Name: Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer in vivo beeldvorming van het muizennetvlies met twee-fotonenmicroscopie voor onderzoek naar oogziekten en normale retinafunctie. Deze methode biedt hoge resolutie en reproduceerbare resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award aan P.R.W. en een onbeperkte subsidie aan de afdeling Oogheelkunde en Visuele Wetenschappen aan de Washington University School of Medicine in St. Louis), National Glaucoma Research (een programma van BrightFocus Foundation) en het McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. wordt ondersteund door een Institutional National Research Service Award T32 EY013360. Dit werk werd ook ondersteund door het Hope Center Viral Vectors Core aan de Washington University School of Medicine.

<ol><li>Smith, C. A., Chauhan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+adeno-associated+viral+vector+labelled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1490(2018).</li>
<li>Liu, H., Ding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+experimental+glaucoma+animal+model%3A+A+comparison+of+microbead+injection+with+or+without+hydroxypropyl+methylcellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Establishment of an experimental glaucoma animal model: A comparison of microbead injection with or without hydroxypropyl methylcellulose.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (3), 1953-1960 (2017).</li>
<li>Chauhan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+in+vivo+imaging+of+retinal+ganglion+cells+and+retinal+thickness+changes+following+optic+nerve+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice.</a> PLoS One. 7 (6), 40352(2012).</li>
<li>Leung, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+profile+of+retinal+ganglion+cell+damage+after+optic+nerve+crush+with+blue-light+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4898-4902 (2008).</li>
<li>Murata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+retinal+ganglion+cells+and+their+loss+in+vivo+by+a+fundus+camera+in+the+normal+and+ischemia-reperfusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse retinal ganglion cells and their loss in vivo by a fundus camera in the normal and ischemia-reperfusion model.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (12), 5546-5552 (2008).</li>
<li>Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+retinal+microglial+activation+during+neurodegeneration%3A+confocal+ophthalmoscopic+imaging+and+cell+morphometry+in+mouse+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52731(2015).</li>
<li>Bremer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Intravital+Imaging+of+the+Retina+Reveals+Long-term+Dynamics+of+Immune+Infiltration+and+Its+Effects+on+the+Glial+Network+in+Experimental+Autoimmune+Uveoretinitis%2C+without+Evident+Signs+of+Neuronal+Dysfunction+in+the+Ganglion+Cell+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Intravital Imaging of the Retina Reveals Long-term Dynamics of Immune Infiltration and Its Effects on the Glial Network in Experimental Autoimmune Uveoretinitis, without Evident Signs of Neuronal Dysfunction in the Ganglion Cell Layer.</a> Frontiers in Immunology. 7, 642(2016).</li>
<li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+two-photon+microscopy+enables+near-diffraction-limited+and+functional+retinal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo.</a> Light: Science & Applications. 9, 79(2020).</li>
<li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li>
<li>Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+cells+in+the+living+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging single cells in the living retina.</a> Vision Research. 51 (13), 1379-1396 (2011).</li>
<li>Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+photoreceptor+loss+revealed+with+adaptive+optics%3A+an+alternate+cause+of+color+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics: an alternate cause of color blindness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (22), 8461-8466 (2004).</li>
<li>Rossi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+retinal+mosaics+in+the+living+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Imaging retinal mosaics in the living eye.</a> Eye. 25 (3), 301-308 (2011).</li>
<li>Rossi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+retinal+pigment+epithelium+cells+in+age+related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of retinal pigment epithelium cells in age related macular degeneration.</a> Biomedical Optics Express. 4 (11), 2527-2539 (2013).</li>
<li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+retinal+imaging+in+the+living+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics retinal imaging in the living mouse eye.</a> Biomedical Optics Express. 3 (4), 715-734 (2012).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Takeda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+mediate+non-cell-autonomous+cell+death+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells.</a> Glia. 66 (11), 2366-2384 (2018).</li>
<li>Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract-preventing+contact+lens+for+in+vivo+imaging+of+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina.</a> Biotechniques. 65 (2), 101-104 (2018).</li>
<li>Palczewska, G., Kern, T. S., Palczewski, K. Noninvasive two-photon microscopy imaging of mouse retina and retinal pigment epithelium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalczewska%2C+G+%22Retinal+Degeneration.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Retinal Degeneration. Methods in Molecular Biology</a>. Weber, B. H. F., Langmann, T. 1834, Humana. New York, NY, USA. 333-343 (2019).</li>
<li>Wahl, D. J., Jian, Y., Bonora, S., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavefront+sensorless+adaptive+optics+fluorescence+biomicroscope+for+in+vivo+retinal+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Wavefront sensorless adaptive optics fluorescence biomicroscope for in vivo retinal imaging in mice.</a> Biomedical Optics Express. 7 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+approach-subretinal+injection+of+viral+vectors+for+gene+therapy+in+mice+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53030(2015).</li>
<li>Biss, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescent+imaging+of+the+mouse+retina+using+adaptive+optics%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescent imaging of the mouse retina using adaptive optics.</a> Optics Letters. 32 (6), 659-661 (2007).</li>
<li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+laser-induced+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A mouse model for laser-induced choroidal neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).</li>
<li>Palczewska, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+infrared+vision+is+triggered+by+two-photon+chromophore+isomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5445-5454 (2014).</li>
<li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive-European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pflügers Archive-European Journal of Physiology. 457 (6), 1393-1414 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevating+Growth+Factor+Responsiveness+and+Axon+Regeneration+by+Modulating+Presynaptic+Inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Elevating Growth Factor Responsiveness and Axon Regeneration by Modulating Presynaptic Inputs.</a> Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).</li>
<li>Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transgenic+mouse+lines+expressing+Cre+recombinase+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina.</a> Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).</li>
<li>Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axons+and+dendrites+originate+from+neuroepithelial-like+processes+of+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells.</a> Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+Cre-recombinase+specifically+in+M-+or+S-cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing Cre-recombinase specifically in M- or S-cone photoreceptors.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (1), 42-47 (2004).</li>
<li>Brightman, D. S., Razafsky, D., Potter, C., Hodzic, D., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrl-Cre+transgenic+mouse+mediates+loxP+recombination+in+developing+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Nrl-Cre transgenic mouse mediates loxP recombination in developing rod photoreceptors.</a> Genesis. 54 (3), 129-135 (2016).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+regeneration+of+retinal+ganglion+cells+following+axotomy%3A+effects+of+osteopontin+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling.</a> Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).</li>
<li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-expressing+retinal+ganglion-cell+photoreceptors%3A+cellular+diversity+and+role+in+pattern+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li>
<li>Kim, I. J., Zhang, Y., Yamagata, M., Meister, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452 (7186), 478-482 (2008).</li>
<li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> Journal of Neurophysiology. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li>
<li>Zhu, Y., Xu, J., Hauswirth, W. W., DeVries, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+binary+labeling+of+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted binary labeling of retinal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 34 (23), 7845-7861 (2014).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+transduction+and+targeting+of+retinal+bipolar+cells+with+improved+mGluR6+promoters+in+rodents+and+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated transduction and targeting of retinal bipolar cells with improved mGluR6 promoters in rodents and primates.</a> Gene Therapy. 23 (8-9), 680-689 (2016).</li>
<li>Surace, E. M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+AAV+vectors+for+retinal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer.</a> Vision Research. 48 (3), 353-359 (2008).</li>
