一种体外评估肿瘤细胞中microRNA水平、功能及相关靶基因的实验方案

获取神经微小RNA（microRNA）与其靶基因之间的相互作用对于理解microRNA在健康和疾病状态下调控各种生物学过程的功能至关重要。本实验方案描述了一种可重复的策略，用于鉴定microRNA的靶基因，并对microRNA的功能进行验证，因为直接验证microRNA靶点具有挑战性。本方案可为单个microRNA的功能及其在癌症治疗中的意义提供深入见解。

半数抑制浓度的计算不仅对于microRNA研究，而且对于其他抗癌药物的有效性评价都是一种重要的方法。我们的实验方案将有助于新研究人员，因为我们描述了理解细胞中microRNA水平的基本方法。开始实验时，使用细胞计数器对细胞进行计数。

将细胞接种于96孔板中。次日，配制一系列转染混合物，用于以不同终浓度的microRNA对照mimic和microRNA-107 mimic转染细胞。从25微摩尔的microRNA对照mimic或microRNA-107 mimic储备液中，用微量离心管将对照mimic或microRNA-107 mimic稀释后加入含减血清培养基中，并与转染试剂一同加入。

使用微量移液器轻轻混匀含有寡核苷酸的混合物。在细胞培养操作台中孵育10分钟后，再次轻轻混匀含有寡核苷酸的混合物，然后将50 µL混合物加入每个孔中。将转染后的细胞置于细胞培养孵育箱中继续培养。

小心吸去培养板各孔中的细胞培养液，立即向每孔加入100微升10%三氯乙酸（TCA）。将含有10% TCA的培养板置于4摄氏度环境中静置一小时。随后，通过将培养板浸入盛有自来水的容器中，反复清洗数次。

轻敲培养板以去除孔内多余的水分，直至无可见水滴残留，并将培养板干燥。向每个孔（包括空白孔）中加入50 µL的0.4% SRB溶液。轻轻振荡培养板，直至0.4% SRB溶液均匀覆盖各孔底部。

然后，将培养板孵育40至60分钟。孵育结束后，用1%乙酸洗涤培养板，直至未结合的染料完全洗去。向各孔（包括空白孔）中加入100微升10毫摩尔的Tris碱溶液。

将培养板置于摇床上孵育10分钟。在492纳米波长下测定吸光度。利用SRB实验的吸光度值，计算每组平均吸光度的百分比及其标准差。

将原始数据（包括处理浓度、平均吸光度和标准偏差）导入软件，并垂直对齐数据。单击“创建图表”选项卡，选择“简单散点误差线图”。将工作表列选为符号值，然后单击下一步。

在“数据格式”面板中，选择 X-Y 数据对，然后单击“下一步”。在“选择数据”面板中，选择相应的数据列。单击“完成”以创建图表。

双击 X 轴以修改坐标轴缩放的刻度类型。将刻度类型从线性更改为对数。将起始和结束范围值分别修改为 0.01 和 200。

右键单击任意散点图，选择“曲线拟合”，进入“用户自定义”子类别。选择剂量反应曲线，点击后续按钮，然后点击完成。

转到报告选项卡，然后检查 n、k 和 R 值。按照随附的文字实验方案运行 PCR。随后将反应混合物合并于同一管中，加入限制性内切酶 Exo1 和 Not1，进行双酶切消化。

将混合物在37摄氏度水浴中孵育三至四小时。将双酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。然后在紫外光下切下条带。

从切下的条带中纯化双酶切的PCR产物和荧光素酶载体。通过配制含有DNA连接酶的20微升连接反应体系，将PCR产物连接至荧光素酶载体中。将离心管短暂离心10至15秒。

使用PCR仪在16摄氏度下过夜孵育连接反应。第二天，将连接产物加入含有感受态细胞的离心管中进行转化。轻轻敲击离心管，置于冰上静置20分钟。

将离心管迅速而轻柔地转移至42摄氏度的加热块中，孵育30秒至1分钟。热激后，将离心管置于冰上20分钟。将感受态细胞涂布于LB琼脂平板上。

将感受态细胞在37摄氏度的培养箱中过夜培养。次日，挑取单个菌落，将大肠杆菌重悬于含有超纯水的8联管中，并重复此步骤，从4至8个随机选择的菌落中分别重悬大肠杆菌。将25微升大肠杆菌悬液转移至另一组8联管中。

使用大肠杆菌悬液进行菌落PCR。在24孔板中准备荧光素酶检测。每孔加入一至两倍十的四次方个细胞，置于500微升细胞培养基中。

在过夜孵育后，使用转染试剂将50纳克荧光素酶载体与对照mimic或特异性microRNA mimic共同转染入细胞中。次日，用磷酸盐缓冲液洗涤孔内物质两次。每孔加入200微升裂解试剂，在检测荧光素酶活性前充分完成细胞裂解。

持续震荡培养板至少15分钟。取5至10微升细胞裂解液转移至新离心管中，加入100微升试剂一，并立即用移液器吹打混匀。随后使用发光仪检测萤火虫荧光素酶活性，读数时间为10至15秒。

在同一管中加入100微升试剂二，然后用移液器吹打混匀两次。最后，使用发光仪读取海肾荧光素酶活性10至15秒。RT-PCR显示，在PANC-1和CAPAN-1细胞中，与HPNE细胞相比，miR-107显著减少。

与HPNE细胞相比，PANC-1和CAPAN-1细胞中miR-301的表达水平显著上调。本研究中的SRB实验明确表明，在转染miR-107模拟物后，PANC-1细胞的增殖能力下降。对miR-107的11个潜在靶基因的筛选结果显示，只有突触核蛋白γ（synuclein gamma，SNCG）——一种肿瘤细胞生长的正向调控因子——能与miR-107直接相互作用，并在PANC-1细胞中发挥作用，表明miR-107可通过调控SNCG的表达，负向调节PANC-1细胞的增殖。

使用四氢化碳基物质和CFSE的成年细胞增殖实验可用于筛选microRNA模拟物等分子的作用效果，具体应用取决于细胞类型。根据microRNA的实验验证功能，在进行荧光素酶报告基因实验之前，需系统性地查阅数据库并利用靶点预测程序，以缩小候选靶基因的范围。在评估microRNA与抗癌药物联用效率时，采用本方案计算组合指数，进而获得经调整的IC值，具有显著优势。