Name: 使用废培养基对人类植入前胚胎进行染色体筛选:样品采集和染色体倍性分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 了解利用废培养基对人类植入前胚胎进行非侵入性染色体筛选的方法。该技术通过NGS测序实现染色体倍性分析，无需胚胎活检，可降低样本损失并提高辅助生殖技术中的胚胎筛选效率。

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作者感谢薄士平和马淑洁在下一代测序数据分析方面的帮助。资助：本研究得到国家重点研发计划（项目编号：2018YFC1003100）的支持。

伦理许可已由北京大学第三医院伦理委员会批准。
1. 准备
注意：所需的材料和设备列在材料表中。
<ol>
	<li>试剂
	<ol>
		<li>使用前一晚，在三气培养箱（37 °C、5% CO2 和 5% O2）中，将20–30 µL配子培养基/受精培养基和卵裂期/囊胚期培养基（覆盖矿物油）以及透明质酸酶（置于密封管中）预热并平衡。</li>
		<li>在通风橱内的工作台面上将透明质酸酶预热至37 °C。</li>
		<li>根据制造商说明书配制玻璃化冷冻缓冲液和样本采集试剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>工具
	<ol>
		<li>通过拉制玻璃巴斯德移液管，制备用于样本采集和转移的移液管（内径约200至250 µm）、去颗粒细胞/剥离移液管（内径≥150 µm、约130–140 µm和约120 µm）以及洗涤用移液管（内径约150 µm），并将其尖端火焰抛光。 
		&#8203;注意：样本采集/转移、去颗粒细胞及洗涤所用移液管可直接购买。持卵针和注射针也可直接购买。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 方案1：样本采集
<ol>
	<li>卵母细胞-放射冠-卵丘复合体（OCCCs）在使用透明质酸酶消化前的预处理
	<ol>
		<li>使用卵泡刺激素（FSH）和人绝经期促性腺激素（hMG）制剂进行卵巢刺激。当优势卵泡直径&#62;18 mm时，给予10,000 IU绒毛膜促性腺激素（hCG）以促进卵母细胞最终成熟。</li>
		<li>在触发注射后36小时进行卵母细胞采集。将采集的卵母细胞用移液管拾取并转移至含有2.5 mL预热m-HTF并覆盖矿物油的组织培养皿中。</li>
		<li>用移液管迅速将OCCCs转移至含有1 mL受精培养基的器官培养皿中央孔中，随后在37 °C、5% CO2和5% O2的培养箱中孵育2–4小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用透明质酸酶消化OCCCs：向含有OCCCs的器官培养皿中央孔（步骤2.1.3）加入1 mL预热至37 °C的透明质酸酶溶液（80 IU/mL），使最终浓度保持在40 IU/mL，并充分混匀。
	<ol>
		<li>将OCCCs置于37 °C加热平台上孵育2分钟。每隔30秒在显微镜下观察变化，直至仅剩1–2层颗粒细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除颗粒细胞
	<ol>
		<li>迅速将消化后的OCCCs转移至用于卵母细胞操作的培养皿中，并在每个孔中覆盖矿物油。</li>
		<li>在显微镜下观察已分离的颗粒细胞。轻柔地用移液管吸取并释放卵母细胞5次，以去除卵母细胞周围的残留颗粒细胞。</li>
		<li>在其余3个孔中重复上述步骤，彻底清除颗粒细胞。 
		注：上述步骤（2.1–2.3）可根据各实验室的常规操作流程执行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>卵母细胞评估
	<ol>
		<li>使用显微镜评估颗粒细胞去除的完整性。若无法完全去除，此时残留5个或更少的颗粒细胞可被接受。 
		注：若仍有卵丘细胞附着于卵母细胞，可在第3天胚胎从卵裂期培养基转移至囊胚期培养基前将其去除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成胞浆内单精子注射（ICSI）26后，使用移液管将卵母细胞转移至20–30 µL卵裂期胚胎培养基微滴中（每个卵母细胞对应一个微滴），并在37 °C、5% CO2和5% O2的培养箱中孵育。
	<ol>
		<li>将ICSI当天记为第0天。根据伊斯坦布尔胚胎评估共识研讨会的标准，在第1天（约18小时）检查受精情况，第2天（约45小时）和第3天（约68小时）评估胚胎卵裂情况27。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎洗涤
	<ol>
		<li>在第2天，于37 °C、5% CO2和5% O2培养箱中，在组织培养皿中为每个胚胎准备20–30 µL囊胚培养基微滴，并覆盖矿物油。</li>
		<li>另准备三个覆盖矿物油的微滴，并标记新的组织培养皿用于洗涤1–3号。</li>
		<li>将第3天的胚胎转移至洗涤微滴中。使用去颗粒细胞移液管在每个微滴中轻柔地吸取并释放胚胎3次。 
		注：此步骤也有助于去除附着在胚胎上的残留颗粒细胞。</li>
		<li>在第3天更换培养基前，于显微镜下观察并评估胚胎形态。若仍有卵丘细胞附着，应使用剥除移液管在另一个预热并平衡过的、覆盖矿物油的囊胚培养基微滴中轻柔吹打，直至完全去除卵丘细胞。 
		注：在胚胎从卵裂期培养基板转移至囊胚期培养基板前，必须于第3天彻底清除所有附着的卵丘细胞。任何残留的卵丘细胞都会干扰最终分析，导致假阴性结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养基收集的两种选择 
	注：各辅助生殖中心可根据自身资源、需求和偏好选择以下两种方法之一进行培养基收集。
	<ol>
		<li>选项一：胚胎洗涤与培养 
		注：适用于在第5天上午进行玻璃化冷冻的辅助生殖实验室。
		<ol>
			<li>在第4天下午，将胚胎转移至预热（37 °C）的培养基微滴中，并通过移液操作依次在3个微滴中对每个胚胎进行轻柔洗涤。</li>
			<li>将每个胚胎转移至一个独立的、预热（37 °C）的单个培养基微滴中用于样本采集。单个微滴的培养基体积不得超过25 µL。</li>
			<li>在第5天/第6天于37 °C、5% CO2和5% O2条件下进行囊胚培养。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选项二：胚胎洗涤与培养 
		&#8203;注：适用于在第5天下午或第6天进行玻璃化冷冻的辅助生殖实验室。
		<ol>
			<li>在第5天，将胚胎转移至10–15 µL预热（37 °C）的培养基微滴中，并通过移液操作依次在3个微滴中对每个胚胎进行轻柔洗涤。</li>
			<li>将每个胚胎转移至一个独立的、预热（37 °C）的单个培养基微滴中用于样本采集。单个微滴的培养基体积不得超过15 µL。</li>
			<li>在第5天/第6天于37 °C和5% CO2条件下进行囊胚培养。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本采集
	<ol>
		<li>轻柔调整内细胞团位置，使其远离激光束靶点。激光聚焦于滋养外胚层的细胞连接处，在滋养外胚层上打孔以释放囊胚腔内的液体。&#160;随后按照常规流程将胚胎转移至冷冻液中进行冷冻保存&#160;。</li>
		<li>将每个培养胚胎的培养基转移至含有5 µL细胞裂解缓冲液的无RNase/DNase PCR管中。</li>
		<li>收集等量未用于胚胎培养的培养基作为阴性对照。所有采集样本立即在液氮中冷冻，随后储存在−80 °C，直至进行NICS检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照既定方案进行玻璃化冷冻。</li>