<li>Yao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+regulates+proliferation+and+neurogenic+potential+of+Muller+glial+cells+via+a+Lin28%2Flet-7+miRNA-dependent+pathway+in+adult+mammalian+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Wnt regulates proliferation and neurogenic potential of Muller glial cells via a Lin28/let-7 miRNA-dependent pathway in adult mammalian retinas.</a> Cell Reports. 17 (1), 165-178 (2016).</li>
<li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recoverable+state+of+axon+injury+persists+for+hours+after+spinal+cord+contusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A recoverable state of axon injury persists for hours after spinal cord contusion in vivo.</a> Nature Communications. 5, 5683(2014).</li>
<li>Cheung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+network+alterations+in+the+retina+of+patients+with+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">Microvascular network alterations in the retina of patients with Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's & Dementia. 10 (2), 135-142 (2014).</li>
<li>Kerrison, J. B., Flynn, T., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pathologic+changes+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Retinal pathologic changes in multiple sclerosis.</a> Retina. 14 (5), 445-451 (1994).</li>
<li>Sung, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+retinal+thinning+as+a+biomarker+for+cognitive+impairment+in+de+novo+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inner retinal thinning as a biomarker for cognitive impairment in de novo Parkinson's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11832(2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hierin beschreven beeldvormingsprocedure met twee fotonen maakt longitudinale in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis mogelijk. Herhaalbare beelden van hetzelfde gebied van het netvlies kunnen worden verkregen gedurende een continue periode van maximaal 6 of meer h onder isofluraan. De muis kan ook op verschillende dagen worden afgebeeld met behulp van cellulaire en vasculaire oriëntatiepunten om hetzelfde beeldgebied te lokaliseren (figuur 3). Het gebruik van een heldere gel-onderdompeling in combinatie met dekglas voor dit doel is eerder toegepast op een reeks procedures, waaronder visualisatie van het netvlies voor subretinale injectie, laser-geïnduceerde retinale letselmodellen en fundusbeeldvorming 20,21,22.
De anatomie van het oog biedt unieke uitdagingen voor in vivo beeldvorming, omdat de hoge optische kracht van het hoornvlies en de lens van de muis directe beeldvorming door de pupil zonder correctie belemmert. Verschillende andere in vivo beeldvormingsmethoden zijn gebaseerd op het gebruik van een plano-concave contactlens voor correctie van de voorste optiek van het muizenoog 7,17,18,19. Met alleen optische correctie aan het hoornvlies resulteert het hoge optische vermogen van de muislens in een onvermijdelijke hoeveelheid parallax, met name van structuren in het perifere scanveld, die zich manifesteren als uitrekken en translatiebeweging in de X-Y-dimensie op verschillende Z-vlakken. Om beeldparallax-gerelateerde vervorming in X- en Y-dimensies te minimaliseren, is het van cruciaal belang dat het muisoog zo is georiënteerd dat het raakvlak met het netvlies in het beeldvormingsgebied loodrecht staat op het microscooplichtpad. De hier beschreven opstelling is bevorderlijk voor nauwkeurige manipulatie van de hoek van het oog om deze uitlijning te bereiken. Een verstelbare muiskophouder die rotatie langs twee assen mogelijk maakt, maakt eenvoudige handmatige aanpassingen van de hoek van het oog mogelijk terwijl de experimentator door de Z-dimensie scrolt om parallax te minimaliseren. Deze kanteling omzeilt ook het veldstopeffect van de pupil om grotere delen van het netvlies in beeld te brengen. De beperking van de hoofdhouder vermindert ook sterk bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling.
Er moet voor worden gezorgd dat de helderheid van het muizenoog behouden blijft, omdat de beeldkwaliteit verslechtert met opacificatie tijdens continue beeldvorming. Frequente hertoepassing van glijmiddelgel tijdens beeldvorming en zalftoepassing na elke beeldvormingssessie helpen voorkomen dat het oog uitdroogt en opaciteiten ontwikkelt. Sommige hoornvliesopaciteiten zullen spontaan verdwijnen na 24-48 uur. Het gebruik van heldere gel en coverglas zoals beschreven in dit protocol zorgt voor een vergelijkbare beeldkwaliteit en aberratiecorrectie als een contactlens7, terwijl het gemakkelijker is om de ooghoek aan te passen zonder dat het afdekglas opnieuw hoeft te worden uitgelijnd. Bovendien zorgt de gel voor een continue hydratatie van het oog, waardoor het mogelijk is om acute beeldvormingssessies van maximaal enkele uren uit te voeren. Ten slotte, omdat het afdekglas geen contact maakt met het hoornvlies, veroorzaakt het minimale irritatie van het oog dat de optische helderheid kan verminderen voor herhaalde beeldvormingssessies.
Een beperking van deze benadering is het feit dat optische aberraties niet volledig worden gecorrigeerd. Hoewel dit de axiale resolutie ernstig vermindert als gevolg van de zware parallax, kunnen kwantitatieve metingen van de soma worden verkregen in single-image vlakken. Opgemerkt moet worden dat aangezien de fluorescentiesignaalintensiteit van retinale neuronen afhankelijk is van de uitlijning van het monster met deze methode, excitatie- en emissieratiometrische sensoren meer geschikt zijn voor experimenten waarbij monsters chronisch worden vergeleken over verschillende beeldvormingssessies. Een benadering om optische aberraties op systeemniveau te corrigeren is adaptieve optica, die subcellulaire resolutie in het netvliesmogelijk maakt 8,9,14,21. Adaptieve optica vereist echter zeer gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide expertise om te implementeren.
Alternatieve benaderingen voor twee-fotonen in vivo retinale beeldvorming zijn confocale microscopie of oftalmoscopie6. De hier gepresenteerde aanpak moet gemakkelijk te vertalen zijn naar widefield- of confocale microscopie. Beeldvorming met één foton is misschien robuuster en vormt minder risico op beschadiging van het netvlies vanwege de hoge energie van de twee-fotonenlaser die nodig is om een efficiënt tweefotoneneffect te bereiken door het hoornvlies en de lens van het oog. Om laserschade met twee fotonen te voorkomen, moet de drempel voor maximaal laservermogen empirisch worden bepaald door wholemount retinas te onderzoeken na voltooiing van beeldvormingsexperimenten en immunostaining voor celtypen in de afgebeelde lagen. In het hier gepresenteerde systeem werden RGC's gelabeld met de pan-RGC-marker, Rbpms, en dichtheden waren normaal tot 45 mW beeldvermogen, terwijl 55 mW een significant verlies van RGC's veroorzaakte (niet getoond).
Een nadeel van beeldvorming met één foton is het feit dat deze aanpak de inheemse visuele circuits van het netvlies zeer sterk zal stimuleren in vergelijking met beeldvorming met twee fotonen23. Eerdere experimenten met retinale wholemounts of oogschelppreparaten hebben aangetoond dat laserscanning met twee fotonen circuitactivering uitlokt die grotendeels van voorbijgaande aard is24. Hier laat beeldvorming van RGC-activiteit met de Ca2+ sensor Twitch2b zien dat het begin van laserscanning Ca2+ verhogingen induceert, die in de loop van 5-20 s in de meeste RGC's terugkeren naar de basislijn (figuur 8). Gezien het feit dat het laservermogen in dit protocol in het bereik ligt van eerdere experimenten die in vivo retinale lichtrespons8 rapporteren, is de momenteel beschreven methode waarschijnlijk vatbaar voor opnames van circuitactiviteit in het netvlies. Dergelijke overwegingen zijn belangrijk voor experimenten die kunnen worden beïnvloed door circuitactiviteit.
Dit protocol demonstreert in vivo beeldvorming van twee soorten retinale neuronen, RGC's en amacrinecellen. Vergelijkbare etikettering van andere belangrijke celtypen kan worden bereikt, waaronder horizontale cellen (Cx57-Cre25), bipolaire cellen (Chx10-Cre26; mGluR6-GFP27), kegelfotoreceptoren (S- of M-opsine-Cre28), staaffotoreceptoren (Nrl-Cre29), Müller-glia (Foxg1-Cre26) en pericyten (NG2-DsRed9). Transgene muizen zijn ook beschikbaar om discrete subsets van RGC's te labelen (bijv. KCNG4-Cre voor αRGCs30; OPN4-Cre voor ipRGCs31; JAM-B-CreER voor J-RGC's32) en amacrinecellen (bijv. ChAT-Cre voor starburst-amacrinecellen26 en neuropeptide-promotordrivers voor verschillende amacrinecelsubtypen 3,34). Virale vectoren kunnen worden gebruikt om specifieke celpopulaties te targeten in plaats van transgene muizen. Intravitreale injecties van AAV2 met een alomtegenwoordig CAG-promotorelement labelen bijna uitsluitend RGC's, amacrinecellen en horizontale cellen25. Door de gemodificeerde AAV2.7m8-Y444F capsid te koppelen aan een ontworpen mGluR6 promotorconstructie kan een brede labeling van ON bipolaire cellen35. Subretinale injecties van AAV leiden tot een verrijking van fotoreceptoren, waarbij serotype AAV2/5 de hoogste transductie-efficiëntieheeft 36. Shh10, een gemodificeerd AAV6 capsid eiwit, gecombineerd met glial fibrillaire zure eiwitbevorderaars is specifiek aangetoond voor Müller glia37.
Het vermogen om cellen in het centrale zenuwstelsel te observeren met een volledig niet-invasieve benadering kan worden gebruikt om zowel basiseigenschappen van neurale circuits8 als mechanismen van neurodegeneratie 3,4,5,6,38 te bestuderen. Veel verblindende ziekten richten zich op cellulaire populaties in het netvlies, en in vivo beeldvormingsbenaderingen bij muizen zijn gebruikt om oogzenuwletsel 1,3,4, maculaire degeneratie13, beroerte5, glaucoom 2,6 en uveïtis7 te bestuderen. Bovendien manifesteren veel neurodegeneratieve aandoeningen van het centrale zenuwstelsel zich in het netvlies, waaronder de ziekte van Alzheimer39, multiple sclerose40 en de ziekte van Parkinson41. Daarom kan deze gemakkelijk toegankelijke techniek voor in vivo beeldvorming van het netvlies worden toegepast als een hulpmiddel om een breed scala aan neurodegeneratieve aandoeningen te bestuderen.

