Name: Utilizzo della radioetichettatura microtiter Piatto per le misurazioni multiple In Vivo di Escherichia coli (p)ppGpp seguito dalla cromatografia a strati sottile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Impara a misurare i livelli di ppGpp in Escherichia coli mediante radioetichettatura in piastre microtiter e cromatografia su strato sottile. Questo metodo ad alto rendimento consente di analizzare la risposta allo stress e la regolazione dei nucleotidi.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH.

1. Preparazione dei supporti
<ol><li>
Per moPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) media25, utilizzare 1/10 volume di sali 10x MOPS, 1/100 volume di soluzione 100x micronutrienti, 3 mM fosfato di sodio per colture notturne o 0,2 mM di fosfato di sodio per un'etichettatura uniforme con 32P, 0,2% di glucosio e 1 g/mL di tiano (vitamina B1). Se necessario, aggiungere gli amminoacidi a 40 g/mL.
	<ol>
<li>Per i salti MOPS, utilizzare 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mM NH4Cl, 2,6 mM K2SO4, 5 CaCl2, 10,56 mM MgCl2e 500 mM NaCl. Aggiungere i diversi componenti nell'ordine scritto per evitare precipitazioni. Regolare a pH 7.4 con KOH e sterilizzare per filtrazione.</li>
		<li>Per la soluzione di micronutrienti 100x, utilizzare 3 M (NH4)6(MO7)24, 0,4 mM H3BO4, 30 M CoCl2, 10 CuSO4, 80M MnCl2, e 10 M nSO4. Sterilizzare autoclaving.</li>
		<li>Per il glucosio (20%) e soluzioni di fosfato di sodio (300 mM), sterilizzare come scorte 100x separate autoclaving. Sterilizzare 100 volte le scorte di tiamina e miscele di amminoacidi per filtrazione. Preparare supporti freschi da soluzioni sterili per ogni esperimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Etichettatura con 32P
<ol><li>Coltiva le colture notturne con i media MOPS con 3 mM di fosfato di sodio.</li>
	<li>In una piastra di 24 pozzetti, aggiungere 550 - L di molo DI MOPS contenente 0,2 mM di portafosato di sodio e 30 di ogni inoculum batterico (diluizione 1/20). Questo produrrà un inoculum iniziale di OD600nm 0.1. Utilizzare un pozzo con supporti freschi come controllo di sterilità.</li>
	<li>Posizionare la piastra su un'incubatrice agitazione a 37 gradi centigradi tremando a 900 giri/mm per 30 min. Fissare saldamente la piastra con del nastro adesivo per evitare inclinazioni o fuoriuscite. La crescita può essere monitorata con una piastra replicante in parallelo su supporti privi di 32P utilizzando un lettore di lastre e incubando si incubano nelle stesse condizioni.</li>
	<li>Aggiungete 100 Ci ad ogni pozzetto da 32P orthophosphate (20 -L da un'azione di 5 mCi/mL). NOT:</</c3> La quantità di radioattività può anche essere regolata per soddisfare le esigenze sperimentali. Per i bassi livelli basali 100 -Ci con 0,2 mM di fosfato portante funziona bene, ma per misurare i livelli (p)ppGpp che dovrebbero diventare equivalenti a piscine GTP, etichetta può essere sceso a 25 o 50 Ci. Abbassare il fosfato portante al di sotto di 0,2 mM non è raccomandato per evitare che i livelli di fosfato diventino limitanti per la crescita. AGGIORNAMENTO: 32P è un isotopo che emette, quindi usa una schermatura adeguata specificata per la sicurezza. Tutto il materiale radioattivo deve essere smaltito correttamente prendendo tutte le precauzioni possibili.</li>
	<li>Coltivare in incubatrice acquosa per 1 o 2 raddoppi (1 h o più) per consentire all'etichetta esterna di eclarare in gran parte con pool di nucleotidi intracellulari prima di indurre lo stress.</li>
</ol>3. Induzione di stress o di fame
<ol><li>
Indurre lo stress utilizzando un metodo di vostra scelta, a seconda del tipo di stress studiato, ad esempio l'aggiunta di inibitori della via metabolica, cambiamento della temperatura, estenuante nutrienti necessari, spostamento di spostamento degli spostamenti di osmolarità, indurre stress ossidativo, aggiunta di tossine, ecc.
