Name: Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Lernen Sie die transpupillare Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut bei Mäusen für Neurowissenschaften und Ophthalmologie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Untersuchungen retinaler Ganglienzellen und Krankheitsmechanismen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award an P.R.W. und ein uneingeschränkter Zuschuss an die Abteilung für Augenheilkunde und visuelle Wissenschaften an der Washington University School of Medicine in St. Louis), National Glaucoma Research (ein Programm der BrightFocus Foundation) und das McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology unterstützt. Z.W. wird durch einen Institutional National Research Service Award T32 EY013360 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch vom Hope Center Viral Vectors Core an der Washington University School of Medicine unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hierin beschriebene Zwei-Photonen-Bildgebungsverfahren ermöglicht longitudinale In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus. Wiederholbare Bilder derselben Netzhautregion können für einen kontinuierlichen Zeitraum von bis zu 6 oder mehr h unter Isofluran erhalten werden. Die Maus kann auch an verschiedenen Tagen mit zellulären und vaskulären Orientierungspunkten abgebildet werden, um denselben Bildgebungsbereich zu lokalisieren (Abbildung 3). Die Verwendung einer klaren Gelimmersion in Kombination mit Deckglas für diesen Zweck wurde zuvor auf eine Reihe von Verfahren angewendet, darunter die Visualisierung der Netzhaut für die subretinale Injektion, laserinduzierte Netzhautverletzungsmodelle und Fundusbildgebung20,21,22.
Die Anatomie des Auges stellt die In-vivo-Bildgebung vor einzigartige Herausforderungen, da die hohe optische Leistung der Maushornhaut und -linse die direkte Abbildung durch die Pupille ohne Korrektur behindert. Mehrere andere In-vivo-Bildgebungsverfahren beruhen auf der Verwendung einer plankonkaven Kontaktlinse zur Korrektur der vorderen Optik des Mausauges 7,17,18,19. Mit nur optischer Korrektur an der Hornhaut führt die hohe optische Leistung der Mauslinse zu einer unvermeidlichen Menge an Parallaxe, insbesondere von Strukturen im peripheren Scanfeld, die sich als Dehnungs- und Translationsbewegung in der X-Y-Dimension auf verschiedenen Z-Ebenen manifestiert. Um bildparallaxenbedingte Verzerrungen in X- und Y-Dimensionen zu minimieren, ist es entscheidend, dass das Mausauge so ausgerichtet ist, dass die Tangentialebene zur Netzhaut im Bildgebungsbereich senkrecht zum Lichtweg des Mikroskops steht. Der hier beschriebene Aufbau ist förderlich für eine präzise Manipulation des Augenwinkels, um diese Ausrichtung zu erreichen. Ein verstellbarer Mauskopfhalter, der eine Drehung entlang zweier Achsen ermöglicht, ermöglicht eine einfache manuelle Einstellung des Augenwinkels, während der Experimentator durch die Z-Dimension scrollt, um die Parallaxe zu minimieren. Diese Neigung umgeht auch den Feldstoppeffekt der Pupille, um größere Bereiche der Netzhaut abbilden zu können. Die Zurückhaltung des Kopfhalters reduziert auch Bewegungsartefakte, die durch die Atmung verursacht werden, erheblich.
Es muss darauf geachtet werden, dass die Klarheit des Mausauges erhalten bleibt, da sich die Bildqualität mit der Trübung während der kontinuierlichen Bildgebung verschlechtert. Häufiges erneutes Auftragen von Gleitgel während der Bildgebung und Salbenauftrag nach jeder Bildgebungssitzung helfen, das Auge vor dem Austrocknen und der Entwicklung von Trübungen zu schützen. Einige Hornhauttrübungen lösen sich nach 24-48 h spontan auf. Die Verwendung von klarem Gel und Deckglas, wie in diesem Protokoll beschrieben, bietet eine ähnliche Bildqualität und Aberrationskorrektur wie eine Kontaktlinse7 und ermöglicht gleichzeitig einfachere Anpassungen des Augenwinkels, ohne dass das Deckglas neu ausgerichtet werden muss. Darüber hinaus versorgt das Gel das Auge kontinuierlich mit Feuchtigkeit, so dass akute Bildgebungssitzungen von bis zu mehreren Stunden durchgeführt werden können. Da das Deckglas die Hornhaut nicht berührt, verursacht es eine minimale Reizung des Auges, die die optische Klarheit bei wiederholten Bildgebungssitzungen beeinträchtigen kann.
Eine Einschränkung dieses Ansatzes ist die Tatsache, dass optische Aberrationen nicht vollständig korrigiert werden. Während dies die axiale Auflösung aufgrund der schweren Parallaxe stark verringert, können quantitative Messungen des Somas in Einzelbildebenen durchgeführt werden. Es sollte beachtet werden, dass, da die Fluoreszenzsignalintensität von retinalen Neuronen von der Probenausrichtung mit dieser Methode abhängt, Anregungs- und Emissionsratiometrie-basierte Sensoren besser für Experimente geeignet sind, bei denen Proben chronisch über verschiedene Bildgebungssitzungen hinweg verglichen werden. Ein Ansatz zur Korrektur optischer Aberrationen auf Systemebene ist die adaptive Optik, die eine subzelluläre Auflösung in der Netzhautermöglicht 8,9,14,21. Die adaptive Optik erfordert jedoch hochspezialisierte Geräte und umfangreiches Know-how.