In vivo visualisatie van het centrale zenuwstelsel vereist over het algemeen invasieve procedures zoals schedelverdunning en installatie van glazen ramen of optische relaislenzen. Het netvlies is de enige structuur in het zenuwstelsel die direct kan worden waargenomen zonder de noodzaak van invasieve voorbereiding, omdat het inheems licht uit de omgeving ontvangt. Het gemak van optische toegang tot het netvlies maakt het een aantrekkelijk modelsysteem voor het bestuderen van het centrale zenuwstelsel.
Live fluorescerende beeldvorming van het netvlies bij muizen is gebruikt om RGC-sterfte te volgen in modellen van glaucoom 1,2, oogzenuwletsel 1,3,4 en beroerte5, evenals veranderingen in microgliale activering 6,7,8 en vasculatuur9 bij degeneratieve omstandigheden. Intrinsieke signalen kunnen ook worden gebruikt om fotoreceptoren 10,11,12 en retinale pigmentepitheelcellen 13 te visualiseren. Veel benaderingen voor in vivo beeldvorming van het netvlies gebruiken ofwel zeer gespecialiseerde apparaten die specifiek zijn ontworpen voor oogheelkundige doeleinden6 of sterk gemodificeerde optische systemen om te corrigeren voor de inheemse aberraties van het hoornvlies en de lens 8,9,11,12,13,14.
Het huidige protocol demonstreert een benadering van in vivo beeldvorming van fluorescerende signalen in het netvlies met cellulaire resolutie, met behulp van een basismethode voor gedeeltelijke correctie voor de voorste optica van het muizenoog. Deze strategie vereist zeer kleine aanpassingen aan multifoton microscoopopstellingen die vaak worden gebruikt voor in vivo beeldvorming van de hersenen. Omdat deze aanpak eenvoudig in te stellen is en de muizen weinig stress hebben, is het bevorderlijk om time-lapse-experimenten uit te voeren gedurende zowel acute als chronische duur. Bovendien zijn genetische en op organische kleurstoffen gebaseerde procedures die individuele retinale componenten labelen, waaronder RGC's, amacrinecellen, microglia en vasculatuur, compatibel met deze beeldvormingstechniek en maken in vivo observatie mogelijk van celtypen en structuren die cruciaal zijn voor de retinale functie. Deze hulpmiddelen kunnen worden aangepast om de meeste andere neuronale celtypen te labelen, evenals gliale en vasculaire componenten van het netvlies.