	<ol>
<li>Ad esempio, aggiungere 100 g/mL L-valine per indurre la fame di isoleoucina nei ceppi di E. coli K-12. I livelli aumentati di ppGpp saranno osservati dopo 5 minuti di induzione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Campionamento e estrazione ppGpp
<ol><li>Aggiungere 20 l di ogni campione di cellule etichettate a un tubo PCR da 0,2 mL contenente 20 -L di ghiaccio freddo 6 M di acido formicico.</li>
	<li>Mettere immediatamente i campioni nel ghiaccio secco.</li>
	<li>Migliora l'efficienza dell'estrazione cellulare di 3 cicli di congelamento e scongelamento.</li>
	<li>Poco prima di avvistare i cromatogrammi a strato sottile di cellulosa PEI, centrifugare campioni per 1 min alla massima velocità per pellet detriti cellulari per evitare di avvistarlo su cromatogrammi.</li>
</ol>5. Cromatografia a strato sottile
<ol><li>Con una matita morbida, segnare una linea di origine a 1 cm dal bordo della piastra PEI-Cellulose TLC da 20 cm x 20 cm che ha avuto 5 cm di rimozione dalla parte superiore con le forbici. Applicare 5 -L come goccia nella superficie PEI per ogni campione. Iniziare lo sviluppo ascendente senza lasciare che questo punto si asciughi, migliorando la risoluzione riducendo al minimo le striature.</li>
	<li>Fai lo sviluppo ascendente in un serbatoio con uno strato di 1,5 M KH2PO4 (pH 3.4) soluzione abbastanza superficiale in modo che il liquido non tocchi il punto campione di origine. Coprire il serbatoio con una guarnire a tenuta d'aria e lasciare che la salita liquida alla parte superiore del foglio tagliato, 15 cm. Per ottenere il pH 3.4 per una soluzione da 1,5 M KH2PO4, è necessario regolare il pH aggiungendo H3PO4.</li>
	<li>Rimuovere lo cromatogramma completamente sviluppato e l'aria si asciugano a temperatura ambiente.</li>
	<li>Tagliare e scartare la parte superiore (pH anteriore) del cromatogramma contenente il libero 32P in scorie radioattive. Questa porzione è rappresentata in colore giallo nella Figura 2 e facilmente visualizzabile sotto la luce UV. Se si misurano solo i nucleotidi (p)ppGpp che migrano più lentamente di GTP, si consiglia di eseguire uno standard GTP visibile ai raggi UV e quindi tagliare e scartare una porzione superiore più grande (qualsiasi elemento sopra GTP, come mostrato nella Figura 2).</li>
	<li>Esponi le pellicole radiografiche durante la notte con uno schermo di fosforo.</li>
	<li>Sviluppare il film. Catturare e quantificare il segnale dello schermo del fosforo con un fosforo.</li>
</ol>6. Quantitazione di (p)ppGpp
<ol><li>Quantitate spot radioattivi con l'immagine J26,27. NOT:</</c3> La quantità di (p)ppGpp può essere normalizzata alla quantità totale di nucleotidi G osservati in ogni campione (Figura 2). Se la quantità di sfondo è omogenea, è possibile sottrarre un singolo spazio vuoto (casella 4 della Figura 2) per correggere lo sfondo. Total G è la somma di GTP - ppGpp - pppGpp rilevato. Questa normalizzazione presuppone che i livelli di GMP e PIL siano trascurabili, il che è vero per E. coli. Il rapporto tra un determinato nucleotide e G totale fornisce un modo importante per correggere le variazioni del volume del campione applicato.</li>
</ol>7. Misurazione del tasso di decadimento ppGpp
 NOT:</</c0> Una modifica di questo protocollo consente misurazioni dei tassi di decadimento ppGpp.