Alternative Ansätze zur Zwei-Photonen-in-vivo-Netzhautbildgebung sind die konfokale Mikroskopie oder die Ophthalmoskopie6. Der hier vorgestellte Ansatz sollte leicht auf Weitfeld- oder Konfokalmikroskopie übertragbar sein. Die Einzelphotonen-Bildgebung ist möglicherweise robuster und birgt ein geringeres Risiko, die Netzhaut aufgrund der hohen Energie des Zwei-Photonen-Lasers zu schädigen, der erforderlich ist, um einen effizienten Zwei-Photonen-Effekt durch die Hornhaut und die Augenlinse zu erzielen. Um Zwei-Photonen-Laserschäden zu vermeiden, sollte die Schwelle für die maximale Laserleistung empirisch bestimmt werden, indem die gesamte Netzhaut nach Abschluss der bildgebenden Experimente untersucht und Zelltypen in den abgebildeten Schichten immungefärbt werden. In dem hier vorgestellten System wurden RGCs mit dem Pan-RGC-Marker, Rbpms, markiert, und die Dichten waren bis zu 45 mW Abbildungsleistung normal, während 55 mW einen signifikanten Verlust von RGCs verursachten (nicht gezeigt).
Ein Nachteil der Einzelphotonen-Bildgebung ist die Tatsache, dass dieser Ansatz die nativen visuellen Schaltkreise der Netzhaut im Vergleich zur Zwei-Photonen-Bildgebung sehr stark stimuliert23. Frühere Experimente mit Netzhaut-Wholemounts oder Augenmuschelpräparaten haben gezeigt, dass Zwei-Photonen-Laserscanning eine Schaltkreisaktivierung hervorruft, die weitgehend transient ist24. Hier zeigt die Abbildung der RGC-Aktivität mit dem Ca 2+ Sensor Twitch2b, dass der Beginn des Laserscans Ca 2+ Erhöhungen induziert, die bei den meisten RGCs im Laufe von5-20 s zum Ausgangswert zurückkehren (Abbildung 8). Da die Laserleistung in diesem Protokoll im Bereich früherer Experimente liegt, die eine in vivo retinale Lichtantwort 8berichteten, ist die derzeit beschriebene Methode wahrscheinlich für Aufzeichnungen der Schaltungsaktivität in der Netzhaut geeignet. Solche Überlegungen sind wichtig für Experimente, die durch Schaltungsaktivität beeinflusst werden können.
Dieses Protokoll demonstriert die In-vivo-Bildgebung von zwei Arten von Netzhautneuronen, RGCs und Amakrinzellen. Eine ähnliche Markierung anderer wichtiger Zelltypen kann erreicht werden, einschließlich horizontaler Zellen (Cx57-Cre 25), bipolarer Zellen (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), Zapfenphotorezeptoren (S- oder M-opsin-Cre 28), Stäbchen-Photorezeptoren (Nrl-Cre 29), Müller-Glia (Foxg1-Cre 26) und Perizyten (NG2-DsRed9). Transgene Mäuse sind auch verfügbar, um diskrete Untergruppen von RGCs zu markieren (z. B. KCNG4-Cre für αRGCs30; OPN4-Cre für ipRGCs31; JAM-B-CreER für J-RGCs 32) und Amakrinzellen (z.B. ChAT-Cre für Starburst-Amakrinzellen26 und Neuropeptid-Promotortreiber für verschiedene Amakrinzell-Subtypen 3,34). Virale Vektoren können verwendet werden, um spezifische Zellpopulationen anstelle von transgenen Mäusen anzugreifen. Intravitreale Injektionen von AAV2 mit einem ubiquitären CAG-Promotorelement markieren fast ausschließlich RGCs, Amakrinzellen und horizontale Zellen25. Die Kombination des modifizierten AAV2.7m8-Y444F-Kapsids mit einem konstruierten mGluR6-Promotorkonstrukt ermöglicht eine breite Markierung von ON-Bipolarzellen35. Subretinale Injektionen von AAV führen zu einer Anreicherung der Photorezeptoren, wobei der Serotyp AAV2/5 die höchste Transduktionseffizienz aufweist36. Shh10, ein modifiziertes AAV6-Kapsidprotein, gepaart mit glialen fibrillären sauren Proteinpromotorelementen, wurde spezifisch für Müller-Glia37 nachgewiesen.
Die Fähigkeit, Zellen im zentralen Nervensystem mit einem vollständig nicht-invasiven Ansatz zu beobachten, kann genutzt werden, um sowohl grundlegende Eigenschaften neuronaler Schaltkreise8 als auch Mechanismen der Neurodegeneration 3,4,5,6,38 zu untersuchen. Viele Erblindungskrankheiten zielen auf zelluläre Populationen in der Netzhaut ab, und In-vivo-Bildgebungsansätze bei Mäusen wurden verwendet, um Sehnervenverletzungen 1,3,4, Makuladegeneration13, Schlaganfall5, Glaukom 2,6 und Uveitis7 zu untersuchen. Darüber hinaus manifestieren sich viele neurodegenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems in der Netzhaut, darunter Alzheimer-Krankheit39, Multiple Sklerose40 und Parkinson-Krankheit41. Daher kann diese leicht zugängliche Technik für die In-vivo-Bildgebung der Netzhaut als Werkzeug zur Untersuchung einer breiten Palette neurodegenerativer Erkrankungen eingesetzt werden.