<table><tbody><tr><td>#1.5 coverslip</td><td>ThermoFisher</td><td>152440</td><td>Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm</td></tr><tr><td>50 mL glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>80950</td><td>22G cemented needle</td></tr><tr><td>Adeno-associated virus (AAV2)</td><td>Hope Center Viral Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Air Pump</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-30</td><td></td></tr><tr><td>Atropine</td><td>Sigma</td><td>A0132</td><td>Voor pupillenverwijderoplossing</td></tr><tr><td>Basic Small Animal Anesthesia Device</td><td>RWD Life Science</td><td>R500IE</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Sutter</td><td>B150-86-10</td><td>Buitendiameter 1,50 mm, binnendiameter 0,86 mm, lengte 10 cm</td></tr><tr><td>CFP/YFP filter cube</td><td>Chroma</td><td>custom</td><td>480/40, 505 long pass, 535/30</td></tr><tr><td>ChromoFlex - Two channel PMT detection unit</td><td>Scientifica</td><td>S-MPLG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heating pump</td><td>Braintree Scientific</td><td>tp-700</td><td>Ingesteld op 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Cling film</td><td>VWR</td><td>10713-916</td><td></td></tr><tr><td>Compact Filter Holder</td><td>ThorLabs</td><td>DH1</td><td>Houdt coverslip over het oog van de muis</td></tr><tr><td>Cx3cr1-GFP transgene muizen (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005582</td><td></td></tr><tr><td>DAQ controller chassis</td><td>National Instruments</td><td>PXIe-1073</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition device</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090A</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue kleurstof</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1677409</td><td></td></tr><tr><td>FPGA module met digitizer</td><td>National Instruments</td><td>NI-5734</td><td></td></tr><tr><td>Gas Evacuation Apparatus</td><td>RWD Life Science</td><td>R546W</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal Severe smeermiddelooggel&nbsp;&nbsp;</td><td>Alcon</td><td>(van de lokale apotheek)</td><td>Voor gebruik tijdens beeldvorming</td></tr><tr><td>GFP/Red filter cube</td><td>Chroma</td><td>custom</td><td>535/30, 560 long pass, 605/70</td></tr><tr><td>Verwarmingspad</td><td>McKesson Medical and Surgical</td><td>190147</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Launch Optics voor gebruik met Pockels Cell</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-101080</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Main module</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-100466</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Scan Path</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-100406</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope X galvo Module</td><td>Scientifica</td><td>MP-100443</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Fiji software</td><td></td><td>Freeware</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran gasfiltercanister (actief scavengin)</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-31</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran gasfiltercanister (passief scavengin)</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-31S</td><td></td></tr><tr><td>ketamine HCl (100 mg/mL)</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>M32 naar M26 adapter</td><td>ThorLabs</td><td>M32M26S</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai GUI software</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>MathWorks</td><td>NA</td><td>R2015b</td></tr><tr><td>meloxicam (5 mg/mL)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>NDC 0010-6013-01</td><td>Pijnstiller</td></tr><tr><td>Micorscope Objectief</td><td>Edmund Optics</td><td>46-404</td><td>Mitutoyo WE715042319</td></tr><tr><td>micropipet puller</td><td>Sutter</td><td>Flaming/Brown Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Fisher</td><td>BP2629-1</td><td></td></tr><tr><td>Mini bulldog hemostatic clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>18053-28</td><td></td></tr><tr><td>Miniature EVA Tubing 0,02" ID, 0,06" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>1883T1</td><td></td></tr><tr><td>Miniature EVA Tubing 0,05" ID, 0,09" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>1883T4</td><td></td></tr><tr><td>Muis hoofd houder</td><td>Narishige</td><td>SGM-4</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Optic Posts 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>TR3-P5</td><td></td></tr><tr><td>Optical power meter kit</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>pE-300 Ultra LLG Deivery</td><td>Scientifica</td><td>COO-LED3ULLGs</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P6126</td><td>Voor pupillenverwijderoplossing</td></tr><tr><td>Pockels cell</td><td>Conoptics</td><td>350-80-02</td><td></td></tr><tr><td>Pockels cell amplifier</td><td>Conoptics</td><td>Model 302RM</td><td></td></tr><tr><td>Proparacaine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>1571001</td><td>Voor oog immobilisatie</td></tr><tr><td>Red &amp; Far Red short pass filter Cube</td><td>Chroma</td><td>custom</td><td>560 short pass</td></tr><tr><td>Roterende 1/2" post clamp</td><td>ThorLabs</td><td>SWC</td><td></td></tr><tr><td>ScanImage package</td><td>Vidrio Technologies</td><td>Freeware</td><td>Beeldverwervingssoftware; Versie 5.4.0 (2018); vereist MATLAB</td></tr><tr><td>sodium chloride oplossing, steriele (0,9%)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>NDC 63323-186-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>S9 E</td><td></td></tr><tr><td>Tabelcentrifuge</td><td>Oxford</td><td>Benchmate C8</td><td></td></tr><tr><td>Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibioticum oogzalf</td><td>Zoetisus</td><td>NA</td><td>Voor gebruik na intravitreale injectie</td></tr><tr><td>ThermoRack koelsysteem</td><td>Solid State Cooling Systems</td><td>ThermoRack 401</td><td>Ingesteld op 20 &deg;C</td></tr><tr><td>Ultrafast Ti:Sapphire laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>Vgat-Cre transgene muizen (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>016962</td><td></td></tr><tr><td>VGlut2-Cre transgene muizen (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>016963</td><td></td></tr><tr><td>VivoScope voor In Vivo Imaging</td><td>Scientifica</td><td>S-MPVS-1200-00P</td><td></td></tr><tr><td>White petrolatum-mineral olie smeermiddel oogzalf</td><td>Stye</td><td>NA</td><td>Voor gebruik na beeldvorming</td></tr><tr><td>xylazine HCl (20 mg/mL)</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Het netvlies zet lichtsignalen uit de omgeving om in elektrische signalen die worden doorgegeven aan de hersenen. Ziekten van het netvlies komen veel voor en veroorzaken slechtziendheid en blindheid. Begrijpen hoe dergelijke ziekten vorderen is van cruciaal belang voor het formuleren van nieuwe behandelingen. In vivo microscopie in diermodellen van ziekten is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van neurodegeneratie en heeft geleid tot belangrijke vooruitgang in de richting van behandelingen van aandoeningen variërend van de ziekte van Alzheimer tot beroerte. Aangezien het netvlies de enige structuur van het centrale zenuwstelsel is die inherent toegankelijk is voor optische benaderingen, leent het zich van nature voor in vivo beeldvorming. De inheemse optiek van de lens en het hoornvlies vormen echter enkele uitdagingen voor effectieve toegang tot beeldvorming.
Dit protocol schetst methoden voor in vivo beeldvorming met twee fotonen van cellulaire cohorten en structuren in het netvlies van de muis met cellulaire resolutie, toepasbaar voor zowel acute als chronische beeldvormingsexperimenten. Het presenteert voorbeelden van retinale ganglioncel (RGC), amacrinecel, microgliale en vasculaire beeldvorming met behulp van een reeks etiketteringstechnieken, waaronder adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren, transgene muizen en anorganische kleurstoffen. Belangrijk is dat deze technieken zich uitstrekken tot alle celtypen van het netvlies en dat voorgestelde methoden voor toegang tot andere cellulaire populaties van belang worden beschreven. Ook gedetailleerd zijn voorbeeldstrategieën voor handmatige beeldnabewerking voor weergave en kwantificering. Deze technieken zijn direct toepasbaar op studies van retinale functie in gezondheid en ziekte.