<ol><li>Dopo aver provocato stress o fame per un tempo sufficiente a consentire l'accumulo di ppGpp (passaggio 3), invertire lo stress per bloccare la sintesi continua del ppGpp, che consente il rilevamento dei tassi idrolitici. La procedura di inversione dipenderà dallo stress. Ad esempio, aggiungere 200 g/mL di cloramfenicolo per invertire qualsiasi amminoacido di fame.</li>
	<li>I tassi di decadimento sono di solito rapidi, ma possono variare, quindi preleva campioni ogni 20-30 s fino a 2 min.</li>
	<li>Una volta che il TLC è sviluppato (come nel passaggio 5) e i livelli di ppGpp ottenuti durante il corso temporale, tracciare il contenuto di ppGpp residuo su una trama semi-logaritmica vs tempo per consentire la visualizzazione di zero tassi di decadimento di ordine, come una linea retta, e stima dell'emivita ppGpp.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Raggiungere un'etichettatura quasi uniforme delle cellule è un passo fondamentale per questo protocollo. Pertanto, l'uso di supporti definiti, come i supporti MOPS o Tris, è fondamentale per consentire la variazione delle concentrazioni di fosfato del vettore e dell'attività specifica. Non è possibile utilizzare supporti memorizzati nel buffer del fosfato, ad esempio M9 o A. La maggior parte dei supporti indefiniti contiene quantità variabili di fosfato, come LB, tryptone e acidi casamino. L'isotopo fosfato 33...

Il secondo messaggero (p)ppGpp è un regolatore globale che modula l'espressione di un gran numero di geni, compresi i geni per sintetizzare ribosomi e amminoacidi1,2. Anche se inizialmente scoperto in Escherichia coli3, (p)ppGpp può essere trovato sia nei batteri Gram positivi e Gram negativi, così come nelle cloroplasti vegetali4,5. Per E. coli e altri batteri Gram-negativi, (p)ppGpp interagisce direttamente con la polimerasi dell'RNA in due siti diversi6,7,8. In Gram positivi, (p)ppGpp inibisce l'abbondanza GTP, che viene percepita da CodY, una proteina legante GTP con motivi di riconoscimento del DNA gene-specifici che portano al regolamento9,10. (p)ppGpp si accumula in risposta alla fame di diversi nutrienti e condizioni di stress, con conseguente crescita lenta e aggiustamenti dell'espressione genica per consentire l'adattamento allo stress11,12.
La quantità netta di ppGpp accumulata riflette un equilibrio tra le attività di sintetasi e idrolasi. In E. coli RelA è una forte sintetasi e SpoT è bifunzionale, con una forte idrolasi e una sintetasi debole, ognuna delle quali potrebbe essere regolata in modo diverso in modo dipendente dallo stress. La forte sintetasi RelA si attiva quando la disponibilità di tRNA carico carica specificato codone legato al sito ribosomal A quando non riesce a tenere il passo con le esigenze di sintesi proteica13,14,15. La debole sintetasi SpoT (p)ppGpp viene attivata mentre l'idrolasi forte (p)ppGpp è inibita in risposta ad altre condizioni di stress e attraverso altri meccanismi. In alcune condizioni, proteine come ACP o Rsd possono legarsi a SpoT, che cambia anche l'equilibrio tra idrolisi e sintesi16,17. Nei positivi Gram, sintesi e idrolisi riflettono un equilibrio più complesso tra una singola proteina relA SpoT (RSH) con forti attività di sintesi e idrolisi, nonché idrolasi e/o sintetasi più piccole12.