</ol>
3. 方案2：文库构建
<ol>
	<li>培养基裂解
	<ol>
		<li>将1 µL阳性对照（10 ng人gDNA）用199 µL新鲜培养基稀释。充分混匀后短暂离心（200 × g，5 s）。</li>
		<li>将第5至第6天囊胚的培养基、稀释后的阳性对照以及新鲜培养基各取10 µL，转移至新的0.2 mL PCR管中。</li>
		<li>向每根PCR管中加入1 µL MT酶混合液，通过移液充分混匀，并立即在200 × g下离心2–3 s。</li>
		<li>将步骤3.1.3中的PCR管放入预热的NICS样本制备仪中，运行以下裂解程序：75 °C孵育10 min；95 °C孵育4 min；保持在22 °C。 
		注：样本制备仪的功能相当于标准PCR仪。
		<ol>
			<li>点击裂解图标进入设置界面。</li>
			<li>控制模式选择管；样本体积输入10 µL；热盖控制选择开，温度设为105 °C；第一阶段暂停选择否。点击确定继续。</li>
			<li>等待剩余时间显示为--:--:--，表示程序结束，然后点击停止终止程序。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>程序完成后停止运行，立即进入下一步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预文库制备
	<ol>
		<li>将Pre-Lib缓冲液解冻至室温。通过移液充分混匀，并立即在200 × g下离心2–3 s。</li>
		<li>按如下方式配制预文库反应的主混合液：将2 µL Pre-Lib酶混合液加入60 µL Pre-Lib缓冲液中，充分混匀反应体系并短暂离心。</li>
		<li>向上一步处理过的每个培养基样本中加入60 µL预文库反应混合液。通过移液充分混匀，并立即在200 × g下离心2–3 s。</li>
		<li>将步骤3.2.3中的PCR管放入样本制备仪中，运行以下预文库程序：95 °C孵育2 min；12个循环（15 °C 40 s，22 °C 40 s，33 °C 30 s，65 °C 30 s，72 °C 40 s，95 °C 10 s，63 °C 10 s）；最后保持在4 °C。
		<ol>
			<li>点击Pre_Lib图标进入设置界面。</li>
			<li>控制模式选择管；样本体积输入70 µL；热盖控制选择开，温度设为105 °C；第一阶段暂停选择否。点击确定继续。</li>
			<li>等待剩余时间显示为--:--:--，表示程序结束，点击停止以终止程序。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>程序完成后停止运行，立即进入下一步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库制备
	<ol>
		<li>将文库缓冲液解冻至室温。通过移液充分混匀，并立即在200 × g下离心2–3 s。</li>
		<li>按如下方式配制文库反应的主混合液：将1.6 µL文库酶混合液加入60 µL文库缓冲液中，充分混匀反应体系并短暂离心。</li>
		<li>向步骤3.2.3所得的每个预文库产物中加入60 µL文库反应混合液和2 µL条形码引物。充分混匀反应体系并短暂离心。</li>
		<li>将步骤3.2.3中的PCR管放入热循环仪中，运行以下文库制备程序：94 °C孵育30 s；17个循环（94 °C 25 s，62 °C 30 s，72 °C 45 s）；最后保持在4 °C。
		<ol>
			<li>点击Lib_Prep图标进入设置界面。</li>
			<li>控制模式选择管；样本体积输入130 µL；热盖控制选择开，对应温度设为105 °C；第一阶段暂停选择否。点击确定继续。</li>
			<li>等待剩余时间显示为--:--:--，表示程序结束，点击停止以终止程序。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库纯化
	<ol>
		<li>在纯化步骤前至少20分钟将磁珠从2–8 °C储存条件下取出。涡旋混匀磁珠20 s。将足够量的磁珠转移至新的1.5 mL微量离心管中，并使其升温至室温。</li>
		<li>向每个文库中加入1倍体积的磁珠。通过上下移液混匀至少10次，在室温下孵育5 min。 
		注：例如，向100 µL文库样本中加入100 µL磁珠。</li>
		<li>孵育后短暂离心管子，并将其置于磁力架上。</li>
		<li>等待约5分钟直至溶液澄清。保持管子在磁力架上的同时，小心吸除上清液并弃去。</li>
		<li>向管中加入200 µL新鲜配制的80%乙醇。室温孵育30 s后小心去除上清液。重复此步骤一次。</li>
		<li>尽可能彻底去除乙醇。在磁力架上室温晾干磁珠约5–10分钟。</li>
		<li>将管子从磁力架上取下，加入17.5 µL洗脱缓冲液，涡旋振荡使磁珠重悬。短暂离心后室温孵育5 min。</li>
		<li>将管子放回磁力架，等待溶液澄清后，小心转移15 µL上清液至新管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库定量
	<ol>
		<li>根据Qubit dsDNA HS检测试剂盒的用户指南，使用荧光计对纯化后的文库进行定量28。文库产量范围约为15–300 ng。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库合并
	<ol>
		<li>每个文库样本取10纳克用于合并。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测序
	<ol>
		<li>参阅测序用户指南（15027617 v01）29。</li>
		<li>在该平台上对纯化后的文库进行单端50 bp测序，每个样本可获得约200万条读长，推荐测序深度为0.03 ×。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>在登录页面输入用户的姓名和密码</li>
		<li>登录系统后，点击分析，新页面将出现。点击NICS-A标签下的创建提交。然后，平台选择NGS，选择机构，试剂选择NICSInst&#160;，在项目ID下方的框中输入项目信息，设置分析偏好并上传文件。所有测序文件成功上传后，点击提交以启动分析（图3A）。</li>
		<li>点击查看提交以显示已提交项目的列表。分析完成后，项目状态将变为“已完成”，报告字段中会出现“显示”按钮。点击显示按钮以查看NICS分析的汇总表（图3B）。</li>
		<li>点击导出报告按钮以保存报告（图3C）。 
		注：每次分析将导出三种类型的文件。一个图形文件，包含每条染色体及全基因组的拷贝数变异（CNV）图谱，该文件将存储在&#34;graph&#34;文件夹下；一个电子表格，包含本次分析运行的样本质控详情；一个文档文件，包含用户自定义的NICS报告；以及一个电子表格，包含本次分析运行的样本汇总信息。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Barlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+pregnancy+loss+and+obstetrical+risk+after+in-vitro+fertilization+and+embryo+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement.</a> Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).</li>