Die In-vivo-Visualisierung des zentralen Nervensystems erfordert in der Regel invasive Verfahren wie Schädelverdünnung und Installation von Glasfenstern oder optischen Relaislinsen. Die Netzhaut ist die einzige Struktur im Nervensystem, die ohne invasive Vorbereitung direkt beobachtet werden kann, da sie von Natur aus Licht aus der Umgebung empfängt. Der leichte optische Zugang zur Netzhaut macht sie zu einem attraktiven Modellsystem für die Untersuchung des zentralen Nervensystems.
Live-Fluoreszenzbildgebung der Netzhaut bei Mäusen wurde verwendet, um den RGC-Tod in Modellen von Glaukom 1,2, Sehnervverletzung 1,3,4 und Schlaganfall5 sowie Veränderungen der Mikrogliaaktivierung 6,7,8 und des Gefäßsystems 9 bei degenerativen Erkrankungen zu verfolgen. Intrinsische Signale können auch verwendet werden, um Photorezeptoren 10,11,12 und retinale Pigmentepithelzellen 13 sichtbar zu machen. Viele Ansätze zur In-vivo-Bildgebung der Netzhaut verwenden entweder hochspezialisierte Geräte, die speziell für ophthalmologische Zwecke entwickelt wurden6 oder stark modifizierte optische Systeme zur Korrektur der nativen Aberrationen der Hornhaut und der Linse 8,9,11,12,13,14.
Das vorliegende Protokoll zeigt einen Ansatz zur In-vivo-Bildgebung von fluoreszierenden Signalen in der Netzhaut mit zellulärer Auflösung, wobei eine grundlegende Methode zur teilweisen Korrektur der vorderen Optik des Mausauges verwendet wird. Diese Strategie erfordert sehr geringfügige Anpassungen an Multiphotonenmikroskop-Setups, die üblicherweise für die In-vivo-Bildgebung des Gehirns verwendet werden. Da dieser Ansatz einfach einzurichten ist und die Mäuse wenig Stress haben, ist es förderlich, Zeitrafferexperimente sowohl über akute als auch über chronische Zeiträume durchzuführen. Darüber hinaus sind genetische und organische Farbstoff-basierte Verfahren, die einzelne Netzhautkomponenten, einschließlich RGCs, Amakrinzellen, Mikroglia und Gefäße, markieren, mit dieser bildgebenden Technik kompatibel und ermöglichen die In-vivo-Beobachtung von Zelltypen und Strukturen, die für die Netzhautfunktion entscheidend sind. Diese Werkzeuge können angepasst werden, um die meisten anderen neuronalen Zelltypen sowie gliale und vaskuläre Komponenten der Netzhaut zu markieren.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Deckglas</td><td>ThermoFisher</td><td>152440</td><td>Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm</td></tr><tr><td>50 mL Glasspritze</td><td>Hamilton</td><td>80950</td><td>22G zementierte Nadel</td></tr><tr><td>Adeno-assoziiertes Virus (AAV2)</td><td>Hope Center Viral Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesie Luftpumpe</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-30</td><td></td></tr><tr><td>Atropin</td><td>Sigma</td><td>A0132</td><td>Für Schüler Dilatatorlösung</td></tr><tr><td>Basic Anästhesiegerät für Kleintiere</td><td>RWD Life Science</td><td>R500IE</td><td></td></tr><tr><td>Kapillare aus Borosilikatglas</td><td>Sutter</td><td>B150-86-10</td><td>Außendurchmesser 1,50 mm, Innendurchmesser 0,86 mm, Länge 10 cm</td></tr><tr><td>CFP/YFP Filterwürfel</td><td>Chroma</td><td>custom</td><td>480/40, 505 Long Pass, 535/30</td></tr><tr><td>ChromoFlex - Zweikanalige PMT-Detektionseinheit</td><td>Scientifica</td><td>S-MPLG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Umwälz-Wärmepumpe</td><td>Braintree Scientific</td><td>tp-700</td><td>Set auf 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Frischhaltefolie</td><td>VWR</td><td>10713-916</td><td></td></tr><tr><td>Kompakter Filterhalter</td><td>ThorLabs</td><td>DH1</td><td>Hält Deckglas über dem Mausauge</td></tr><tr><td>Cx3cr1-GFP transgene Mäuse (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>005582 DAQ-Controller-Gehäuse</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>PXIe-1073</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungsgerät</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090A</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue Farbstoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1677409 FPGA-Modul</td><td></td></tr><tr><td>mit Digitizer</td><td>National Instruments</td><td>NI-5734</td><td></td></tr><tr><td>Gasevakuierungsgerät</td><td>RWD Life Science</td><td>R546W</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal Starkes Gleitgel für Augen... &nbsp;</td><td>Alcon</td> <td>(aus der örtlichen Apotheke)</td><td>Zur Verwendung bei der Bildgebung</td></tr><tr><td>GFP/Rot Filterwürfel</td><td>Chroma</td><td>custom</td><td>535/30, 560 Long Pass, 605/70</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>McKesson Medical and Surgical</td><td>190147</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Launch Optics zur Verwendung mit Pockels Cell</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-101080</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Hauptmodul</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-100466</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Scan Path</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-100406</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope X Galvo Module</td><td>Scientifica</td><td>MP-100443</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Fiji Software</td><td></td><td>Freeware</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Gasfilterbehälter (aktive Spülung)</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-31</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Gasfilterbehälter (passives Scavenging)</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-31S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin HCl (100 mg/ml)</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>M32 auf M26 Adapter</td><td>ThorLabs</td><td>M32M26S</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai GUI Software</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Software</td><td>MathWorks</td><td>NA</td><td>R2015b</td></tr><tr><td>meloxicam (5 mg/ml)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>NDC 0010-6013-01</td><td>Analgetikum</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Objektiv Edmund Optics</td><td>46-404</td><td>Mitutoyo WE715042319</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter</td><td>Flaming/Braun Modell P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Fisher</td><td>BP2629-1</td><td></td></tr><tr><td>Mini Bulldog hämostatische Klemme</td><td>Fine Science Tools</td><td>18053-28</td><td></td></tr><tr><td>Miniatur EVA Schlauch 0.02" ID, 0.06" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>1883T1</td><td></td></tr><tr><td>Miniatur EVA Schlauch 0.05" ID, 0.09" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>1883T4</td><td></td></tr><tr><td>Mauskopf Halter</td><td>Narishige</td><td>SGM-4</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Optikpfosten 1/2"</td> <td>ThorLabs</td><td>TR3-P5</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Leistungsmessgerät</td><td>Kit ThorLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>pE-300 Ultra LLG Deivery</td><td>Scientifica</td><td>COO-LED3ULLGs</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrin hydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>P6126</td><td>Für Pupillendilatator Lösung</td></tr><tr><td>Pockels Zelle</td><td>Conoptics</td><td>350-80-02</td><td></td></tr><tr><td>Pockels Cell Verstärker</td><td>Conoptics</td><td>Modell 302RM</td><td></td></tr><tr><td>Proparacainhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>1571001</td><td>Zur Ruhigstellung der Augen</td></tr><tr><td>Rot & Far Red Kurzpassfilter Cube</td><td>Chroma</td><td>Custom</td><td>560 Kurzpass</td></tr><tr><td>Rotierende 1/2" Pfostenklemme</td><td>ThorLabs</td><td>SWC</td><td></td></tr><tr><td>ScanImage Paket</td><td>Vidrio Technologies</td><td>Freeware</td><td>Bilderfassungssoftware; Version 5.4.0 (2018); erfordert MATLAB</td></tr><tr><td>Natriumchloridlösung, steril (0,9%)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>NDC 63323-186-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>S9 E</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Oxford</td><td>Benchmate C8</td><td></td></tr><tr><td>Terramycin Oxytetracyclin/Polymyxin B Antibiotikum Augensalbe</td><td>Zoetisus</td><td>NA</td> Zur <td>Anwendung nach intravitrealer Injektion</td></tr><tr><td>ThermoRack</td><td>Kühlsystem Festkörperkühlsysteme</td><td>ThermoRack 401</td><td>Set auf 20 > C</td></tr><tr><td>Ultrafast Ti:Sapphire Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>Vgat-Cre transgene Mäuse (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>016962</td><td></td></tr><tr><td>VGlut2-Cre transgene Mäuse (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>016963</td><td></td></tr><tr><td>VivoScope for In Vivo Imaging</td><td>Scientifica</td><td>S-MPVS-1200-00P</td><td></td></tr><tr><td>Weißes Vaseline-Mineralöl Gleitmittel Augensalbe</td><td>Stye</td><td>NA</td><td>Zur Anwendung nach der Bildgebung</td></tr><tr><td>von Xylazin HCl (20 mg/ml)</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