I nucleotidi (p)ppGpp sono stati scoperti per la prima volta come insoliti punti etichettati da 32P che sono apparsi sugli autoradiogrammi dei cromotrigrammi a strato sottile (TLC) durante una risposta rigorosa indotta dalla fame di amminoacido3. Sono stati esaminati protocolli di etichettatura più dettagliati 18. Il protocollo descritto qui (Figura 1) è una modifica di questi protocolli che consente di monitorare la crescita di più campioni su piastre di microtiteri. Questo facilita molteplici stime biologiche e tecniche dei cambiamenti di abbondanza (p)ppGpp ed è stato inizialmente sviluppato per studi sui cambiamenti diauxici19. L'etichettatura di (p)ppGpp con 32P e rilevamento da parte di TLC consente anche misurazioni dei tassi di degradazione (p)ppGpp. Sono stati sviluppati metodi alternativi per determinare i livelli (p)ppGpp come la spettrometria di massa, HPLC20, chemiosensori fluorescenti21,22e le fusioni geniali GFP per i promotori affetti da ppGpp23, 24. I chemiosensori fluorescenti hanno attualmente un uso limitato a causa di piccoli spostamenti spettrali dopo il legame ppGpp così come problemi che distinguono tra ppGpp e pppGpp21. Questo metodo è efficace per rilevare (p)ppGpp in vitro, ma non in estratti cellulari. I metodi che coinvolgono HPLC sono stati miglioratia 20 ma richiedono attrezzature costose e non sono ben adattati all'elevata velocità. Infine, le fusioni GFP possono fornire una stima dell'attivazione o dell'inibizione dipendente da ppGpp, ma non misurano la ppGpp stessa. Sebbene ciascuno di questi metodi alternativi sia prezioso, richiedono attrezzature costose o tempi di pratica sostanziali oppure non sono suscettibili di campionamento cinetico multiplo e di successiva elaborazione. Con il metodo qui descritto, 96 campioni possono essere applicati a sei piastre TLC in circa 20 min (18 campioni per piastra), risolti dallo sviluppo di TLC in meno di un paio d'ore, con dati quantitativi ottenuti dopo diverse ore o durante la notte, a seconda dell'etichettatura intensità.

<table><tbody><tr><td>(NH4)6(MO7)24</td><td>Fisher Scientifics</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola per autoradiografia</td><td>Denville scientific inc.</td><td>E3218</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T.Baker</td><td>1-1309</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>RPI</td><td>C61000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Fisher Scientifics</td><td>C-371</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>J.T.Baker</td><td>1843</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4</td><td>Fisher Scientifics</td><td>I-146</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP1215-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Macron</td><td>4912-12</td><td></td></tr><tr><td>H3BO4</td><td>Macron</td><td>2549-04</td><td></td></tr><tr><td>H3PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>0260-02</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Sigma</td><td>P9458-250G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Valina</td><td>Sigma</td><td>V-6504</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientifics</td><td>FL-06-0303</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre Synergy HT</td><td>Biotek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>M-9522</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T.Baker</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171-500G</td><td></td></tr><tr><td>P-32 radionuclide, acido ortofosforico in 1 mL di acqua (5 mCi)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX053005MC</td><td></td></tr><tr><td>Schermo al fosforo di stoccaggio</td><td>Kodak</td><td>So230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina</td><td>Sigma</td><td>T-4625</td><td></td></tr><tr><td>TLC PEI Cellulosa F</td><td>Merk-Millipore</td><td>1.05579.0001</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>RPI</td><td>T2400-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400 imager</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Fisher Scientifics</td><td>Z-68</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzo della radioetichettatura microtiter piatto per le misurazioni multiple in vivo di escherichia coli (p)ppgpp seguito dalla cromatografia a strati sottile

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

Il nucleotide (p)ppGpp funziona come regolatore globale nei batteri in risposta a una varietà di stress fisico e nutrizionale. Ha un rapido insorgenza, in secondi, che porta ad accumulo di livelli che si avvicinano o superano quelli dei pool GTP. L'inversione dello stress è una rapida scomparsa di (p)ppGpp, spesso con un'emivita di meno di un minuto. La presenza di (p)ppGpp provoca alterazioni dell'espressione genica cellulare e del metabolismo che contrastano gli effetti dannosi dello stress. I batteri Gram-negativi e Gram-positivi hanno meccanismi di risposta diversi, ma entrambi dipendono dalla concentrazione (p)ppGpp. In ogni caso, è necessario monitorare contemporaneamente molte colture batteriche radioetichettate a intervalli di tempo che possono variare da 10 secondi a ore durante i periodi di transizione allo stress critico. Questo protocollo affronta questa sfida tecnica. Il metodo si avvale di incubatori di microtitori a temperatura e a scossore che consentono un monitoraggio parallelo della crescita (assorbimento) e di un rapido campionamento di colture uniformemente radioetichettate con fosfato per risolvere e quantitare le pool di nucleotidi cromatografia a strato sottile sulla cellulosa PEI. Piccole quantità di campione sono necessarie per molteplici repliche tecniche e biologiche delle analisi. Con questo metodo è possibile valutare quantitativamente transizioni complesse di crescita, come la crescita diaustica e i tassi di rotazione rapidi (p)ppGpp.

