可通过防止细胞沉降而提高包封率。然而，在所有测试浓度下，实验结果均显著低于理论泊松分布预测值（图4B和图4C）。
采用我们的尖端加样方法，我们优化了细胞包封率，获得的实验结果与统计学预测值一致图5A）。对于不同浓度的Jurkat T细胞，所获得的包封效率在所有浓度下均与我们计算的数值相符（图5B）。值得注意的是，即使对于倾向于成团的贴壁细胞（如 A549 肿瘤细胞），在细胞浓度为 1.0x10⁶ 个/mL 时，我们仍观察到封装效率略有提高。6 细胞/毫升（图5C）。我们还评估了该系统在不同细胞浓度（1.0×10⁶）下包封较为稀有且获取困难的pDCs的效率6 cells/mL，3.0×106 细胞/mL，以及13.0×106 细胞/毫升（图5D）。为了便于加载可能超过 200 µL, 例如在使用细胞系或更丰富的原代免疫细胞时，我们还通过以下方法研究了细胞包封效率 1000 µL 提示（蓝色）。我们证明了这些 1,000 µL 尖端在包封效率方面与之相比具有相似性 200 µL 提示（黄色）(图5E).
根据芯片设计和具体研究问题的不同，我们的尖端加样技术可用于通过单个入口加样细胞，以探究细胞异质性；或通过多个入口并行加样，以解析细胞间相互作用。我们比较了Jurkat T细胞（浓度为10.0×106 细胞/mL）从一个入口进入，分为两组带有不同标记的Jurkat T细胞（总浓度为10.0 × 106 细胞/mL）从两个入口（图6A 和 图6B）。在包封过程中，使用超低凝胶温度的琼脂糖生成液滴，液滴生成后即凝胶化，形成琼脂糖水凝胶微珠，可用于后续下游分析 通过 显微镜与流式细胞术（图6C 和 图6D）。显微分析显示，不同组合下均实现了细胞配对，表明具有高通量细胞配对能力（图6C）。此外，通过流式细胞术对同一群体的水凝胶微珠进行分析，发现可根据前向散射（FSC，大小）和侧向散射（SSC，颗粒度）的显著差异，将不含细胞的微珠与含细胞的微珠区分开来（图6D). 对不含细胞的微珠群体进行设门，证实了由于缺乏荧光信号，细胞未被包封。此外，对含有细胞的微珠群体设门揭示了多个亚群的存在，表明不同标记的Jurkat T细胞被包封。我们的结果表明，基于显微镜和流式细胞术分析，可实现高效的细胞配对，并显示出包封效率较泊松预测略有提高（图6E).
<img alt="用于液滴生成的微流控装置示意图；油相、培养基、细胞流；通道和滤膜尺寸已标注。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1。基于PDMS的三入口单出口液滴微流控芯片。 该芯片包含三个入口，分别用于连续油相、细胞培养基和细胞悬液。生成的液滴从出口处收集。样品以层流形式流向流动聚焦结点，并在此处被包裹形成液滴。在入口处，滤膜结构可阻挡蛋白质聚集体或细胞聚集体等大颗粒物质。滤膜结构中缝隙的直径由蓝色线条标示，生成喷嘴处通道的直径由红色线条标示。整个芯片的通道高度为25 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的液滴面积分析；图表比较了微流控研究中不同表面活性剂浓度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2．液滴在24小时内的稳定性。 图表显示了含有造血无血清培养基 + 2% 人血清的液滴面积随时间的变化情况，分别对应三种不同浓度的表面活性剂：A) 0.5% B) 3% C) 5%。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="基于微流控装置的PDMS芯片及细胞浓度与液滴数量关系图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3．基于管路的细胞加样方法。 使用连接管路的注射器将Jurkat-T细胞以不同浓度加载至装置中。A) 示意图显示实验装置；B) 通过光学显微镜测定的细胞包封率。圆点：实验测定值；实线：泊松分布。误差条表示均值的标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞包封过程、PDMS微流控装置、液滴图分析、细胞浓度效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4。采用垂直管加载方法在不同浓度下包封多种类型的细胞。 对不同浓度的Jurkat T细胞和pDCs进行包封，以确定细胞包封效率。 A） 示意图展示了垂直管加载方法的实验装置。B） 图表显示了Jurkat T细胞的包封效率。C） 图表显示了pDCs的包封效率。圆点：实验测定值；实线：泊松分布。误差条表示均值的标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微流控装置设置和液滴生成图；细胞浓度分析；PDMS系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5．通过吸头加载法包封不同类型细胞。A）吸头加载技术的示意图。B）图表显示Jurkat细胞的包封效率。C）图表显示A549细胞的包封效率。D）图表显示pDC细胞的包封效率。E）图表显示使用200 µL吸头（黄色）和1,000 µL吸头（蓝色）包封Jurkat T细胞的效率。圆点：实验测定值；实线：泊松分布。误差线表示平均值的标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微液滴微流控分析；示意图、图表、显微镜图像；泊松分布、细胞计数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6．微液滴中的细胞配对。A）通过两个入口将不同细胞在微液滴中配对的尖端加样方法示意图。B） 图中显示使用单个入口或两个并行入口封装Jurkat T细胞的情况。单个尖端的细胞浓度为2.0×106 个细胞/mL，两个尖端各自的细胞浓度均为1.0×106 个细胞/mL。圆点：实验测定值；实线：泊松分布。C） 羟基凝胶微珠与标记的Jurkat T细胞的荧光显微镜叠加图像。D） 琼脂糖水凝胶微珠中配对细胞的流式细胞术分析图。该图显示前向散射和侧向散射信号。E） 荧光显微镜与流式细胞术检测琼脂糖水凝胶微珠中细胞数量的比较。柱状图：平均值；须线：平均值的标准误差，n ≥ 4。误差线代表平均值的标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用移液器吸头将稀有细胞群体接种至液滴微流控装置的实验方案，以提高细胞在液滴中的包封效率。