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<li>Capalbo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li>
<li>Tobler, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocoel+fluid+from+differentiated+blastocysts+harbors+embryonic+genomic+material+capable+of+a+whole-genome+deoxyribonucleic+acid+amplification+and+comprehensive+chromosome+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).</li>
<li>Magli, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+genetic+testing%3A+polar+bodies%2C+blastomeres%2C+trophectoderm+cells%2C+or+blastocoelic+fluid%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid?</a> Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).</li>
<li>Kuznyetsov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+novel+non-invasive+preimplantation+genetic+screening+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach.</a> PLoS One. 13 (5), e0197262(2018).</li>
<li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+Genetic+Screening+with+Spent+Culture+Medium%2FBlastocoel+Fluid+for+in+Vitro+Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9275(2018).</li>
<li>Jiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+invasive+preimplantation+genetic+testing+using+blastocyst+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium.</a> Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).</li>
<li>Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Births+after+intracytoplasmic+injection+of+sperm+obtained+by+testicular+extraction+from+men+with+nonmosaic+Klinefelter%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter's syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).</li>
<li>Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Istanbul+consensus+workshop+on+embryo+assessment%3A+proceedings+of+an+expert+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting.</a> Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product</a> (2015).</li>
<li>Miseq system use guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/downloads/miseq_system user _ guide 15027617.html">https://support.illumina.com/downloads/miseq_system user _ guide 15027617.html</a> (2016).</li>
<li>Lane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+to+detect+aneuploidy+from+cell+free+DNA+collected+from+media+is+dependent+on+the+stage+of+development+of+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo.</a> Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).</li>
<li>Rubio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+study+of+concordance+between+embryonic+cell-free+DNA+and+trophectoderm+biopsies+from+1301+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).</li>
<li>Rubio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cell-free+DNA+versus+trophectoderm+biopsy+for+aneuploidy+testing%3A+concordance+rate+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications.</a> Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).</li>
<li>Lledo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+results+of+non-invasive+PGT-A+of+human+embryos+using+two+different+techniques+for+chromosomal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis.</a> Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).</li>
<li>Kuznyetsov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+Invasive+Cell-Free+Human+Embryo+Aneuploidy+Testing+%28miPGT-A%29+Utilizing+Combined+Spent+Embryo+Culture+Medium+and+Blastocoel+Fluid+-Towards+Development+of+a+Clinical+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7244(2020).</li>
</ol>

