Haut-débit Nitrobenzoxadiazole marqué cholestérol Efflux Assay

Ce protocole est notre méthode basée sur la cellule pour l’arrêt de cholestérol du reflux de cholestérol dans le plasma céramal. En particulier dans les projections. Ceci peut être appliqué pour diagnostiquer le risque cardio-vasculaire, et pour identifier ou évaluer l’entretien inférieur de cholestérol.

Cette technique évite le risque et les fardeaux que la sécurité à la manipulation des matériaux rayonné en fournissant des résultats avec des niveaux de qualité comparables, à ceux de reflux de cholestérol a été signalé à associer avec Ainsi, le reflux plasmatique ou céramien de cholestérol de accepté peut être comparé, à notre contrôle de référence et peut fournir le risque de souffrir de cette méthode sera également appliquée aux lignées cellulaires , comme d’autres lignées cellulaires humaines ou même des phases macro primaires. Macro phases ou et cellules souches de bouton de pulvérisation induites par l’homme. Pour commencer cette procédure, dissoudre le cholestérol NPD dans de l’éthanol pur pour obtenir une solution de stock avec une concentration finale de deux micromolaires.

Diluer 25 microlitres du stock de cholestérol NBD dans ar 10 moyen pour atteindre une concentration finale de cinq micromolaires. Culture thp-1 cellules dans notre milieu 10 à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Tous les trois jours, réglez la densité cellulaire à 300 000 cellules par millilitre.

Ensuite, obtenez une plaque de 96 puits avec un fond clair plat. Pour une meilleure homogénéisation, préparer un 10 millilitres de cellules thp-1 dans un tube de 15 millilitres, et ajouter 200 microlitres de stock PMA. Mélanger délicatement et ensemencer 100 microlitres du mélange dans les puits de la plaque à 200 000 cellules par puits.

Et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 à 72 heures pour différencier les cellules thp-1 en cellules DM thp-1. Diluer d’abord la glycine dans 10%PBS avec de l’eau stérile, à une concentration de 200 micromolaires au pH 7,4. Ajouter 40 millilitres de glycine diluée à 10 grammes de peg 8000 pour préparer une solution de cheville de 20%, et mélanger vigoureusement pour homogénéiser.

Appliquer ensuite quatre parties de 20 % par 10 parties d’échantillon à chaque échantillon de sérum ou de plasma dans un tube de 1,5 ml. Laisser le mélange sur la glace pendant 25 minutes. Centrifugeuse la cheville apolipoprotéine B précipité à 13000 fois G, et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Jetez le précipité et transférez le supernatant dans un nouveau tube. Récupérer la plaque contenant les cellules thp-1 différenciées. Retirer et jeter le milieu de culture, puis laver les cellules deux fois avec 1X PBS.

Ajouter 100 microlitres de 5 micromolaires de cholestérol MVD dans ar-10 moyen à chaque puits. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain jeter, jeter le milieu.

Lavez les cellules deux fois avec PBS, puis ajoutez 100 microlitres ABDS, ou accepteur purifié de lipide dilué dans rpmi 1630 moyen à la concentration désirée à chaque puits. Inclure un contrôle négatif qui ne contiennent pas d’accepteurs de cholestérol dans un contrôle positif, tel que décrit dans le protocole de texte, et incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre à six heures. Pendant ce temps, préparer un stock de 200 millilitres de solution de lyse cellulaire un tel que décrit dans le texte.

Mélangez cette solution avec de l’éthanol, à un rapport volumétrique un pour un pour obtenir une solution de lyse aussi. Pour la détection du cholestérol média et BD, retirez le milieu cellulaire des plaques recueillies dans une nouvelle plaque blanche de 96 puits avec un fond plat opaque. Ajouter 100 microlitres d’éthanol pur à 100 microlitres de chaque échantillon moyen pour obtenir un rapport un pour un dans la nouvelle plaque.

À l’aide d’un illuminomètre, mesurer l’intensité du fluorescent à une excitation de 463 nanomètres, et une émission de 536 nanomètres. Pour la détection intracellulaire du cholestérol NBD, lavez les cellules deux fois avec PBS. Ajouter 100 microlitres de solution de lyse aussi à chaque puits, et incuber à température ambiante, tout en secouant pendant 25 minutes.

Après cela, mesurez l’intensité du fluorescent tout en ajustant le paramètre de sensibilité à 50 dans le logiciel. Déterminez ensuite le taux d’efflux de cholestérol dans la mesure finale de l’efflux de cholestérol tel que décrit dans le protocole de texte. La dilution du cholestérol NBD dans l’éthanol pur produit les valeurs d’intensité fluorescentes les plus élevées, tandis qu’une teneur élevée en solution aqueuse réduit l’intensité.

Ceci suggère que l’émission fluorescente de cette molécule dépend fortement du milieu, dans lequel elle est contenue. Lors de l’utilisation d’un mélange de médias et d’éthanol à un rapport un pour un, l’intensité du fluorescent semble augmenter proportionnellement, avec une concentration de l’analogue du cholestérol, ce qui suggère que la sonde se comporte approprié dans ces conditions. Pour déterminer le temps nécessaire à l’incubation des cellules chargées avec des accepteurs de cholestérol, les médias cellulaires sont récoltés à différents moments.

L’efflux de cholestérol a évolué linéairement de zéro à six heures, avec le signal maximum étant capturé six heures après ABDS est ajouté aux cellules. Le seuil de saturation et la plage dynamique sont testés en mesurant l’efflux de cholestérol à différents pourcentages de HDL contenant des supports. Dans l’actif à haut débit, l’efflux évolue linéairement de un à 7%ABDS, atteignant le pic de la capacité d’efflux de cholestérol à 7%À des concentrations supérieures à 7%, l’intensité fluroescente diminue dans une relation inverse avec le pourcentage d’ABDS.

La performance de la méthode basée sur la fluorescence est ensuite évaluée en la comparant à la technique standard étiquetée radio. Les deux techniques sont fortement corrélées lors de l’utilisation de différentes concentrations d’ABDS. La méthode décrite est sensible à une augmentation des concentrations d’accepteurs dans les valeurs d’efflux de cholestérol entre cinq et 15%Il est important de s’assurer que le celluarisateur ne contient pas d’agrégats.

Le point critique est de grader un éthanol agrégé contenant de l’environnement, de mesurer la fluorescence dans un poids homogène et optimal. Après cette procédure, le cholestérol technique de nom peut être mesuré, et l’effet des drogues dans la voie d’efflux de cholestérol peut être déterminé. Aussi l’école éventuellement être utilisé comme un diagnostic pour asses risque cardiovasculaire.

Nous croyons que cette méthode est beaucoup plus facile et plus sûre que la méthode standard radioactive. Toutefois, il est encore dépendant des cellules. N’oubliez pas que l’éthanol est inflammable et qu’il doit être stocké et manipulé en conséquence.