Name: Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Öğrenin fare nöromüsküler kavşağında konfokal mikroskopi ile yüksek zamansal çözünürlükte kalsiyum geçici maddeleri kaydetme yöntemini. Bu teknik sinaptik iletim ve nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için önemli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmanın floresan çalışmaları, Rusya Bilim Vakfı Hibe (proje No. 19-15-00329) finansal desteği ile gerçekleştirilmiştir. Yöntem, RAS АААА-А18-118022790083-9 FRC Kazan Bilim Merkezi için hükümet görevlendirmesinden sağlanan finansman altında geliştirilmiştir. Araştırma, Federal Araştırma Merkezi "RAS Kazan Bilim Merkezi" ekipmanlarının kullanılmasıyla geliştirilmiştir. Yazarlar, bu makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için Dr. Victor I. İlyin'e teşekkür eder.

Fareler BALB/C'den (20-23 g, 2-3 aylık) levator auris longus'un (m. LAL) izole sinir-kas preparatları üzerinde deneyler yapıldı41. Deneysel prosedürler, Kazan Federal Üniversitesi ve Kazan Tıp Üniversitesi'nin laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin kılavuzlara uygun olarak, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokol, 86/609/EEC sayılı Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi'nin gerekliliklerini karşıladı ve Kazan Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylandı.
1. Zil ve Dosyalama çözümlerinin hazırlanması
<ol><li>Aşağıdaki bileşenleri karıştırarak memeli kası için Ringer çözeltisini hazırlayın: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (2 mM), MgCl 2 (1 mM), NaH2 PO4 (1 mM), NaHCO3 (11.9 mM) ve glikoz (11 mM).</li><li><ol><li><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></ol></li><li><li><li> </li><li><li></ol><ol><li> </li><li> </li><li><li><li><li> </li><li><li><ol><li> </li><li></li><li></li><li> </li><li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63308/63308fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63308/63308fig01large.jpg" target="_blank"></a><ol start="6" style="margin-left: 40px;"><li></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63308/63308fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63308/63308fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol start="9"><li> <ol><li> </li><li> </li></ol></li><li><li><li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63308/63308fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63308/63308fig03large.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li> </li><li><li></li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu makalede, Ca 2 + 'ya duyarlı boyanın sinir kütüğü yoluyla fare sinir uçlarına yüklenmesi ve konfokal mikroskop kullanılarak hızlı bir kalsiyum geçicisinin kaydedilmesi yöntemi sunulmuştur. Bu yükleme yönteminin uygulanmasının bir sonucu olarak, sinir kütüğüne yakın bulunan sinapsların çoğu, motor sinirin düşük frekanslı uyarımına yanıt olarak kalsiyumun sinir uçlarına girişinin kaydedilmesini sağlamak için yeterli bir floresan seviyesine sahipti.
Kalsiyum boyalarının güdükten yük...