Yaxin Yao、Jieliang Ma、Jing Wang 和 Sijia Lu 是翌珂omics有限公司的员工。

修改与故障排除
如果NICS结果受到亲本遗传物质的污染，需确保完全去除所有卵丘-放射冠细胞，并确保通过ICSI进行受精。应避免培养基储存或模板制备过程不当，这些因素可能导致DNA降解。实验操作空间应使用DNase和RNase去污试剂彻底净化。为防止来自其他胚胎的交叉污染，自第4天起，每个胚胎始终单独培养于一滴培养液中。将胚胎移入最终培养液滴的时间适当延迟，可进一步降低污染现象30,31,32,33。为最大限度减少母源性污染，Kuznyetsov34对第0天至第4天的胚胎培养流程进行了改进，包括通过移液和冲洗仔细清除残留的放射冠细胞。
Lane 等人30</s...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62619">Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis</a>. The Protocol and Representaive Results sections were updated.
In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
to:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
In the Representative Results, Figure 3 was updated from:
<img alt="Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62619/62619fig03.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62619/62619fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62619/62619fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62619/62619fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62619">Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis</a>. The Protocol and Representaive Results sections were&#160;updated.

Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

辅助生殖技术（ART）已越来越多地用于不孕症的治疗。然而，ART（如体外受精，IVF）的成功率仍然有限，且妊娠丢失率显著高于正常人群1。这些问题的主要原因是染色体异常，这在植入前的人类胚胎中较为常见2。植入前染色体非整倍体筛查（PGT-A）是一种在胚胎植入前检测其染色体平衡性的有效方法3,4。一些研究已证实，PGT-A可降低流产率并提高妊娠率5,6,7,8。然而，PGT-A需要复杂的技术专长，必须经过专门培训和实践经验才能掌握。侵入性的胚胎活检操作也可能对胚胎造成潜在损伤9。研究表明，卵裂球活检可能阻碍胚胎后续发育，而滋养层细胞（TE）活检的数量可能影响胚胎的着床率10。尽管胚胎活检对人类的长期生物安全性尚未得到充分评估，但动物研究已显示出其对胚胎发育的负面影响11,12,13。
既往研究表明，在胚胎发育过程中有微量DNA物质会分泌到培养基中，研究人员已尝试利用胚胎使用后的培养基进行全染色体筛查（CCS）14,15,16,17,18。然而，检测率和检测准确性尚未达到广泛临床应用的要求。本研究报道了一种改进的无创植入前遗传学检测（NICS）检测方法，可提高NICS检测的检出率和准确性19。近年来，囊胚腔液（BF）已被研究作为微创植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）的分析样本。然而，囊胚腔液样本中成功实现全基因组扩增及可检测到DNA的比例在34.8%至82%之间20,21,22。不同研究中报道的BF体积范围为0.3 nL至1 µL。鉴于BF中DNA含量较低，可通过将囊胚腔液与培养基混合以增加游离DNA总量，从而提高检测的成功率和一致性。Kuznyetsov等.23和Li等24采用激光处理透明带，使囊胚腔液释放至培养基中，以增加胚胎DNA总量，经全基因组扩增（WGA）后，混合培养基/BF样本的扩增率分别为100%和97.5%。Jiao等25采用相同方法也获得了100%的扩增成功率。
本研究报道了一种详细的实验方案，包括使用过的培养基样本制备、下一代测序（NGS）制备及数据分析。通过从卵母细胞中仔细去除卵丘细胞，本研究实施了卵胞质内单精子注射（ICSI）和囊胚培养。收集第4天至第5天/第6天的使用过的培养基，用于全基因组扩增（WGA）及NGS文库制备。利用NICS技术，本研究在约3小时内简化了WGA和NGS文库制备步骤，并在约9小时内无创地获得了染色体拷贝数检测（CCS）结果。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL EP管，0.2 mL PCR管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C, PCR-02-C</td><td>推荐使用无DNase/RNase、低吸附的PCR管和1.5 mL微量离心管。</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L、200 &amp;micro;L、1000 &amp;micro;L 无DNase/RNase吸头</td><td>Axygen</td><td>T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S</td><td>可替换为其他品牌/用于样本转移</td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>国药化学</td><td>10009218</td><td>可替换为其他品牌/用于DNA文库纯化</td></tr><tr><td>条形码引物1-48</td><td>亿科基因组学</td><td>NICSInst文库制备试剂盒中的试剂</td><td>用于文库扩增</td></tr><tr><td>BD Falcon 器官培养皿，无菌</td><td>BD Bioscience</td><td>363037</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎培养</td></tr><tr><td>BD Falcon 组织培养皿（易握型），无菌</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎培养</td></tr><tr><td>BD Falcon 组织培养皿，无菌</td><td>BD Bioscience</td><td>353002</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎培养</td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液</td><td>亿科基因组学</td><td>NICSInst文库制备试剂盒中的试剂</td><td>用于培养基预处理</td></tr><tr><td>细胞裂解酶</td><td>亿科基因组学</td><td>NICSInst文库制备试剂盒中的试剂</td><td>用于培养基预处理</td></tr><tr><td>ChromGo软件</td><td>亿科基因组学</td><td></td><td>数据分析</td></tr><tr><td>CMPure磁珠</td><td>亿科基因组学</td><td>NICSInst文库制备试剂盒中的试剂</td><td>用于文库纯化</td></tr><tr><td>Cryotop开放式系统</td><td>&amp;nbsp;KITAZATO