transpupille zwei-photonen-in-vivo-bildgebung der netzhaut der maus

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Die Netzhaut wandelt Lichtsignale aus der Umgebung in elektrische Signale um, die an das Gehirn weitergegeben werden. Erkrankungen der Netzhaut sind weit verbreitet und verursachen Sehstörungen und Erblindung. Zu verstehen, wie solche Krankheiten fortschreiten, ist entscheidend für die Formulierung neuer Behandlungen. Die In-vivo-Mikroskopie in Tiermodellen von Krankheiten ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis der Neurodegeneration und hat zu wichtigen Fortschritten bei der Behandlung von Erkrankungen geführt, die von der Alzheimer-Krankheit bis zum Schlaganfall reichen. Da die Netzhaut die einzige Struktur des zentralen Nervensystems ist, die von Natur aus durch optische Ansätze zugänglich ist, eignet sie sich natürlich für die In-vivo-Bildgebung. Die native Optik der Linse und der Hornhaut stellt jedoch einige Herausforderungen für einen effektiven Bildzugang dar.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden für die In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung von zellulären Kohorten und Strukturen in der Netzhaut der Maus mit zellulärer Auflösung, die sowohl für akute als auch für chronisch andauernde Bildgebungsexperimente anwendbar sind. Es präsentiert Beispiele für retinale Ganglienzellen (RGC), Amakrinzellen, Mikroglia und vaskuläre Bildgebung unter Verwendung einer Reihe von Markierungstechniken, einschließlich Adeno-assoziierter Virusvektoren (AAV), transgener Mäuse und anorganischer Farbstoffe. Wichtig ist, dass sich diese Techniken auf alle Zelltypen der Netzhaut erstrecken und vorgeschlagene Methoden für den Zugang zu anderen Zellpopulationen von Interesse beschrieben werden. Ebenfalls detailliert sind Beispielstrategien für die manuelle Bildnachbearbeitung zur Darstellung und Quantifizierung. Diese Techniken sind direkt anwendbar auf Studien der Netzhautfunktion bei Gesundheit und Krankheit.