Uyarılabilir hücrelerde hızlı kalsiyum dalgalarını ölçme problemi, merkezi ve periferik sinir sistemlerinde sinyal iletimini incelemenin en önemli ve zorlu yönlerinden biridir. Kalsiyum iyonları, nörotransmitter salınımını, sinaptik plastisiteyi ve çeşitli hücre içi proteinlerin aktivitesinin modülasyonunu tetiklemede önemli bir rol oynar 1,2,3,4,5. Kalsiyum sinyallemesini incelemek, nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmenin yollarını bulmak için de önemlidir6. Kalsiyum seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek için, floresan kalsiyuma duyarlı boyalar yaygın olarak kullanılır ve floresan seviyelerindeki değişiklikler analiz edilir 7,8,9.
Kalsiyum boyalarının hücrelere yüklenmesi farklı şekillerde sağlanabilir. Ağırlıklı olarak, hücre perkastan boyalar10,11 oranında kullanılır. Bununla birlikte, böyle bir durumda, sadece hücre içindeki bir boya konsantrasyonunu kontrol etmek zor değildir, aynı zamanda yükleme için hedef hücreleri seçmek de zordur. Bu yöntem, boya postsinaptik hücrelere girdiğinden periferik sinir uçlarını incelemek için geçerli değildir. Bunun yerine, hücre geçirimsiz boyalar bu tür preparatlar için daha uygundur. Bu durumda, boyalar hücrelere mikroenjeksiyonla veya bir yama pipeti 12,13,14 yoluyla verilir. Bir sinir kütüğünden yükleme yöntemi de vardır. İkinci yöntem, nöromüsküler bileşke preparatları15,16,17,18,19,20 için en uygun yöntemdir. Sadece ilgilenilen hücreler için boyama yapılmasına izin verir. Bu yöntem, hedef hücredeki boya konsantrasyonunun doğru bir değerlendirmesini sağlamasa da, konsantrasyon, çözeltilerde duran hücrelerin floresan seviyesini, bilinen bir kalsiyum21 konsantrasyonu ile karşılaştırarak yaklaşık olarak tahmin edilebilir. Bu çalışmada, memelilerin sinapslarına uygulanan bu yöntemin bir modifikasyonu sunulmuştur.
Aksiyon potansiyelinin depolarize fazı sırasında kalsiyum girişi, özellikle nöromüsküler kavşakta hızlı bir süreçtir; bu nedenle, tescili için uygun ekipman gereklidir1. Voltaja duyarlı bir floresan boya kullanan yeni bir çalışma, bir farenin periferik sinapsındaki aksiyon potansiyelinin süresinin yaklaşık 300 μs22 olduğunu göstermiştir. Kurbağanın periferik sinapslarında kalsiyuma duyarlı boyalar kullanılarak değerlendirilen kalsiyum geçici, daha uzun bir süreye sahiptir: yükselme süresi yaklaşık 2-6 ms ve çürüme süresi, kullanılan kalsiyum boyasına bağlı olarak yaklaşık 30-90 ms'dir. Floresan boyaların yardımıyla hızlı süreçleri ölçmek için, genellikle hızlı ve hassas CCD matrislerine sahip CCD veya CMOS kameralar kullanılır. Bununla birlikte, bu kameralar,matris 25,26,27,28'in hassas elemanlarının boyutuyla sınırlı olan düşük çözünürlük dezavantajına sahiptir. Hücrelerin düşük frekanslı uyarılmasına yanıt olarak hem aksiyon potansiyellerini hem de kalsiyum geçicilerini kaydetmek için yeterli hassasiyete sahip en hızlı kameralar, 2.000 Hz'lik bir tarama frekansına ve 80 x 8029 boyutunda bir matrise sahiptir. Daha yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip sinyaller elde etmek için, özellikle30,31,32 sinyalindeki bazı hacimsel değişiklikleri değerlendirmek gerekirse, konfokal mikroskopi kullanılır. Ancak, konfokal mikroskobun çizgi tarama modunda yüksek bir tarama hızına sahip olduğu akılda tutulmalıdır, ancak uzamsal bir görüntü oluştururken hızlı işlemlerin kayıt hızında hala önemli sınırlamalar vardır33. Daha yüksek tarama hızına sahip dönen Nipkow disklerine (yarık tarama mikroskobu) ve Çok Noktalı Dizi Tarayıcılara dayanan konfokal mikroskoplar vardır. Aynı zamanda, konfokal görüntü filtrelemede klasik konfokal mikroskoplardan daha düşüktürler (Nipkow diskli mikroskoplar için iğne delikleri çapraz konuşma)32,34,35. Rezonans taramalı konfokal görüntüleme aynı zamanda yüksek zamansal ölçümler için gereken yüksek uzaysal-zamansal çözünürlük sağlayabilir36. Bununla birlikte, rezonans tarayıcıları kullanırken zayıf floresan tepkilerinin yüksek bir tarama hızında kaydedilmesinin, hibrit dedektörler gibi son derece hassas dedektörler gerektirdiğini dikkate alın36.
Bu makalede, uzamsal çözünürlük37'yi korurken Lazer Tarama Konfokal Mikroskopisi (LSCM) ile kaydedilen sinyallerin zamansal çözünürlüğünü artırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Mevcut yöntem, daha önce açıklanan ve LSCM platformu 38,39,40'a aktarılan yöntemlerin daha da geliştirilmesidir. Bu yaklaşım, mikroskop donanımında değişiklik gerektirmez ve periyodik olarak uyarılan floresan sinyalleri, stimülasyon anına göre bir zaman kayması ile kaydetmek için bir algoritmanın uygulanmasına dayanır.