BioPharma</td><td>81110</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎玻璃化冷冻</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>亿科基因组学</td><td>NICSInst文库制备试剂盒中的试剂</td><td>用于溶解DNA</td></tr><tr><td>ES（玻璃化冷冻试剂盒）</td><td>&amp;nbsp;KITAZATO BioPharma</td><td>玻璃化冷冻试剂盒中的试剂</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎玻璃化冷冻</td></tr><tr><td>HOLDNIG</td><td>ORIGIO</td><td>MPH-MED-35</td><td>可替换为其他&lt;br/&gt; 品牌/用于ICSI</td></tr><tr><td>透明质酸酶溶液，80 U/mL</td><td>SAGE</td><td>ART4007-A</td><td>可替换为其他品牌/消化卵母细胞-放射冠-颗粒细胞复合体</td></tr><tr><td>ICSI</td><td>ORIGIO</td><td>MPH-35-35</td><td>可替换为其他品牌/用于ICSI</td></tr><tr><td>Illumina MiSeq&amp;reg; 系统</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>用于文库测序</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Labotect</td><td>Inkubator C16</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎培养</td></tr><tr><td>文库缓冲液</td><td>亿科基因组学</td><td>NICSInst文库制备试剂盒中的试剂</td><td>用于文库扩增</td></tr><tr><td>文库酶混合液</td><td>亿科基因组学</td><td>NICSInst文库制备试剂盒中的试剂</td><td>用于文库扩增</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>DynaMagTM-2</td><td>12321D</td><td>用于文库纯化</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>1X71</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎观察</td></tr><tr><td>小型离心机</td><td>ESSENSCIEN</td><td>ELF6</td><td>用于分离</td></tr><tr><td>MT酶混合液</td><td>亿科基因组学</td><td>NICSInst文库制备试剂盒中的试剂</td><td>用于培养基预处理</td></tr><tr><td>NICSInst文库制备试剂盒</td><td>亿科基因组学</td><td>KT1000800324</td><td>全基因组扩增与文库构建</td></tr><tr><td>NICSInst样本制备工作站</td><td>亿科基因组学</td><td>&amp;nbsp;ME1001003</td><td>扩增DNA</td></tr><tr><td>Nunc IVF 4孔培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎洗涤和囊胚培养</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Oirgio</td><td>&amp;nbsp;MXL3-IND-135</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎转移</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>ORIGIO</td><td>PP-9-1000</td><td>可替换为其他品牌/用于体外受精实验室</td></tr><tr><td>预文库缓冲液</td><td>亿科基因组学</td><td>NICSInst文库制备试剂盒中的试剂</td><td>文库前制备</td></tr><tr><td>预文库酶</td><td>亿科基因组学</td><td>NICSInst文库制备试剂盒中的试剂</td><td>文库前制备</td></tr><tr><td>Qubit&amp;reg; 3.0 荧光计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33216</td><td>用于文库定量</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage 囊胚培养基</td><td>SAGE</td><td>ART-1029</td><td>用于胚胎囊胚阶段培养</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage 卵裂期培养基</td><td>SAGE</td><td>ART-1026</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎卵裂阶段培养</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage 受精培养基</td><td>SAGE</td><td>ART-1020</td><td>可替换为其他品牌/用于卵母细胞与精子受精</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage 含HEPES的m-HTF培养基</td><td>SAGE</td><td>ART-1023</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎培养</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage SPS血清蛋白替代试剂盒</td><td>SAGE</td><td>ART-3010</td><td>可替换为其他品牌/用于去除卵母细胞周围的颗粒细胞</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage 组织培养矿物油</td><td>SAGE</td><td>ART-4008P</td><td>可替换为其他品牌/用于覆盖培养基</td></tr><tr><td>STRIPPER 吸头</td><td>ORIGIO</td><td>MXL3-IND-135</td><td>可替换为其他品牌/用于去除颗粒细胞</td></tr><tr><td>玻璃化冷冻Cryotop开放式系统</td><td>KIZTAZATO</td><td>81111</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎玻璃化冷冻</td></tr><tr><td>玻璃化冷冻试剂盒</td><td>&amp;nbsp;KITAZATO BioPharma</td><td>VT101</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎玻璃化冷冻</td></tr><tr><td>Vortex振荡器</td><td>麒麟贝儿</td><td>DNYS8</td><td>样本混匀</td></tr><tr><td>VS（玻璃化冷冻试剂盒）</td><td>&amp;nbsp;KITAZATO BioPharma</td><td>玻璃化冷冻试剂盒中的试剂</td><td>可替换为其他品牌/用于胚胎玻璃化冷冻</td></tr><tr><td>ZILOS-tk 激光系统</td><td>Hamilton Thorne</td><td>CLASS 1 激光</td><td>可替换为其他品牌/用于人工囊胚腔塌陷</td></tr></tbody></table>