Nei ceppi E. coli K-12, l'aggiunta di valina provoca una fame endogena di isoleucina, che si traduce in un aumento dei livelli di ppGpp dopo 5 min3. Le cellule coltivate in MOPS contenenti tutti gli aminoacidi ad eccezione di ILV sono state etichettate con 32P come indicato nella Figura 1. Una volta etichettato, sono stati aggiunti 6 L di 10 mg/mL L-valine (100 g/mL di concentrazione finale) per produrre la fame di isole. I campioni sono sta...

La crescita di colture batteriche radioetichettate nei piatti microtiteri facilita il campionamento ad alta produttività che consente molteplici analisi tecniche e biologiche di abbondanza di piscine nucleotidiche, tra cui quella di (p)ppGpp. Gli effetti delle transizioni di crescita provocati da fonti di stress fisiologico e di recupero dallo stress possono essere monitorati.

Utilizzo della radioetichettatura microtiter Piatto per le misurazioni multiple In Vivo di Escherichia coli (p)ppGpp seguito dalla cromatografia a strati sottile

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Questo metodo misura i livelli del regolatore globale ppGpp in diverse condizioni di crescita e situazioni di stress. PpGpp può essere trovato in batteri gram positivi e negativi, così come nel cloroplasto. PpGpp ha un rapido esordio in secondi, che porta a una seconda relazione veloce una volta prodotta la sollecitazione.Allo stesso tempo, ha un'emi vita breve, fino a 30 secondi. Pertanto, è necessario monitorare molte impostazioni cultura a intervalli di tempo che possono variare da 10 secondi a ore, incluse le transizioni stressate. Inoltre, le colture batteriche radiolabel nelle stoviglie a microtitore facilitano campionamenti ad alta produttività che consentono molteplici repliche tecniche e biologiche.Assicurarsi di seguire le misure di sicurezza appropriate quando si lavora con materiali radioattivi. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i supporti come indicato nel protocollo di testo. Coltivare colture notturne in mezzi MOPS con tre fosfati di sodio millimolari.Aggiungere 550 microlitri di mezzi MOPS, che contno 0,2 portatori di fosfato di sodio micromolare e 30 microlitri di ogni inoculo batterico ai pozzi di una piastra di 24 pozza. Ciò si tradurrà in un inoculo iniziale con un OD600 di 0,1. Aggiungere nuovi supporti a uno e un controllo di sterilità.Posizionare la piastra in un'incubatrice tremante a 37 gradi celsius, tremando a 900 giri/min per 30 minuti. La crescita può essere monitorata utilizzando un lettore di lastre con una piastra replicata in parallelo in supporti privi di p32 utilizzando un lettore di lastre durante l'incubazione nelle stesse condizioni. Aggiungere quindi 100 microcuries di p32 ortofosfato ad ogni pozzo della piastra.Far crescere le colture in un incubatore di scuotimenti per uno o due raddoppi per consentire all'etichetta esterna di equilibrare in gran parte con piscine nucleotidiche intercellulari. Per una corretta visualizzazione, nessuno dei materiali attivi è stato utilizzato in questo video. In un vero esperimento, è necessaria una corretta schermatura e un monitoraggio costante per la contaminazione con un misuratore di rilevamento.In primo luogo, indurre lo stress utilizzando un metodo appropriato per il tipo di stress studiato. Aggiungere quindi 20 microlitri di ciascun campione di cellule etichettate a un tubo PCR separato da 0,2 millilitri, contenente 20 microlitri di acido formico molare freddo ghiaccio. Posizionare