<table><tbody><tr><td>Kılcal Cam</td><td>Clark Elektromedikal aletler, İngiltere</td><td>GC150-10</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal ve çoklu foton mikroskop sistemi Leica TCS SP5 MP</td><td>Leica Microsystems, Heidelberg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme P 97</td><td>Sutter Cihazı, ABD</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Akış regülatörü</td><td>KD Medical GmbH Hastane Ürünleri, Almanya</td><td>KD REG</td><td>Akış regülatörü HEPES ile tek kullanımlık infüzyon seti</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>H0887</td><td>100mL</td></tr><tr><td>Aydınlatma sistemi Leica CLS 150X</td><td>Leica Microsystems, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Las AF yazılımı</td><td>Leica Microsystems, Heidelberg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Las X yazılımı</td><td>Leica Microsystems, Heidelberg, Almanya</td><td></td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td></tr> <tr><td>Emme Borulu Manyetik Tutucu</td><td>BİYOBİLİM ARAÇLARI, ABD</td><td>MTH-S</td><td></td></tr><tr><td>Microspin FV 2400</td><td>Biosan, Letonya</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pimleri</td><td>Güzel bilim araçları, Kanada</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Çok dönüşlü MSC 3000</td><td>Biosan, Letonya</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotasyum tuzu</td><td>Moleküler Problar, ABD</td><td>O6806</td><td>500 & mu; g</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Biohit, Rusya</td><td>720210</td><td>0.5-10 & L</td></tr><tr><td>Pipet ucu</td><td>Biohit, Rusya</td><td>781349</td><td>10 & mikro; L</td></tr><tr><td>Hamuru</td><td>yerel üretici</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Tek kullanımlık hipodermik iğneler</td>, <td>Bbraun</td><td>100, Sterican</td><td>0.4 & kez; 40 mm</td></tr><tr><td>Elektronik tablo programı</td><td>Microsoft, ABD</td><td>Microsoft Office Excel</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop, Leica M80</td><td>Leica Microsystems, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emme elektrodu</td><td>Kazakov A. BİYOLOJİK NESNELERİN ELEKTRİK STİMÜLASYONU İÇİN BASİT EMİŞ ELEKTRODU / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // Uluslararası araştırma dergisi.&nbsp;- 2015. - No. 9 (40) Bölüm 3. - SAYFA 13-16.</td><td></td><td>http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/</td></tr> <tr><td>Sylgard 184 elastomer</td><td>Dow Corning, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>yerel üreticisi</td><td></td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>yerel üreticisi</td><td></td><td>60 mL</td></tr></tbody></table>

konfokal mikroskopi kullanılarak fare nöromüsküler kavşağında yüksek zamansal Çözünürlükte kalsiyum geçici maddelerinin kaydı

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Presinaptik kalsiyum seviyesinin tahmini, sinaptik iletimin incelenmesinde kilit bir görevdir, çünkü presinaptik hücreye kalsiyum girişi, nörotransmitter salınımına yol açan bir dizi olayı tetikler. Ayrıca, presinaptik kalsiyum seviyelerindeki değişiklikler birçok hücre içi proteinin aktivitesine aracılık eder ve sinaptik plastisitede önemli bir rol oynar. Kalsiyum sinyallemesini incelemek, nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmenin yollarını bulmak için de önemlidir. Nöromüsküler kavşak, sadece bir tür nörotransmittere sahip olduğu için sinaptik plastisiteyi incelemek için uygun bir modeldir. Bu makalede, kalsiyuma duyarlı bir boyanın kesilmiş sinir demeti boyunca farelerin motor sinir uçlarına yüklenme yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, bazal kalsiyum seviyesi ve kalsiyum geçici gibi hücre içi kalsiyum değişiklikleriyle ilgili tüm parametrelerin tahmin edilmesini sağlar. Kalsiyumun hücre dışından sinir terminallerine akışı ve kalsiyuma duyarlı boyaya bağlanması/çözülmesi birkaç milisaniye aralığında gerçekleştiğinden bu olayları kaydetmek için hızlı bir görüntüleme sistemi gereklidir. Gerçekten de, yüksek hızlı kameralar hızlı kalsiyum değişimlerinin kaydedilmesi için yaygın olarak kullanılır, ancak düşük görüntü çözünürlüğü parametrelerine sahiptirler. Burada kalsiyum geçici kaydı için sunulan protokol, konfokal mikroskopi tarafından sağlanan son derece iyi mekansal-zamansal çözünürlüğe izin verir.