在常用于细胞分析的各种微流控平台设计中，液滴微流控技术为分离和...

将该方法与基于液滴的微流控技术相结合，有助于回答系统免疫学领域中的关键问题，例如编码单个细胞或病原体之间的细胞异质性及细胞间通讯。我们所开发的这一技术的主要优势在于，这种吸头加载方法能够实现稀有细胞在液滴中的封装，其封装比例与预测的百分比分布高度一致。对该方法的可视化演示对于理解如何使用移液吸头将细胞加载至特定液滴以及如何从液滴中回收细胞至关重要。进行水相液滴生成的尖端加样时，首先将三毫升表面活性剂加入两毫升氟化油中，并将油相混合物吸入一个2.5毫升的注射器中。去除注射器中的任何气泡，并将注射器连接至一段适当长度的聚四氟乙烯（Teflon）管。另取两个样品注射器，装入适量的生物相容性矿物油，并将注射器连接至另一段适当长度的聚四氟乙烯（Teflon）管。接下来，从固化的EDMS平板上打取一个直径为五毫米的聚二甲基硅氧烷（PDMS）塞，并在塞子中心打一个直径为一毫米的孔。将该塞子紧密插入200微升移液器吸头的顶端，并将连接至生物相容性矿物油注射器的管路插入塞子中。缓慢按压注射器推杆，用矿物油充满移液器吸头，排出所有残留空气。将样品注射器和氟化油注射器小心地安装到注射泵上。当所有空气完全排出后，将每个移液枪头插入样品溶液中，并吸取约 100 µL 的细胞样品至枪头内。接着，将含有样品的两个移液枪头插入 PDMS 芯片的两个内侧入口，同时将装有油相混合物的管路插入外侧入口。根据指示设置注射泵的流速，并输入并设定每支注射器的尺寸。启动泵，使样品溶液流经装置的内通道，油相流经装置的外通道。当液滴形成稳定后，将一段适当长度的管路插入出口，开始收集液滴，并将液滴收集到锁紧管中。当所有液滴收集完毕后，在液滴上方加入 200 微升不含血清的 RPMI 培养基，并将样本置于锁管盖上有孔的位置，孵育适当的实验时间。进行乳液破乳时，首先将 2 毫升 PFO 加入 8 毫升氟化油中，然后使用注射器从液滴收集管底部移除多余的油相。接着向乳液中加入 100 微升 20% PFO 溶液，以释放包封的细胞进入水相，并轻轻敲击管壁以混匀。请务必注意，PFO 可能对细胞有害，因此应尽量减少与 PFO 的接触。一到两分钟后，以尽可能低的相对离心力离心 30 秒，立即吸取 550 微升水相层，转移至含有 500 微升冰冷 PBS（添加 2% 胎牛血清，即 FCS）的新密封管中。让残留的油相沉降至新的锁管底部，小心将含有细胞的水相950微升转移至另一新锁管中。注意确保油相不随水相一同转入新锁管。随后通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于300微升新鲜冷的含2% FCS的PBS中。采用上述演示的加样方法，可获得与统计学预测值相符的Jurkat T细胞包封率。值得注意的是，即使对于倾向于聚集的贴壁细胞（如肿瘤细胞）或稀有细胞（如浆细胞样树突状细胞），包封效率也得到显著提高。在本代表性包封过程中，使用超低凝胶温度琼脂糖再生液滴，并在生成后凝胶化形成琼脂糖水凝胶微珠，从而允许后续通过显微镜和流式细胞术进行下游分析。显微分析显示，在不同组合下实现了细胞配对，表明该方法具有高通量的细胞配对能力。通过对同一群水凝胶微珠进行流式细胞术分析，发现可根据前向散射和侧向散射的明显差异，将不含细胞的微珠与含细胞的微珠区分开来。事实上，对不含细胞的微珠群体设门后，未检测到荧光信号，证实了细胞未被包封；而对含细胞的微珠群体设门后，则显示出多个亚群的存在，提示不同标记的Jurkat T细胞已被成功包封。在使用该方法时，需注意细胞浓度是一个限制性因素，必须优化细胞浓度以确保高效的细胞包封与细胞配对。通过该方法，不仅能够以高效率将一个或两个细胞包裹在液滴中，还可以包裹多个细胞或多种细胞类型，从而更准确地模拟细胞微环境。该技术将为免疫学及相关领域的研究人员提供支持，有助于稀有细胞群体的最佳利用及其在液滴中的高效包裹，以在无干扰的环境中研究细胞行为。