Verschillende transgene, virale vector of anorganische kleurstof-etiketteringsbenaderingen kunnen worden gebruikt om specifiek verschillende retinale celtypen en -structuren in vivo te visualiseren met behulp van een eenvoudige aanpassing van een eenvoudige multifotonenmicroscoop. Om RGC's en amacrinecellen te visualiseren, kregen VGlut2-Cre en VGat-Cre transgene muizen respectievelijk een intravitreale injectie van een Cre-afhankelijk AAV-expressieconstruct dat codeert voor Twitch2b, een cytoplasmatische fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) -gebaseerde Ca2 + -sensor die cyaan en gele fluorescerende eiwitten bevat (respectievelijk CFP en YFP) en het Ca2 + bindingsdomein van troponine15 . Bij VGlut2-Cre muizen zijn RGC-soma's duidelijk waarneembaar en fascikels van axonen zijn vaak zichtbaar (figuur 3).
Opgemerkt moet worden dat het traject van axonen en het negatieve beeld van de vasculatuur het heel eenvoudig maakt om de oogzenuwkop bij VGlut2-Cre-muizen te identificeren, wat nuttig is als een mijlpaal in chronische beeldvormingsexperimenten (figuur 3). Hoewel amacrinecellen minder helder lijken dan RGC's, mogelijk vanwege hun kleinere somagrootte en / of minder efficiënte AAV-transductie, zijn hun soma's nog steeds gemakkelijk zichtbaar in de binnenste nucleaire laag. In tegenstelling tot RGC's worden amacrinecelneurieten vaker waargenomen in de binnenste plexivormen (figuur 4). Retinale microglia kunnen worden afgebeeld in de Cx3cr1-GFP transgene muislijn6. Microglia associëren met de vasculatuur, waardoor het mogelijk is om hetzelfde gebied te vinden in time-lapse beeldvormingsexperimenten.
Deze benadering kan worden gebruikt om de dynamiek van fijne microgliaprocessen te volgen, een procedure met een betere ruimtelijke resolutie in enkelvlaksbeelden, of als projecties met maximale intensiteit worden voorbereid die zich richten op individuele cellen (figuur 5). De slechte axiale resolutie veroorzaakt door optische aberratie door de muislens verhindert onderzoek van fijne details in de z-dimensie. Om te bepalen of deze beeldvormingstechniek degeneratieve veranderingen in cellulaire ultrastructuur kan waarnemen, werd 1 μL van 50 mM N-methyl-D-aspartaat (NMDA) in het glasvocht geïnjecteerd om excitotoxische laesie te induceren. Een dag na de injectie vertoonden de microglia korte processen of amoeboïde morfologie (figuur 5) in overeenstemming met eerdere rapporten16. Opgemerkt moet worden dat cellen in de Cx3cr1-GFP transgene lijn meer uniforme en complete fluorescerende eiwitexpressie vertoonden in het cellulaire cohort dan in experimenten met AAV-gemedieerde levering van fluorescerende eiwitexpressiecassettes. De voordelen van gevarieerde en spaarzame versus volledige en uniforme etikettering moeten worden overwogen bij het ontwerpen van experimenten.
Om retinale vasculatuur te labelen zoals eerder beschreven8, werden muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met 200 μL Evans blauwe kleurstof (20 mg / ml in steriele zoutoplossing) 30-60 minuten vóór beeldvorming. Dit leidde tot een sterke etikettering van bloedvaten afkomstig van de oogzenuwkop (figuur 6). Verrassend genoeg bleef het fluorescerende signaal van een enkele injectie minstens zeven dagen bestaan. Twee verschillende methoden werden gebruikt om de afmetingen van de in vivo beelden te schatten. Eerst werden dezelfde retinale gebieden in vivo en na fixatie in afgeplatte retinale wholemounts in beeld gebracht met behulp van confocale microscopie (figuur 7). Willekeurige celparen werden geselecteerd uit vier verschillende in vivo monsters, en de ware afstand tussen celparen werd gemeten in confocale scans en gematcht met in vivo pixelafstand om een gemiddelde pixelgrootte van 0,99 μm te verkrijgen met 1x digitale vergroting. Het gebruik van vergelijkbare methoden die in vivo beelden correleren met confocale wholemount-scans heeft aangetoond dat een enkele hoofdpositie beeldvorming mogelijk maakt over een ongeveer 650 mm2-patch van het netvlies.
Herpositionering van de hoofdhouder langs één torsieas kan toegang bieden tot een lineair gebied van het netvlies met een lengte van 2,2 mm (niet weergegeven). Verder werden fluorescerende microsferen met een diameter van 1 of 2 μm geïnjecteerd in de ogen van muizen en hun diameter werd gemeten als half-maximum van lijnscans over de volledige breedte van in vivo beelden met 10x digitale zoom. Dit gaf een iets grotere schatting van de pixelgrootte, maar met meer variantie (figuur 7). Over het algemeen is confocale beeldvorming van wholemount-monsters na voltooiing van in vivo experimenten de meest consistente methode om schaal toe te wijzen aan individuele afbeeldingen, omdat variantie in cornea- en lenseigenschappen de beeldschaal van monster tot monster kan veranderen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2.jpg"> Figuur 1: Lichtpad schematisch. De basiscomponenten van de twee-fotonenmicroscoop die in dit protocol wordt gebruikt, bestaan uit een Pockels Cell om het laservermogen te moduleren, een lenspaar om de diameter van de laserstraal te verkleinen om overeen te komen met de achterste opening van het microscoopdoel en een paar galvo-scanspiegels voor straalbesturing. Voor elk belangrijk optisch onderdeel is een paar stuurspiegels aanwezig. De scherpstelling wordt geregeld door een motor die de objectiefsteun aandrijft. Het emissielichtpad kan worden aangepast voor verschillende fluoroforen door dichroïsche en barrièrefilters te vervangen. Een algemene opstelling voor cyaan / geel / rood beeldvorming wordt weergegeven waarin een dichroïsche spiegel met korte doorgang rood licht naar de eerste PMT leidt, en een dichroïsche spiegel met lange doorgang in combinatie met geschikte banddoorlaatfilters wordt gebruikt om cyaan- en gele emissies te scheiden. Afkorting: PMT = photomultiplier tube. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2.jpg"> Figuur 2: Positionering van muizen voor in vivo beeldvorming. Om de muis met de pupil op de as met het lichtpad te positioneren, wordt de verdoofde muis eerst in een hoofdhouder gehouden, wordt het hoofd gedraaid en schuin gezet, wordt een grote druppel glijmiddelooggel op het oog geplaatst en wordt de muis op het podium geplaatst. Een coverslip wordt in de coversliphouder loodrecht op het lichtpad gemonteerd en naar beneden naar het oog gebracht. De coverslip mag geen contact maken met het hoornvlies of de muiskop (links), wat duidelijk zal zijn als de coverslip wordt afgebogen. De coverslip moet echter ook dicht genoeg zijn om taille van de druppel te voorkomen (rechts), omdat dit een demagnificerend effect op het monster zal hebben. Na het aanbrengen van de gel-onderdompeling en het vastzetten van de coverslip, moet het podium direct onder het microscoopdoel op zijn plaats worden geplaatst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3.jpg"> Figuur 3: Beeldvorming van retinale ganglioncellen. Voor beeldweergave worden projecties met maximale intensiteit gemaakt met de z-vlakken die interessante cellen bevatten, en resulterende beelden worden mediaangefilterd om PMT-opnameruis te verwijderen. Twee voorbeelden van retinale ganglioncellen gelabeld door AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in VGlut2-Cre transgene muizen te injecteren, worden getoond, met name het CFP-signaal. Beelden werden verkregen tijdens sessies met een tussenpoos van vier dagen en vasculaire oriëntatiepunten werden gebruikt om terug te keren naar hetzelfde gebied in de buurt van de oogzenuwkop. De oogzenuwkop is naar de onderkant van het beeld gericht. Hoewel beide monsters enige variatie in oriëntatie vertonen (regio's met verminderde intensiteit worden aangegeven met pijlen), zijn de meeste cellen op beide tijdstippen aanwezig. Schaalbalk = ongeveer 50 μm. Afkortingen: PMT = fotomultiplicatorbuis; AAV = adeno-geassocieerd virus; EF1α = rekfactor-1alpha; FLEX = flip-excisie; VGlut2 = vesiculaire glutamaattransporter 2; CFP = cyaan fluorescerend eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2.jpg"> Figuur 4: Beeldvorming van amacrinecellen. Amacrinecellen werden gelabeld door AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b te injecteren in VGat-Cre transgene muizen. Het CFP-signaal van Twitch 2b wordt specifiek weergegeven. Kleine projecties met maximale intensiteit gericht op de diepten van de binnenste nucleaire laag duiden op amacrinecel soma's, terwijl focussen op de binnenste plexivorm amacrine celneurieten (pijl) oplost. De oogzenuwkop is rechts van het beeld georiënteerd. Schaalbalk = ongeveer 50 μm. Afkortingen: AAV = adeno-geassocieerd virus; EF1α = rekfactor-1alpha; FLEX = flip-excisie; VGat = vesiculaire gamma aminoboterzuurtransporter; CFP = cyaan fluorescerend eiwit; INL = binnenste nucleaire laag; IPL = binnenste plexiforme laag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2.jpg"> Figuur 5: Beeldvorming van microglia. De transgene muislijn Cx3cr1-GFP werd gebruikt om microglia te labelen. Een projectie met maximale intensiteit van het volledige scanvolume toont veel microglia, sommige met fijne procesdetails die kunnen worden opgelost. Merk op dat cellen linksonder in het veld minder vervorming vertonen in de maximale projectie dan cellen rechtsboven als gevolg van parallax in dit gebied. Projecties met maximale intensiteit die alleen de cel van belang bevatten, verminderen deze parallax (midden, verpakt in overeenkomstige kleuren) aanzienlijk. Bovendien kan deze beeldvormingsstrategie de dynamiek van fijne microglia-procesremodellering (onderste panelen) documenteren. Relatief gezien kunnen veel microglia worden gezien met korte processen of amoeboïde morfologie een dag na een excitotoxische laesie door intravitreale injectie van 50 mM NMDA (rechts). Schaalbalk = ongeveer 50 μm. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; Cx3cr1 = Cx3 chemokine receptor 1; NMDA = N-methyl-D-aspartaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2.jpg"> Figuur 6: Etikettering van vasculaire oriëntatiepunten. Muizen werden geïnjecteerd met 200 μL van 20 mg / ml Evans blauw intraperitoneaal 30-60 minuten voorafgaand aan de eerste beeldvormingssessie. Projecties met maximale intensiteit van volledige dikte tonen blijvende fluorescentie in de retinale vasculatuur die ten minste zeven dagen aanhield. Schaalbalk = ongeveer 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2.jpg"> Figuur 7: Afbeeldingsafmetingen. Retinale ganglioncellen gelabeld door AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in VGlut2-Cre transgene muizen te injecteren, werden in vivo in beeld gebracht en hetzelfde gebied werd vervolgens in beeld gebracht door confocale laserscanmicroscopie na fixatie en wholemount-voorbereiding van het netvlies. Geel fluorescerend eiwitkanaal wordt voor beide weergegeven. Gekleurde pijlparen geven dezelfde cel aan in beide preparaten (bovenste panelen). Enkelvlaksopname van fluorescerende microsferen met een diameter van 2 μm die intravitreaal worden geïnjecteerd en in vivo worden afgebeeld (linkeronderpaneel). Microsferen bezinkten niet en waren dus in constante beweging waardoor het meten van axiale resolutie onmogelijk werd. Pixelgroottes berekend op basis van halve maximale metingen over de volledige breedte van in vivo fluorescerende microsferen of correlatieve confocale metingen van 2-4 netvliezen per groep (rechtsonder). Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: AAV = adeno-geassocieerd virus; EF1α = rekfactor-1alpha; FLEX = flip-excisie; VGlut2 = vesiculaire glutamaattransporter 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2.jpg"> Figuur 8: Calciumactiviteit geïnduceerd door twee-fotonen scannen. Retinale ganglioncellen gelabeld door AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b te injecteren in VGlut2-Cre transgene muizen, YFP is pseudogekleurd magenta en CFP groen, afgebeeld in een enkel vlak als een tijdreeks op 4,22 Hz. Alle RGC's hadden een vergelijkbare start-YFP/CFP-ratio. De meesten reageerden met een toename van de FRET-ratio (exclusief de oranje cel), en één handhaafde een hoge YFP / CFP-ratio gedurende de tijdreeks (gele cel). YFP/CFP-verhoudingen werden genormaliseerd naar het gemiddelde van het eerste frame en gekleurde cirkels komen overeen met gekleurde sporen. Sterretjes geven tijdspunten aan met representatieve afbeeldingen aan de linkerkant. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: AAV = adeno-geassocieerd virus; EF1α = rekfactor-1alpha; FLEX = flip-excisie; VGlut2 = vesiculaire glutamaattransporter 2; YFP = geel fluorescerend eiwit; CFP = cyaan fluorescerend eiwit; RGC's = retinale ganglioncellen; FRET = fluorescentie resonantie energieoverdracht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Deze methode van in vivo beeldvorming van retinale cellen maakt onderzoek van oogheelkundige ziekten mogelijk en het begrijpen van normale functies van het netvlies. Deze methode biedt een eenvoudige en zeer reproduceerbare benadering van in vivo beeldvorming van het netvlies door middel van twee-fotonenmicroscopie. Het goed stabiliseren van de muis is de sleutel tot het verkrijgen van hoogwaardige in vivo beelden.Oefen het instellen van de muis in de hoofdhouder en raak vertrouwd met de procedure voordat u probeert afbeeldingen te verkrijgen. Verdoof het dier volgens het goedgekeurde protocol voor het gebruik van dieren. Breng pupilverwijdingsoplossing aan en laat de muis vijf minuten in het donker om de pupillen te laten verwijden.Zet de onderste gehoorgangpen vast in de naar binnen geschoven positie en de bovenste gehoorgangpen in de teruggetrokken positie. Draai de hoofdarm van de hoofdhouder totdat de oorstukbalk is gekanteld in een hoek van 60 graden onder horizontaal. Terwijl de muis naar de bijtbalk is gericht, monteer je één oor op de verlengde onderste pin met de pin in de gehoorgang gestoken.Nadat u de schroef hebt losgemaakt die de bovenste gehoorgangpen hebt vastgezet, steekt u de pin uit in de andere gehoorgang en maakt u de schroef opnieuw vast om de kop vast te zetten. Zorg ervoor dat de muis veilig in de hoofdhouder zit. Druk op de bovenkant van het hoofd.De muis moet stevig in de oorstangen blijven en zijn hoofd moet vrij rond de as van de gehoorgangen draaien. Met de bijtbalk in de richting van de kop van de muis geplaatst, tilt u de kop van de muis voorzichtig op zodat de maxillaire snijtanden in de bijtstaafhouder kunnen worden neergelaten en trek u de bijtbalk met zachte kracht in om het hoofd vast te zetten. Gebruik de schroef om de bijtbalk op zijn plaats te zetten en plaats de muis en houder op het microscoopstadium.Breng glijmiddeloogdruppels aan op beide ogen van de muis. Draai de hoofdarm van de hoofdhouder totdat de pupil van één oog in lijn met het lichtpad is georiënteerd en plaats een nummer 1,5 afdeksel in de compacte filterhouder. Nadat u de houder aan de microscoopfase hebt bevestigd, laat u de coverslip zakken totdat deze in contact komt met de glijmiddelooggel zonder het hoornvlies aan te raken en past u het stadium in de X-Y-dimensie en de objectieve Z-positie aan totdat het widefield-excitatielicht het hoornvlies volledig bedekt.Gebruik het oculair om de Z-positie aan te passen totdat de fluorescerende cellen of structuren in het netvlies in beeld komen, waarbij de epifluorescentieverlichting indien nodig wordt verhoogd om individuele cellen of structuren van belang op te lossen. Verfijn de uitlijning van het netvlies met het beeldvormende lichtpad. Pas de balhoofdhoek aan totdat alleen uitbreiding of samentrekking van het onscherpe licht optreedt bij het wijzigen van het brandpuntsvlak, waardoor X-Y-vervormingen worden geminimaliseerd.Schakel vervolgens de epifluorescentieverlichting uit en sluit de sluiter van de illuminator. Volg voor beeldvorming met twee fotonen alle institutionele laserveiligheidsprotocollen. Schakel al het omgevingslicht uit en bedek het excitatielichtpad naar de laser en het emissielichtpad naar de PMT's.Stel in de software voor het verkrijgen van afbeeldingen de framegrootte in op 512 bij 512 en het framegemiddelde op drie. Stel de Z-stepping in om bovenaan de stapel te beginnen en naar beneden te gaan, waardoor de laseractivering van de fotoreceptoren met twee fotonen wordt geminimaliseerd. Schakel de PMT's in en schakel deze in en pas de spanning aan op 680 volt.Schakel de beeld- en emissieluiken in. Begin een live beeldvoorbeeld van het doelweefsel, beginnend bij een laservermogen van 1%, en pas de helderheid van het scherm automatisch aan om de interessante cellen of structuren te visualiseren. Als het doelweefsel zwak of onduidelijk is, verhoogt u het laservermogenspercentage totdat structuren zichtbaar worden zonder 45 milliwatt te overschrijden.Manoeuvreer het microscoopstadium in de X-Y-richting om te centreren op een gewenst beeldgebied en navigeer naar het Z-vlak met de interessante structuren in focus. Voor een chronisch time-lapse-experiment opent u een eerder verkregen afbeelding om te gebruiken als referentie voor de interessante cellen, waarbij u ervoor zorgt dat de beeldhoek in de huidige afbeelding vergelijkbaar is met die van de vorige afbeeldingen. Navigeer vervolgens naar de bovenste en onderste Z-vlakken van belang om de Z-limieten van de afbeeldingsstack in te stellen en de afbeelding te verkrijgen.Wanneer alle beelden zijn verkregen, schakelt u de PMT's en de lasersluiter uit. Schakel het excitatielichtpad naar epifluorescentieverlichting en emissielichtpad terug naar het oculair. Sluit vervolgens de beeldacquisitiesoftware af, schakel de laser in de computerinterface uit en sluit de hardware in omgekeerde opstartvolgorde af, met uitzondering van de always-on-apparatuur.Verwijder aan het einde van de analyse de muis uit de hoofdhouder en gebruik een pluisvrij weefsel om de ooggel voorzichtig te verwijderen. Breng vervolgens glijmiddel oogzalf aan op beide ogen en plaats de muis op een 37 graden Celsius warm water circulerend verwarmingskussen met monitoring tot volledige ligwater, voordat de muis terugkeert naar zijn behuizing. Bij VGlut-2-Cre muizen zijn retinale ganglioncel soma's duidelijk waarneembaar en axon fascikels zijn vaak duidelijk zichtbaar.Het traject van axonen en het negatieve beeld van de vasculatuur vergemakkelijkt de identificatie van de oogzenuwkop bij VGlut-2-Cre-muizen, wat nuttig is als een mijlpaal in chronische beeldvormingsexperimenten. In tegenstelling tot retinale ganglioncellen worden amacrinecelneurieten vaker waargenomen in de binnenste plexiforme lagen. Een dag na intraoculaire NMDA-injectie vertonen retinale microglia korte processen of amoeboïde morfologie in overeenstemming met eerdere rapporten.De toediening van Evans blauwe kleurstof via een enkele intraperitoneale injectie 30 tot 60 minuten voor beeldvorming induceert een sterke etikettering van de bloedvaten afkomstig van de oogzenuwkop die ten minste zeven dagen aanhoudt. Na fixatie kan de werkelijke afstand tussen celparen binnen afgeplatte retinale hele mounts worden gemeten in confocale scans en worden gematcht met in vivo pixelafstanden om de gemiddelde pixelgrootte van in vivo beelden te bepalen. Fluorescerende microsferen geïnjecteerd in de ogen van muizen maken het mogelijk om de diameter van de microsfeer in vivo te meten, wat een iets grotere schatting van de pixelgrootte geeft, maar met meer variantie.In vivo beeldvorming kan worden gecombineerd met histologische analyses zoals immunostaining en in situ hybridisatie. Deze methoden kunnen specifieke celtypen identificeren en genexpressie van afgebeelde cellen onderzoeken.

transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed,...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Source: Bosco, A., et al. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (2015) This video demonstrates in vivo imaging of retinal microglia in a mouse model of glaucoma. A transgenic mouse with fluorescent protein-expressing retinal microglia is positioned under an ophthalmoscope. Infrared illumination is used to locate the optic nerve head (ONH), and the focal plane is...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

Source: Jongbloets, B. C., et al. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (2019) This video demonstrates a two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy procedure for visualizing protein kinase A activity in head-fixed, behaving mice during enforced locomotion.

Visualizing Protein Kinase A Activity in a Mouse Using Two-Photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy 

Source: Jagodzinska, J., et. al.,  Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  In this video, we demonstrate the use of spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) to image retinal layers and assess structural changes in a genetically modified mouse model with optic neuropathy.

In Vivo Imaging of the Mouse Retina Using Optical Coherence Tomography

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (2018)This video showcases two-photon microscopy being used to image neurons in the brain of an anesthetized transgenic mouse pup. The two-photon laser allows for deeper imaging with high spatial resolution and minimal light scattering, enabling the detailed capture of neuronal morphology, including dendritic projections.

Two-Photon Microscopy for Imaging Neuronal Morphology  in a Mouse Pup

Source: Nishimura, C. et al. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (2016). This video demonstrates the in vivo visualization of cortical capillaries in the mouse brain using two-photon microscopy. It outlines the steps for injecting a fluorescent dye into an anesthetized mouse with a thin-skull cortical window, preparing the setup for imaging, and acquiring detailed images of brain...

 Two-Photon Microscopy for In Vivo Imaging of Mouse Brain Microvasculature 

Source: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of two-photon microscopy to monitor calcium dynamics in cone photoreceptors of a transgenic mouse retina. It outlines the steps for preparing retinal slices, imaging FRET-based calcium biosensors, and analyzing fluorescence changes to quantify calcium levels under background illumination and light stimulation.

Two-Photon Microscopy for Monitoring Calcium Dynamics in Mouse Retinal Cone Photoreceptors

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Hier presenteren we het nut van longitudinale in vivo imaging in de follow-up van de morfologische veranderingen van laser-geïnduceerde choroidal neovascularization in muizen.

In Vivo Multimodale beeldvorming en analyse van Laser-geïnduceerde Choroidal Neovascularization muismodel

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Hier presenteren we een protocol om de getransplanteerde linkerlong van de muis intravitaal in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie. Dit is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamiek en interacties in real-time na longtransplantatie bij muizen.

Intravitale twee-fotonmicroscopie van de getransplanteerde muizenlong

Leer in vivo beeldvorming van het muizennetvlies met twee-fotonenmicroscopie voor onderzoek naar oogziekten en normale retinafunctie. Deze methode biedt hoge resolutie en reproduceerbare resultaten.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Meer video's verkennen