Preparatı sunulan tekniğe göre boya ile yükledikten sonra, sinir kütüğüne yakın bulunan sinapsların çoğu yeterli bir floresan seviyesine sahipti (bkz. Şekil 2). Boya ile hazırlama yüklendikten ve tarif edilen kayıt ve görüntü işleme yöntemi uygulandıktan sonra, istenen mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip kalsiyum geçicileri elde edildi (bkz. Şekil 4). Kalsiyum geçicisi önerilen yöntemle geri kazanılmıştır (bkz. Şekil 3).
<p c...

Protokol, kesilmiş sinirden fare motor sinir terminallerine floresan kalsiyum boyası yükleme yöntemini açıklar. Ek olarak, konfokal mikroskopi kullanarak periferik sinir uçlarındaki hızlı kalsiyum geçicilerini kaydetmek için benzersiz bir yöntem sunulmuştur.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Presinaptik kalsiyum seviyesinin tahmini, sinaptik iletimin incelenmesinde önemli bir görevdir. Kalsiyum sinyallemesini incelemek, nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmenin yollarını bulmak için de önemlidir. Sunulan yükleme tekniğinin temel avantajı, boyamanın sadece ilgilenilen hücreler için yapılmış olmasıdır.Kalsiyum uyumsuzluğunu kaydetme yöntemimiz son derece iyi mekansal-zamansal çözünürlük sağlar. Sunulan kayıt yöntemi, konfokal mikroskop kullanarak hızlı periyodik süreçleri kaydetmesi gereken nörofizyologlar için yararlı olabilir. Yükleme tekniğindeki en zor adım, siniri pipetin içinde tutmaktır.Pipetin çapı mükemmel bir şekilde oturmalıdır, bu yüzden birkaç tane yapın. Protokoldeki tüm adımların karmaşık olduğunu bilmek ve her birini göstermek çok yardımcı olacaktır. Elastomer kaplı Petri kabında levator auris longus kas dokusunu ince paslanmaz çelik pimlerle hafifçe gerilmiş bir şekilde sabitleyerek başlayın ve kas tamamen kaplanana kadar Ringer'ın çözeltisini tabağa ekleyin.Ardından, hücre içi kayıtlar için ince keskin uçlu bir mikropipet hazırlamak üzere bir mikropipet çektirici kullanın. İç filamentler olmadan kılcal damarlar kullanın. Konikliği aşındırıcı ile puanladıktan sonra, mikropipet ucunu kırın ve bir ucu çapı yaklaşık 100 mikrometreye kadar açık bırakın.Ardından, iç çap 80 mikrometreden 12 mikrometreye düşene kadar ucu ateşle cilalayın. İşiniz bittiğinde, bir tarafa silikon bir tüp ve doldurma pipetinin diğer tarafına iğnesiz bir şırınga takın. Bir stereo mikroskop altında, sinir gövdesinin ayrı sinir dallarına dönüştüğü yeri bulun.Dolgu pipetini balmumu kullanarak Petri kabının üzerine yerleştirin ve ardından pipet ucunu sinirin üzerinde durana kadar hareket ettirin. Siniri kas lifine yakın ince makasla kesin, sinir kütüğünün yaklaşık bir milimetre uzunluğunda küçük bir parçasını bırakın. Ardından, sinir kütüğünü, siniri sıkıştırmadan, bir miktar Ringer çözeltisi ile doldurma pipetinin ucuna aspire edin.İşiniz bittiğinde, silikon tüpü doldurma pipetinden çıkarın. Daha sonra, boya yükleme çözeltisini çizmek için uzun bir filamentli bir şırınga kullanın. Daha sonra, filament ucunu yükleme çözeltisi ile doldurma pipetine yerleştirin ve karışımı sinir kütüğüne bırakın, ardından sinir preparatını karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Kuluçkadan sonra, sinir preparatını taze Ringer çözeltisi ile durulayın ve iki saat boyunca 25 santigrat derecede bir cam kapta 50 mililitre Ringer çözeltisi ile işlemden geçirin. Konfokal mikroskopi için, sinir preparatını silikon elastomer kaplı bir deney odasına monte edin ve hafifçe gerilmiş bir dizi çelik mikroiğne ile sabitleyin. Daha sonra, preparatı Ringer'ın çözeltisi ile kapsamlı bir şekilde durulayın.Odaya bir emme elektrodu takın. Hazırlama odasını mikroskop aşamasına monte ettikten sonra, giriş ve çıkış bağlantı parçalarını odaya yerleştirin. Fazla çözeltiyi preparattan çıkarmak için yerçekimi akışına bağlı bir sistemi açın.İşiniz bittiğinde, uyarıcı emme elektrodunu bir elektrik stimülatörüne takın ve uyaranlardan sonra kas kasılmalarının meydana gelmesini sağlayın. Daha sonra, perfüzyon sistemini 10 mikromolar d-tubokurarin içeren Ringer çözeltisi ile doldurun ve perfüzyonu başlatmak için perfüzyon emme pompasını açın. Lazer taramalı konfokal mikroskopta veya LSCM yazılımında, görüntüleme parametrelerini ayarlamak için elektrofizyoloji ve edinme modunu seçin.