Verschiedene transgene, virale Vektor- oder anorganische Farbstoffmarkierungsansätze können verwendet werden, um mehrere Netzhautzelltypen und -strukturen in vivo mit einer einfachen Anpassung eines einfachen Multiphotonenmikroskops spezifisch zu visualisieren. Um RGCs und Amakrinzellen sichtbar zu machen, erhielten VGlut2-Cre- bzw. VGat-Cre-transgene Mäuse eine intravitreale Injektion eines Cre-abhängigen AAV-Expressionskonstrukts, das für Twitch2b kodiert, einen zytoplasmatischen Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-basierten Ca 2+-Sensor, der cyan- und gelb fluoreszierende Proteine (CFP bzw. YFP) und die Ca2+-Bindungsdomäne von Troponin15 enthält. . Bei VGlut2-Cre-Mäusen sind RGC-Somas deutlich erkennbar, und Faszikel von Axonen sind oft sichtbar (Abbildung 3).
Es sollte beachtet werden, dass die Flugbahn der Axone und das negative Bild des Gefäßsystems es sehr einfach machen, den Sehnervenkopf in VGlut2-Cre-Mäusen zu identifizieren, was als Meilenstein in chronischen bildgebenden Experimenten nützlich ist (Abbildung 3). Obwohl Amakrinzellen weniger hell erscheinen als RGCs, möglicherweise aufgrund ihrer kleineren Somagröße und / oder weniger effizienten AAV-Transduktion, sind ihre Somas in der inneren Kernschicht immer noch leicht sichtbar. Im Gegensatz zu RGCs werden Amakrinzellneurite häufiger in den inneren plexiformen Schichten beobachtet (Abbildung 4). Retinale Mikroglia können in der transgenen Cx3cr1-GFP-Mauslinie6 abgebildet werden. Mikroglia assoziieren mit dem Gefäßsystem und ermöglichen es, die gleiche Region in Zeitraffer-Bildgebungsexperimenten zu finden.
Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die Dynamik von feinen Mikroglia-Prozessen zu verfolgen, ein Verfahren, das eine bessere räumliche Auflösung in Einzelebenenbildern aufweist, oder wenn Projektionen mit maximaler Intensität mit Fokus auf einzelne Zellen erstellt werden (Abbildung 5). Die schlechte axiale Auflösung durch optische Aberration durch die Mauslinse schließt die Untersuchung feiner Details in der z-Dimension aus. Um festzustellen, ob diese bildgebende Technik degenerative Veränderungen in der zellulären Ultrastruktur beobachten kann, wurde 1 μL 50 mM N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) in den Glaskörper injiziert, um exzitotoxische Läsionen zu induzieren. Einen Tag nach der Injektion zeigten die Mikroglia kurze Prozesse oder eine amöboide Morphologie (Abbildung 5) gemäß früheren Berichten16. Es sollte beachtet werden, dass Zellen in der transgenen Linie Cx3cr1-GFP eine gleichmäßigere und vollständigere fluoreszierende Proteinexpression über die zelluläre Kohorte aufwiesen als in Experimenten mit AAV-vermittelter Abgabe von fluoreszierenden Proteinexpressionskassetten. Die Vorteile einer abwechslungsreichen und spärlichen gegenüber einer vollständigen und einheitlichen Kennzeichnung sollten bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden.
Um das retinale Gefäßsystem wie zuvor beschrieben zu markieren8, wurden Mäusen 30-60 min vor der Bildgebung intraperitoneal 200 μL Evansblau-Farbstoff (20 mg/ml in steriler Kochsalzlösung) injiziert. Dies führte zu einer starken Markierung von Blutgefäßen, die vom Sehnervenkopf ausgingen (Abbildung 6). Überraschenderweise hielt das fluoreszierende Signal einer einzelnen Injektion mindestens sieben Tage lang an. Es wurden zwei verschiedene Methoden verwendet, um die Abmessungen der In-vivo-Bilder zu schätzen. Zunächst wurden die gleichen Netzhautregionen in vivo und nach Fixierung in abgeflachten retinalen Wholemounts mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet (Abbildung 7). Zufällige Zellpaare wurden aus vier verschiedenen In-vivo-Proben ausgewählt, und der wahre Abstand zwischen Zellpaaren wurde in konfokalen Scans gemessen und mit dem In-vivo-Pixelabstand abgeglichen, um eine durchschnittliche Pixelgröße von 0,99 μm mit 1-facher digitaler Vergrößerung zu erhalten. Die Verwendung ähnlicher Methoden zur Korrelation von In-vivo-Bildern mit konfokalen Wholemount-Scans hat gezeigt, dass eine einzelne Kopfposition eine Bildgebung über ein etwa 650 mm2 großes Netzhautfeld ermöglicht.
Die Neupositionierung des Kopfhalters entlang einer Torsionsachse kann den Zugang zu einem linearen Bereich der Netzhaut von 2,2 mm Länge ermöglichen (nicht dargestellt). Weiterhin wurden fluoreszierende Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 1 oder 2 μm in die Augen von Mäusen injiziert und ihr Durchmesser wurde als halbes Maximum von Zeilenscans in voller Breite von In-vivo-Bildern mit 10-fachem Digitalzoom gemessen. Dies ergab eine etwas größere Pixelgrößenschätzung, jedoch mit mehr Varianz (Abbildung 7). Insgesamt ist die konfokale Bildgebung ganzer Proben nach Abschluss von In-vivo-Experimenten die konsistenteste Methode, um einzelnen Bildern einen Maßstab zuzuweisen, da Varianzen in Hornhaut- und Linseneigenschaften den Bildmaßstab von Probe zu Probe verändern können.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Lichtpfadschema. Die grundlegenden Komponenten des in diesem Protokoll verwendeten Zwei-Photonen-Mikroskops bestehen aus einer Pockels-Zelle zur Modulation der Laserleistung, einem Linsenpaar, um den Laserstrahldurchmesser an die hintere Öffnung des Mikroskopobjektivs anzupassen, und einem Paar Galvo-Scan-Spiegeln für die Strahllenkung. Vor jeder wichtigen optischen Komponente befindet sich ein Paar Lenkspiegel. Der Fokus wird von einem Motor gesteuert, der die Objektivhalterung antreibt. Der Emissionslichtpfad kann für verschiedene Fluorophore angepasst werden, indem dichroitische Filter und Barrierefilter ausgetauscht werden. Es wird ein allgemeiner Aufbau für die Cyan/Gelb/Rot-Bildgebung angezeigt, bei dem ein dichroitischer Kurzpassspiegel rotes Licht auf das erste PMT lenkt und ein dichroitischer Langpassspiegel gepaart mit geeigneten Bandpassfiltern verwendet wird, um cyanfarbene und gelbe Emissionen zu trennen. Abkürzung: PMT = Photomultiplierröhre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Positionierung von Mäusen für die In-vivo-Bildgebung. Um die Maus mit der Pupille auf der Achse mit dem Lichtpfad zu positionieren, wird die betäubte Maus zuerst in einem Kopfhalter festgehalten, der Kopf gedreht und abgewinkelt, ein großer Tropfen Gleitgel wird auf das Auge gelegt und die Maus wird auf die Bühne gelegt. Ein Deckglas wird senkrecht zum Lichtweg in den Deckglashalter montiert und zum Auge hin abgesenkt. Das Deckglas sollte die Hornhaut oder den Mauskopf (links) nicht berühren, was offensichtlich ist, wenn das Deckglas abgelenkt wird. Das Deckglas sollte jedoch auch nahe genug sein, um eine Taille des Tröpfchens zu vermeiden (rechts), da dies eine