利用培养废液对人类植入前胚胎进行染色体筛查：样本采集与染色体倍性分析

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

在临床体外受精（IVF）中，目前用于胚胎植入前遗传学检测-非整倍体（PGT-A）的主流方法是从滋养外胚层（TE）中取少量细胞进行活检。TE是形成胎盘的细胞谱系。然而，该方法需要专业技能，具有侵入性，且由于滋养外胚层（TE）与内细胞团（ICM）之间的染色体数目并不总是一致（ICM将发育为胎儿），因此存在假阳性和假阴性的问题。无创性染色体筛查（NICS）技术通过测序培养液中来自TE和ICM释放的DNA，可能为解决上述问题提供一种途径，但此前研究表明其有效性有限。本研究报道了NICS的完整操作流程，包括胚胎培养液取样方法、全基因组扩增（WGA）与文库制备，以及利用分析软件进行高通量测序（NGS）数据分析。考虑到不同胚胎实验室冷冻保存时间存在差异，胚胎学家可依据各自IVF实验室的实际条件，选择两种胚胎培养液采集方法之一。

本研究将所提出的方法应用于一名患者。在应用NICS分析之前，已获得伦理审查委员会（IRB）批准及知情同意。本研究共获得6枚囊胚，并在第4至第5天的培养基中对全部6枚胚胎进行了NICS检测。NICS检测发现其中5枚胚胎的染色体异常源于父母的平衡易位，因此无法用于移植（图4A-E）。两枚胚胎的NICS结果显示出相同的核型45，XN和-18（×1），均为18号染色体缺失（图4A，B）。核型46，XN，-1p（pter→p21.1，×1）仅表现为1号染色体短臂pter→p21.1区域的缺失（图4D）。
NICS 结果显示核型为 46, XN, +1p (pter→p21.2, ×3) 和 -18(q21.32→qter, ×1)，表明 18 号染色体长臂 q21.32→qter 区域缺失，同时 1 号染色体短臂 pter→p21.2 区域存在重复...

本研究报道了一种利用使用过的胚胎培养液对人类胚胎进行染色体筛查的方案，该方法无需胚胎活检，即可通过高通量测序（NGS）实现染色体倍性鉴定。本文详细介绍了实验流程，包括培养液的准备、全基因组扩增（WGA）、高通量测序（NGS）文库构建以及数据分析。