İş menüsü ayarlarında, uyarıcıyı mikroskop senkronizasyon darbesiyle tetiklemek için tetik ayarlarını seçin ve kare alanındaki tetikleyiciyi OUT 1 kanalına ayarlayın. Tarama modunu 1.400 hertz tarama frekansında XYT'ye çevirin. İğne deliği tamamen açıkken yakınlaştırma faktörü 6,1 olmalıdır.Sıralı, transpasif, çift yönlü X modunun açık olduğundan emin olun, ardından 52 milisaniyelik bir kare oluşturmak için minimum süreyi ayarlayın ve ham bir videoda kareleri 20 karede toplayın. Argon lazerin uyarma dalga boyunu çıkış gücünün% 8'i ile 488 nanometreye ayarlayın. Parametreler ayarlandığında, boya ile yüklenen sinir terminallerinin canlı önizlemesini almak için canlı mod düğmesine basın.Canlı modda, en iyi odağı elde etmek için ilgilenilen bölgeyi veya YG'yi arayın. Ardından, uyarıcıdaki gecikmeyi önceki değere göre iki milisaniye daha az değiştirin ve her bir diziyi bir öncekinden iki milisaniye kaydırarak 26 dizi elde etmek için veri toplama yazılımını çalıştırın. Çekilen videoları işlemek için Leica Application Suite X veya LAS X yazılımını çalıştırın ve oluşturulan projeyi açın.Ardından, çerçeveleri hedef klasöre TIF formatında kaydetmek için dışa aktar ve kaydet'e tıklayın. Ardından, ImageJ yazılımını çalıştırın ve dosyaya, içe aktarmaya ve görüntü dizisine tıklayın. Görüntü dizisini aç penceresinde, hedef klasörü seçin ve ilk kareyi açın.Sıra seçeneklerinden, başlangıç görüntüsü alanına gidin ve kare numarasını ilk kare için bir olarak ayarlayın. Ardından, artış alanında, Tamam'ı tıklatmadan önce değeri ilk sinyal kaydındaki kare sayısına eşit olarak ayarlayın. Dikişli ilk karelerin oluşturulan dosyasını ayrı bir klasöre kaydetmek için, dosya, kaydet ve klasör sekmelerini sırayla tıklatın.Başlangıç görüntüsü alanında karşılık gelen kare numarasını ayarlayarak 19 kare için prosedürleri tekrarlayın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, başlangıç görüntüsünde ve artış alanlarında birini seçmek için dosyaya, içe aktarmaya ve görüntü dizisine tıklayın. Tüm karelerin artan zamansal çözünürlükte bir araya getirildiği son video görülebilir.Ardından, video dosyasını TIF biçiminde kaydedin. Dikişli videoyu analiz etmek için görüntüye, yığınlara, araçlara ve yığın sıralayıcıya tıklayın. Ardından analiz, araçlar ve yatırım getirisi yöneticisi'ne gidin.Daha önce kaydedilmiş TIF dosyasını sürükleyip ImageJ penceresine bırakın ve daha iyi bir görünüm için görüntüyü genişletin. Görüntü görselleştirmesini geliştirmek için, parlaklık kontrastını otomatik olarak açmak için resme tıklayın, ayarlayın. YG çizerek ve YG yöneticisine değer katarak arka planı sinir terminaline yakın bir yere ayarlayın.Ardından, daha fazla ve çoklu ölçüye tıklayarak arka planı hesaplayın. E-tablo programına yapıştırmak için ortalama değerleri kopyalayın. Ardından, ortalama değeri hesaplayın.Ardından, işlem, ana ve çıkar'a tıklayarak hesaplanan ortalama değeri yığınlardan çıkarın. Elde edilen değeri girin ve YG yöneticisine eklemeden önce bir çokgen çizgisi aracılığıyla bir sinir terminalinin etrafına YG çizin. Daha fazla ve çoklu ölçüm sekmelerine tıklayarak sinir terminalinin geçici yoğunluğunu ölçün.Ardından, ortalama yoğunluk değerlerini kopyalayın ve sinyallerin ortalama ofsetini hesaplamak için bunları elektronik tablo programına yapıştırın. Sinyal değerlerini ortalama ofset değerine bölün. Elde edilen değerden birini çıkarın ve% 100 ile çarpın, ardından genliği belirlemek için bir kalsiyum geçici grafiği çizin.Sinir preparatını bir boya ile yükledikten sonra, sinapsın çoğu sinir kütüğüne yakın bir yerde bulunur, yeterli bir floresan seviyesine işaret eder. Görüntü işleme sonrasında istenilen uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip kalsiyum geçiciliği elde edildi. Bu protokoldeki en önemli adımlardan biri, sinir kütüğünün, siniri kestikten sonraki ilk birkaç dakika içinde boya içeren çözeltiye yerleştirilmesi gerektiğidir.Bu yöntem, motor nöronlara çeşitli boyalar ve ilaçlar yüklemek için kullanılabilir. Kayıt protokolü, CNS preparatlarındaki dendritlerde ve dikenlerde kalsiyumun değerlendirilmesinde yararlı olabilir. Tekniğimiz, iyi mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip bir kalsiyum sinyalinin kaydedilmesini sağlar.Kalsiyum geçiciliğini incelemek, bir nörotransmitter salınımının ve sinaptik plastisitenin araştırma düzenlemesinde güçlü bir araçtır.