devergrößernde Wirkung auf die Probe hat. Nach dem Auftragen des Gel-Eintauchens und dem Sichern des Deckglases sollte der Tisch direkt unter dem Mikroskopobjektiv bewegt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3.jpg"> Abbildung 3: Bildgebende retinale Ganglienzellen. Für die Bildanzeige werden Projektionen mit maximaler Intensität mit den Z-Ebenen erstellt, die Zellen von Interesse enthalten, und resultierende Bilder werden mediangefiltert, um PMT-Schussrauschen zu entfernen. Zwei Beispiele für retinale Ganglienzellen, die durch Injektion von AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in transgene VGlut2-Cre-Mäuse markiert wurden, sind gezeigt, insbesondere das CFP-Signal. Die Bilder wurden in Sitzungen im Abstand von vier Tagen aufgenommen, und vaskuläre Landmarken wurden verwendet, um in die gleiche Region in der Nähe des Sehnervenkopfes zurückzukehren. Der Sehnervenkopf ist zum unteren Bildrand ausgerichtet. Obwohl beide Stichproben eine gewisse Varianz in der Orientierung aufweisen (Regionen mit verminderter Intensität sind mit Pfeilen gekennzeichnet), sind die meisten Zellen zu beiden Zeitpunkten vorhanden. Maßstabsbalken = ca. 50 μm. Abkürzungen: PMT = Photomultiplierröhre; AAV = Adeno-assoziiertes Virus; EF1α = Dehnungsfaktor-1alpha; FLEX = Flip-Exzision; VGlut2 = vesikulärer Glutamattransporter 2; CFP = Cyan fluoreszierendes Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2.jpg"> Abbildung 4: Bildgebende Amakrinzellen. Amakrine Zellen wurden markiert, indem AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in transgene VGat-Cre-Mäuse injiziert wurde. Das CFP-Signal von Twitch 2b wird speziell gezeigt. Kleine Projektionen mit maximaler Intensität, die sich auf die Tiefen der inneren Kernschicht konzentrieren, deuten auf Amakrinzellsoma hin, während die Fokussierung auf die innere Plexiform Amakrinzellneuriten auflöst (Pfeil). Der Sehnervenkopf ist nach rechts im Bild ausgerichtet. Maßstabsbalken = ca. 50 μm. Abkürzungen: AAV = adeno-associated virus; EF1α = Dehnungsfaktor-1alpha; FLEX = Flip-Exzision; VGat = vesikulärer Gamma-Aminobuttersäuretransporter; CFP = Cyan fluoreszierendes Protein; INL = innere Kernschicht; IPL = innere plexiforme Schicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2.jpg"> Abbildung 5: Bildgebende Mikroglia. Zur Markierung von Mikroglia wurde die transgene Mauslinie Cx3cr1-GFP verwendet. Eine maximale Projektion des gesamten Scanvolumens zeigt viele Mikroglia, einige mit feinen Prozessdetails, die aufgelöst werden können. Beachten Sie, dass Zellen in der unteren linken Ecke des Feldes aufgrund der Parallaxe in diesem Bereich eine geringere Verzerrung in der maximalen Projektion aufweisen als die Zellen in der oberen rechten Seite. Projektionen mit maximaler Intensität, die nur die interessierende Zelle enthalten, reduzieren diese Parallaxe signifikant (Mitte, in entsprechenden Farben eingerahmt). Darüber hinaus kann diese Bildgebungsstrategie die Dynamik des feinen Mikroglia-Prozessumbaus dokumentieren (untere Tafeln). Im Vergleich dazu sind viele Mikroglia mit kurzen Fortsätzen oder amöboider Morphologie einen Tag nach einer exzitotoxischen Läsion durch intravitreale Injektion von 50 mM NMDA zu sehen (rechts). Maßstabsbalken = ca. 50 μm. Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; Cx3cr1 = Cx3-Chemokinrezeptor 1; NMDA = N-Methyl-D-aspartat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2.jpg"> Abbildung 6: Kennzeichnung vaskulärer Orientierungspunkte. Mäusen wurden 30-60 min vor der ersten Bildgebungssitzung 200 μL 20 mg/ml Evansblau intraperitoneal injiziert. Projektionen mit maximaler Intensität in voller Dicke zeigen eine dauerhafte Fluoreszenz im retinalen Gefäßsystem, die mindestens sieben Tage anhielt. Maßstabsbalken = ca. 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2.jpg"> Abbildung 7: Bildabmessungen. Retinale Ganglienzellen, die durch Injektion von AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in transgene VGlut2-Cre-Mäuse markiert wurden, wurden in vivo abgebildet, und die gleiche Region wurde dann durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie nach Fixierung und ganzer Vorbereitung der Netzhaut abgebildet. Für beide ist ein gelb fluoreszierender Proteinkanal dargestellt. Farbige Pfeilpaare zeigen in beiden Präparaten die gleiche Zelle an (obere Felder). Einzelebenenbild von fluoreszierenden Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 2 μm, intravital injiziert und in vivo abgebildet (unteres linkes Bild). Mikrosphären setzten sich nicht ab und waren daher in ständiger Bewegung, was eine Messung der axialen Auflösung unmöglich machte. Pixelgrößen, berechnet aus Halbmaximalmessungen in voller Breite von in vivo fluoreszierenden Mikrosphären oder korrelativen konfokalen Messungen von 2-4 Netzhäuten pro Gruppe (unten rechts). Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: AAV = adeno-associated virus; EF1α = Dehnungsfaktor-1alpha; FLEX = Flip-Exzision; VGlut2 = vesikulärer Glutamattransporter 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2.jpg"> Abbildung 8: Calciumaktivität induziert durch Zwei-Photonen-Scanning. Retinale Ganglienzellen, markiert durch Injektion von AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in VGlut2-Cre transgene Mäuse, YFP ist pseudofarbig magenta und CFP grün, abgebildet in einer einzigen Ebene als Zeitreihe bei 4,22 Hz. Alle RGCs hatten ein ähnliches YFP/CFP-Ausgangsverhältnis. Die meisten antworteten mit einem Anstieg des FRET-Verhältnisses (ohne die orange Zelle), und man behielt während der gesamten Zeitreihe ein hohes YFP/CFP-Verhältnis bei (gelbe Zelle). Die YFP/CFP-Verhältnisse wurden auf den ersten Bilddurchschnitt normalisiert, und farbige Kreise stimmen mit farbigen Spuren überein. Sternchen zeigen Zeitpunkte mit repräsentativen Bildern auf der linken Seite an. Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzungen: AAV = adeno-associated virus; EF1α = Dehnungsfaktor-1alpha; FLEX = Flip-Exzision; VGlut2 = vesikulärer Glutamattransporter 2; YFP = gelb fluoreszierendes Protein; CFP = Cyan fluoreszierendes Protein; RGCs = retinale Ganglienzellen; FRET = Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Diese Methode der in vivo Bildgebung von Netzhautzellen ermöglicht die Untersuchung ophthalmologischer Erkrankungen und das Verständnis normaler Funktionen der Netzhaut. Diese Methode bietet einen einfachen und hochreproduzierbaren Ansatz zur In-vivo-Bildgebung der Netzhaut durch Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die richtige Stabilisierung der Maus ist der Schlüssel zur Erzielung qualitativ hochwertiger In-vivo-Bilder.