在临床体外受精（IVF）中，目前普遍采用的胚胎植入前遗传学检测-非整倍体（PGT-A）方法需要从滋养外胚层（TE）取少量细胞进行活检。该谱系……

本方案旨在对培养基收集和基于非侵入性染色体筛查（NICS）的人类胚胎植入前染色体倍性分析进行标准化。NICS 的主要优势在于操作简便，相较于 TiDieR 显微操作更为省时，且能有效减少侵入性活检样本的丢失。取样方法具有很高的灵活性。我们为您提供两种不同的选择，一种用于常规的序贯胚胎培养，另一种用于一步法。这些是我们团队的主要成员，姚亚新博士和朱晓慧博士主要负责文库构建和NICS再生测序工作。贾佳琳博士和我共同完成胚胎学实验及样本采集。刘教授是我们的课题组负责人，也是本文的通讯作者。首先，准备好试剂和工具。使用前将20至30微升培养基和透明质酸酶预热并平衡。然后将培养基和透明质酸酶置于生物安全柜内的工作台面上。迅速将消化后的OCCC转移至用于卵母细胞操作的培养皿中，并在每孔中覆盖矿物油。轻轻吹打卵母细胞5到10次，以去除卵母细胞周围的残留颗粒细胞。在其余三个孔中重复此步骤，彻底清除颗粒细胞。使用显微镜评估颗粒细胞去除的完整性。然后进行胞质内单精子注射（也称为ICSI），并将胚胎转移至培养基中。为每个胚胎准备20至30微升囊胚培养基微滴。在第2天将胚胎置于组织培养皿中，用矿物油覆盖，并在37摄氏度、5%二氧化碳和5%氧气条件下培养。将第三天的胚胎转入洗涤微滴后，使用移液管依次在三个微滴中轻轻吸出并释放胚胎。然后将胚胎转移至囊胚培养液中。准备好洗涤微滴和培养微滴。在第4天下午，将胚胎转移至预热的培养液微滴中，用移液管在三个微滴中依次轻轻洗涤每个胚胎。将每个胚胎转移至单独的预热培养液微滴中，用于样品采集。在冷冻保存前继续培养囊胚胚胎。在进行胚胎冷冻保存前的玻璃化冷冻时，准备培养微滴，并将胚胎转移至预热的、体积为10至15微升的培养液微滴中。在第五天早晨，通过移液操作，依次将每个胚胎在三个微滴中轻柔洗涤。如先前所述，将每个胚胎转移至一个独立的、预热的单个培养液微滴中，用于样本采集。将囊胚胚胎在37摄氏度和5%二氧化碳条件下进行培养，之后再进行冷冻保存。接下来，轻柔地调整内细胞团的位置，使其与激光束的目标点保持一定距离，激光束聚焦于滋养外胚层的细胞连接处，以在滋养外胚层上产生一个小孔，从而释放囊胚腔内的液体。为收集样本，将试剂盒中的缓冲液在室温下解冻，并短暂离心。然后将每个培养胚胎的培养基转移至含有5 µL细胞裂解缓冲液的无RNase和DNase的PCR管中。准备试剂和工具。在用培养基将基因组DNA稀释至浓度为50 pg/µL后进行定量。充分混匀后，在200 ×g条件下短暂离心5秒。将培养基在微型离心机中离心30至60秒后，用移液器从稀释的阳性对照和新鲜培养基试管底部各吸取10 µL，加入新的0.2 mL PCR管中。加入1 µL MT酶混合液，并通过移液充分混匀。然后立即离心两到三秒。将PCR管放入预热的混合样本制备仪中，运行裂解程序。当预文库缓冲液完全解冻并混匀后，立即以200 G离心两到三秒。通过将2微升预文库酶混合液加入60微升预文库缓冲液中，配制预文库反应的主混合液。充分混匀反应液，短暂离心。将60 µL预文库反应混合液加入预处理的培养基样品中。用移液器充分混匀后，立即在200 ×g条件下离心2至3秒。将PCR管放入预热的样本制备工作站中。运行文库前程序，并在4°C下保持。通过将1.6 µL文库酶混合液加入60 µL文库缓冲液中，制备文库反应的主混合液。充分混匀反应体系，并按此前所示方法进行离心。向每个预文库产物中加入60微升文库反应混合液和2微升条形码引物。然后充分混匀反应体系，并按演示进行离心。