immediatamente i campioni sul ghiaccio secco.Migliora l'efficienza di estrazione cellulare di tre cicli di congelamento e scongelamento. Poco prima di avvistare i cromatogrammi a strato sottile di cellulosa PEI, centrifugare i campioni per un minuto alla massima velocità per pellet cell debris. In primo luogo, impostare una piastra TLC di cellulosa PEI da 20 per 20 centimetri.Usa le forbici per rimuovere i primi cinque centimetri. E usa una matita morbida per contrassegnare una linea di origine a un centimetro dal bordo. Applicare una goccia a cinque microliter di ciascun campione sulla superficie PEI.Prima che il punto possa asciugarsi, trasferire la piastra in un serbatoio contenente uno strato di 1,5 fosfato monopotassio molare abbastanza superficiale da non toccare il punto del campione di origine. Coprire il serbatoio con una tenuta ermetica e consentire la salita liquida verso la parte superiore del foglio tagliato di 15 centimetri. Successivamente, rimuovere il cromatogramma completamente sviluppato e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente.Tagliare e scartare la parte superiore del cromatogramma contenente il P32 libero in scorie radioattive. Utilizzare uno schermo al fosforo per esporre i film audioradiografici durante la notte. Il giorno dopo, sviluppa il film e usa un fosforimager per catturare e quantificare il segnale verde del fosforo.Quindi, utilizzare il software ImageJ per quantificare le macchie radioattive. Dopo aver provocato stress o fame per un tempo sufficiente a consentire l'accumulo di ppGpp, utilizzare un metodo appropriato per invertire lo stress. Prelevare campioni ogni 20-30 secondi per un massimo di due minuti ed elaborare i campioni come descritto in precedenza.Una volta sviluppato il TLC e ottenuti i livelli di ppGpp durante il corso del tempo, tracciare il contenuto ppGpp residuo su un grafico semilogaritmico rispetto al tempo. In questo studio, le cellule coltivate in MOPS contenenti tutti gli amminoacidi ad eccezione dell'ILV sono etichettate con P32. Una volta etichettato, L valine viene aggiunto per produrre fame di isoleucina.Dopo cinque minuti, si è verificato un aumento di due anni e due anni e mezzo dei livelli di tetra e pentafosfato di guanosina. Un controllo negativo di un campione etichettato privo di cellule viene utilizzato per rilevare possibili composti che non sono ortofosfati nella sorgente P32. L'inversione della fame di isoleucina può essere ottenuta dal cloramfenicolo, un inibitore della sintesi proteica, che riduce il consumo di tRNA di isoleucina caricato e, a sua volta, ripristina alti rapporti di tRNA carico a non carico.L'attivazione della forte ppGpp sintetasi rela-mediata è abolita, il che consente una misura della degradazione ppGpp non perturbata dalla sintesi residua. In questo caso, ppGpp decade con un'emidità di circa 64 secondi. È importante lasciare che le cellule crescano per un paio di generazioni per ottenere un'etichettatura uniforme prima di indurre qualsiasi stress o fame.Poiché il ppGpp è ampiamente diffuso tra i batteri, questo metodo può essere applicato ad altri organismi. La modifica del metodo di sviluppo delle TLC potrebbe consentire la corretta separazione di tutti i nucleotidi regolatori, come ppApp. P52 è un isotopo dell'emettitore migliore, quindi è importante utilizzare una corretta schermatura e scartare correttamente eventuali residui.

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