Üben Sie, die Maus in den Kopfhalter einzustellen, und machen Sie sich mit dem Vorgang vertraut, bevor Sie versuchen, Bilder aufzunehmen. Seedieren Sie das Tier gemäß dem genehmigten Tierverwendungsprotokoll. Tragen Sie eine Pupillenerweiterungslösung auf und lassen Sie die Maus fünf Minuten lang im Dunkeln, damit sich die Pupillen erweitern können.Befestigen Sie den unteren Gehörgangsstift in der nach innen ausgestreckten Position und den oberen Gehörgangsstift in der zurückgezogenen Position. Drehen Sie den Hauptarm des Kopfhalters, bis die Ohrmuschelleiste in einem 60-Grad-Winkel unter der Horizontalen geneigt ist. Wenn die Maus zum Bissbalken zeigt, montieren Sie ein Ohr auf den verlängerten unteren Stift, wobei der Stift in den Gehörgang eingeführt wird.Nachdem Sie die Schraube gelöst haben, die den oberen Gehörgangsstift sichert, verlängern Sie den Stift in den anderen Gehörgang und ziehen Sie die Schraube wieder fest, um den Kopf zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die Maus sicher in der Kopfhalterung sitzt. Drücken Sie auf die Oberseite des Kopfes.Die Maus sollte sicher in den Ohrstäben bleiben und ihr Kopf sollte sich frei um die Achse der Gehörgänge drehen. Wenn die Bissstange in Richtung des Mauskopfes positioniert ist, heben Sie den Kopf der Maus vorsichtig an, damit die Oberkieferschneidezähne in den Bissleistenhalter abgesenkt werden können, und ziehen Sie die Bissstange mit sanfter Kraft zurück, um den Kopf zu sichern. Verwenden Sie die Schraube, um die Bissstange in Position zu bringen, und legen Sie Maus und Halter auf den Mikroskoptisch.Gleitmittel-Augentropfen auf beide Augen der Maus auftragen. Drehen Sie den Hauptarm des Kopfhalters, bis die Pupille eines Auges in Übereinstimmung mit dem Lichtpfad ausgerichtet ist, und legen Sie ein Deckglas der Nummer 1,5 in den kompakten Filterhalter. Nachdem Sie den Halter am Mikroskoptisch befestigt haben, senken Sie das Deckglas ab, bis es das schmierende Augengel berührt, ohne die Hornhaut zu berühren, und stellen Sie den Tisch in der X-Y-Dimension und der objektiven Z-Position ein, bis das Weitfeld-Anregungslicht die Hornhaut vollständig bedeckt.Verwenden Sie das Okular, um die Z-Position weiter einzustellen, bis die fluoreszierenden Zellen oder Strukturen in der Netzhaut in den Fokus kommen, und erhöhen Sie den Epifluoreszenzstrahler nach Bedarf, um einzelne Zellen oder Strukturen von Interesse aufzulösen. Feinabstimmung der Netzhaut mit dem abbildenden Lichtpfad. Passen Sie den Kopfwinkel so lange an, bis beim Ändern der Fokusebene nur noch eine Ausdehnung oder Kontraktion des unscharfen Lichts auftritt, um X-Y-Verzerrungen zu minimieren.Schalten Sie dann die Epifluoreszenzbeleuchtung aus und schließen Sie den Verschluss der Beleuchtung. Befolgen Sie für die Zwei-Photonen-Bildgebung alle institutionellen Lasersicherheitsprotokolle. Schalten Sie das gesamte Umgebungslicht aus und decken Sie es ab und schalten Sie den Anregungslichtpfad zum Laser und den Emissionslichtpfad zu den PMTs.Stellen Sie in der Bilderfassungssoftware die Bildgröße auf 512 x 512 und den Bilddurchschnitt auf drei ein. Stellen Sie das Z-Stepping so ein, dass es an der Spitze des Stapels beginnt und nach unten fortschreitet, wodurch die Zwei-Photonen-Laseraktivierung der Photorezeptoren minimiert wird. Schalten Sie die PMTs ein, aktivieren Sie sie, und stellen Sie die Spannung auf 680 Volt ein.Aktivieren Sie die Bild- und Emissionsverschlüsse. Starten Sie eine Live-Bildvorschau des Zielgewebes, beginnend mit einer Laserleistung von 1%, und passen Sie die Displayhelligkeit automatisch an, um die Zellen oder Strukturen von Interesse zu visualisieren. Wenn das Zielgewebe schwach oder unklar ist, erhöhen Sie den Prozentsatz der Laserleistung, bis Strukturen sichtbar werden, ohne 45 Milliwatt zu überschreiten.Manövrieren Sie den Mikroskoptisch in X-Y-Richtung, um sich auf einen gewünschten Bildbereich zu konzentrieren, und navigieren Sie zur Z-Ebene mit den interessierenden Strukturen im Fokus. Öffnen Sie für ein chronisches Zeitrafferexperiment ein zuvor erhaltenes Bild, um es als Referenz für die interessierenden Zellen zu verwenden, und achten Sie darauf, dass der Bildwinkel im aktuellen Bild dem der vorherigen Bilder ähnelt. Navigieren Sie dann zur obersten und untersten Z-Ebene, um die Z-Grenzen des Abbildungsstapels festzulegen und das Bild zu erfassen.Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, deaktivieren Sie die PMTs und den Laserverschluss. Schalten Sie den Anregungslichtpfad auf Epifluoreszenzbeleuchtung und den Emissionslichtpfad zurück zum Okular. Beenden Sie dann die Bilderfassungssoftware, schalten Sie den Laser in der Computerschnittstelle aus und fahren Sie die Hardware in umgekehrter Startreihenfolge herunter, mit Ausnahme der ständig eingeschalteten Geräte.Am Ende der Analyse entfernen Sie die Maus aus dem Kopfhalter und verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um das Augengel vorsichtig zu entfernen. Tragen Sie dann eine Gleitmittel-Augensalbe auf beide Augen auf und legen Sie die Maus auf ein 37 Grad Celsius warmes Wärmekissen mit Überwachung bis zum vollständigen Liegen, bevor Sie die Maus in ihr Gehäuse zurückbringen. Bei VGlut-2-Cre-Mäusen sind retinale Ganglienzellsomas deutlich erkennbar und häufig Axonsaszikel erkennbar.Die Flugbahn der Axone und das negative Bild des Gefäßsystems erleichtern die Identifizierung des Sehnervenkopfes bei VGlut-2-Cre-Mäusen, was als Meilenstein in chronischen bildgebenden Experimenten nützlich ist. Im Gegensatz zu retinalen Ganglienzellen werden Amakrinzellneurite häufiger in den inneren plexiformen Schichten beobachtet. Einen Tag nach der intraokularen NMDA-Injektion zeigen retinale Mikroglia kurze Prozesse oder eine amöboide Morphologie gemäß früheren Berichten.Die Verabreichung von Evans-Blaufarbstoff über eine einzige intraperitoneale Injektion 30 bis 60 Minuten vor der Bildgebung induziert eine starke Markierung der Blutgefäße, die vom Sehnervenkopf ausgeht und mindestens sieben Tage anhält. Nach der Fixierung kann der wahre Abstand zwischen Zellpaaren innerhalb abgeflachter retinaler ganzer Montierungen in konfokalen Scans gemessen und mit In-vivo-Pixelabständen abgeglichen werden, um die durchschnittliche Pixelgröße von In-vivo-Bildern zu bestimmen. Fluoreszierende Mikrokugeln, die in die Augen von Mäusen injiziert werden, ermöglichen die Messung des Mikrokugeldurchmessers in vivo, was eine etwas größere Pixelgrößenschätzung ergibt, jedoch mit mehr Varianz.In-vivo-Bildgebung kann mit histologischen Analysen wie Immunfärbung und In-situ-Hybridisierung kombiniert werden. Diese Methoden können spezifische Zelltypen identifizieren und die Genexpression von abgebildeten Zellen untersuchen.