离心后，将PCR管放入热循环仪中。运行文库制备程序，然后在4°C下保存。准备试剂和工具。将制备好的1X mega beads加入文库样品中。按照文稿中所述方法对纯化后的文库进行定量，并使用每个文库样品的10纳克进行文库混合。请参考测序用户指南，在测序完成后进行数据分析。在ChromGo的数据分析登录页面输入用户的姓名和密码。登录后，点击 NICS 选项卡下的“创建提交”。然后为平台选择 NGS，为公司选择 Illumina，为试剂选择 NICSInst。在“项目 ID”下方的框中输入项目信息。设置分析偏好并上传文件。所有测序文件成功上传后，点击“提交”以开始分析。已提交的项目将列在“查看提交”标签页下。点击报告字段中的“显示”按钮，以查看NICS分析的汇总表格。点击“导出报告”按钮以保存报告。从患者体内共获得六个囊胚，并对这六个胚胎在第四天至第五天的培养基中进行了无创性染色体筛查（NICS）。通过NICS检测，在五个胚胎中发现了由父母平衡易位引起的染色体异常，因此这些胚胎未用于移植。两个胚胎的NICS结果显示相同的核型45 XN，且均为18号染色体缺失。核型46 XN中1号染色体短臂区域缺失仅涉及该染色体短臂区域的缺失。NICS结果显示核型为46 XN，伴有18号染色体长臂区域缺失及1号染色体短臂区域重复。尽管这些核型存在五号染色体重复，并显示出八种嵌合差异，但NICS检测能够对全部24条染色体进行非整倍性筛查。该过程为单个正常核型囊胚的移植提供了一种新方法。在实施该操作时，必须注意彻底去除颗粒细胞，以避免母源性污染，并在DNA含量足以进行扩增时，收集培养液和扩张的囊胚阶段样本。通过使用NICS技术，本研究将全基因组扩增（WGA）和全基因组测序（WGS）文库制备步骤缩短至约三小时，并可在约九小时内无创地获得连续循环测序（CCS）结果。该技术开发后，为辅助生殖技术（ART）领域的临床医生提供了一种新方法，即将形态学评估与NICS相结合，选择形态良好且为单倍体的胚胎进行子宫移植，可能提高持续妊娠率和活产率。

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遗传学

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从培养细胞中制备染色体

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从前期到第二次减数分裂中期的小鼠卵母细胞发育分析用染色质铺展制备方法

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半导体测序用于胚胎植入前非整倍体遗传学检测

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人类囊胚活检与玻璃化冷冻

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人类卵母细胞成熟度评估及其临床应用

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单细胞收集围植入期人类胚胎中的滋养层细胞

了解利用废培养基对人类植入前胚胎进行非侵入性染色体筛选的方法。该技术通过NGS测序实现染色体倍性分析，无需胚胎活检，可降低样本损失并提高辅助生殖技术中的胚胎筛选效率。

利用培养废液对人类植入前胚胎进行染色体筛查：样本采集与染色体倍性分析

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