a-pipette-tip-based-method-for-seeding-cells-to-droplet-microfluidic

Research

科研

JoVE Journal

Engineering

工程

一种基于管尖的液滴微流化平台种子细胞的方法

本文介绍了一种从大鼠原代神经元培养物中分离单细胞并利用aRNA扩增技术进行后续转录组分析的简单方法。该方法可推广应用于任何细胞类型。...

单细胞转录组分析

基于液滴的微流控平台有望用于高通量实验，因其能够以千赫兹速率低成本生成皮升级、自成隔室的微小反应容器。通过与快速、灵敏且高分辨率的荧光光谱方法相结合，可高效地提取、利用并整合这些系统中产生的大量信息。...

微流控液滴平台的荧光检测方法

本文介绍一种快速、简单的细胞刚度测量方法。该方法的基本原理是通过微管对细胞表面施加明确定义的负压，测量细胞膜在负压作用下的形变。该方法为研究贴壁细胞的生物力学特性提供了一种强有力的工具。...

利用微吸管对贴壁细胞进行吸吮以评估细胞刚性

来源： Sutlief, A. L., 等活细胞剪切应力分析 铜绿假单胞菌 使用自动化高通量微流控系统。 J. Vis. Exp.

微流控芯片中细菌细胞的制备

我们开发了一种用于微尺度细胞刺激实验的自动化细胞培养与检测平台。该平台在培养和刺激少量细胞群体以及回收裂解液用于分子分析方面，具有操作简便、功能多样和控制精确的优点。该平台非常适合使用珍贵细胞和/或试剂的研究。...

一种用于微尺度细胞刺激实验的多功能自动化平台

细菌的机械敏感性通道可用作生物分子器件中的力电换能器。液滴界面双层膜（DIBs）是此类器件中受细胞启发的构建单元，为整合和刺激机械敏感性通道提供了新平台。本文中，我们展示了一种基于微移液管的新型DIBs形成方法，可在机械刺激条件下研究机械敏感性通道。...

基于微移液管的多功能方法用于在液滴界面双层膜中整合并刺激细菌机械敏感性离子通道

本文展示了一种利用基于毛细管的离心微流控装置制备尺寸可控、单分散性水包油（W/O）微液滴的简单方法。该方法仅需少量样品体积，即可实现高产率制备。我们预计该方法将适用于快速生化分析和细胞分析。...

基于毛细管的离心微流控装置用于可控尺寸的单分散微液滴生成

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

该方案描述了如何在球状体中构建可灌注的血管网络。通过设计球状体周围的微环境，可诱导血管生成，并将球状体与微流控装置中的微通道连接。该方法实现了对球状体的灌注，这是三维培养领域长期期待的技术。...

微流控装置中具有组织模型的可灌注血管网络

该方案描述了一种先进的微流控平台，用于定量测量单个外周血单个核细胞的细胞因子分泌动态。以脂多糖刺激为例，该平台可对每个单个细胞并行检测多达三种细胞因子（IL-6、TNFα 和...

微流控方法解析单个多功能细胞同时与顺序性细胞因子分泌

本方案详细记录了SPOT（一种基于支架的高通量培养平台）在96孔和384孔板格式中的制备与组装过程。同时，还介绍了SPOT的接种流程，包括手动操作以及使用 commercially available liquid...

可重复制造SPOT作为高通量基于支架的培养平台

了解如何使用管尖加载技术将稀有细胞高效封装于液滴微流控装置中。该方法利用PDMS芯片生成液滴，适用于Jurkat T细胞及浆细胞样树突状细胞等稀有细胞类型，助力系统免疫学研究中细胞异质性与细胞间通讯的分析。

一种基于移液枪头的细胞接种至液滴微流控平台的方法

探索更多视频