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Wang, Z., et al. Transpupilläre Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus.  J. Vis. Exp. (2021). Dieses Video zeigt eine Technik für die in vivo Netzhautbildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Anästhesierte Mäuse werden auf die Bildgebung vorbereitet, indem sie ihren Kopf sichern, Augenschmiermittel auftragen und ein Deckglas über das Auge legen. Retinale Ganglienzellen (RGCs), die fluoreszierende Proteine exprimieren, werden zunächst mittels Epifluoreszenz zur...

Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Quelle: Bosco, A., et al.  In vivo Dynamik der retinalen Mikrogliaaktivierung während der Neurodegeneration: Konfokale ophthalmoskopische Bildgebung und Zellmorphometrie beim Mausglaukom. J. Vis. Exp. (2015) Dieses Video zeigt die In-vivo-Bildgebung von retinalen Mikroglia in einem Mausmodell des Glaukoms. Eine transgene Maus mit fluoreszierenden Protein-exprimierenden retinalen Mikroglia wird unter einem Ophthalmoskop positioniert. Infrarotbeleuchtung wird verwendet, um den Sehnervenkopf (ONH)...

In vivo Bildgebung von retinalen Mikroglia in einem Mausmodell des Glaukoms

Quelle: Jongbloets, B. C., et al{. Visualisierung der Proteinkinase-A-Aktivität bei mäusen, die sich am Kopf fixiert verhalten mit Hilfe der In-vivo-Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie. (2019) Dieses Video zeigt ein Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopieverfahren zur Visualisierung der Proteinkinase-A-Aktivität in kopffixierten, sich verhaltenden Mäusen während der erzwungenen Fortbewegung.

Visualisierung der Proteinkinase-A-Aktivität in einer Maus mit Hilfe der Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie 

Source: Jagodzinska, J., et. al., Optische Kohärenztomographie: Bildgebung von retinalen Ganglienzellen der Maus In Vivo. J. Vis.  (2017)  In diesem Video demonstrieren wir die Verwendung der optischen Kohärenztomographie (SD-OCT) im Spektralbereich zur Abbildung von Netzhautschichten und zur Beurteilung struktureller Veränderungen in einem genetisch veränderten Mausmodell mit Optikusneuropathie.

In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus mittels optischer Kohärenztomographie

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo&lt;span style='font-family:"Arial",sans-serif;font-size:12.0pt;' lang='EN-US'&gt; Zwei-Photonen-Bildgebung von kortikalen Neuronen bei neugeborenen Mäusen. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Zwei-Photonen-Mikroskopie, die verwendet wird, um Neuronen im Gehirn eines anästhesierten transgenen Mauswelpen abzubilden. Der Zwei-Photonen-Laser ermöglicht eine tiefere Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung und minimaler Lichtstreuung und ermöglicht die...

Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Abbildung der neuronalen Morphologie in einem Maus-Welpen

Source: Nishimura, C. et al. Quantifizierung der zerebralen Gefäßarchitektur mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation. J. Vis. (2016). Dieses Video zeigt die In-vivo-Visualisierung von kortikalen Kapillaren im Gehirn von Mäusen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Es beschreibt die Schritte zur Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs in eine anästhesierte Maus mit einem dünnschädeligen kortikalen Fenster, zur Vorbereitung des Aufbaus für die...

 Zwei-Photonen-Mikroskopie für die In-vivo-Bildgebung von Mikrogefäßen im Gehirn von Mäusen 

Quelle: Kulkarni, M. et al. Bildgebung von Ca2+ Dynamik in den Axon-Terminals der Zapfen-Photorezeptoren der Netzhaut der Maus. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den Einsatz der Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Überwachung der Kalziumdynamik in Zapfen-Photorezeptoren einer transgenen Mausnetzhaut. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung von Netzhautschnitten, zur Bildgebung von FRET-basierten Kalzium-Biosensoren und zur Analyse von Fluoreszenzänderungen zur Quantifizierung des...

Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Überwachung der Kalziumdynamik in retinalen Zapfen-Photorezeptoren von Mäusen

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Hier präsentieren wir Ihnen die Nützlichkeit der längs in-Vivo Bildgebung bei der Nachbereitung der morphologischen Veränderungen der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation bei Mäusen.

In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung von Biomolekülen basierend auf ihrer intrinsischen Schwingung spezifischer chemischer Bindungen. In diesem Protokoll wird der instrumentelle Aufbau eines integrierten SRS- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops beschrieben, um zelluläre Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse sichtbar zu machen.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem die transplantierte linke Lunge der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie intravital abgebildet werden kann. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen in Echtzeit nach einer Lungentransplantation von Mäusen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Lernen Sie die transpupillare Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut bei Mäusen für Neurowissenschaften und Ophthalmologie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Untersuchungen retinaler Ganglienzellen und Krankheitsmechanismen.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

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