registration-calcium-transients-mouse-neuromuscular-junction-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Yüksek çözünürlüklü Ca Detayları...

Odak Ca 2 +</supDüz kas> Geçici Algılama

Kaynak: Heredia, D. J., et. al. Fare diyaframının üçlü sinapsında hücreye özgü kalsiyum sinyalinin ex vivo görüntülemesi. J. Vis. Uzm.  (2018) Bu video floresan görüntülemeyi göstermektedir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade eden transgenik bir farede nöromüsküler kavşaklarda (NMJ'ler) kalsiyum dinamikleri. Bir NJM, frenik sinir ile diyaframdaki floresan etiketli asetilkolin reseptörleri ile tanımlanır. Aynı anda birden fazla sinyali görselleştirmek için bir görüntü ayırıcı...

Transgenik Bir Farenin Diyaframındaki Nöromüsküler Kavşaklarda Kalsiyum Dinamiğinin Floresan Görüntülemesi

Kaynak: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In Situ Ca2+ Enterik sinir sisteminin görüntülenmesi. J. Vis. Uzm.  (2015)Bu video kalsiyumu göstermektedir fare Kolonik Myenterik pleksus preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini görselleştirmek ve analiz etmek için görüntüleme.

Bir Fare Kolonik Myenterik Pleksusunda Enterik Nöron ve Glia Aktivitelerinin Kalsiyum Görüntülemesi

Kaynak: Bancroft, E. A., {{}} ve diğerleri. Spontan Ca2+{{}} Akıları ve Aşağı Akış Etkilerinin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm.  (2020) {{TAG_ 46}}Bu video, fare embriyolarından türetilen ventral orta beyin nöronlarındaki kalsiyum akışının gerçek zamanlı görselleştirmesini göstermektedir. Bir kalsiyum indikatörünü ifade etmek için viral bir vektör kullanılarak, nöronlar, spontan ve nörotransmitter kaynaklı kalsiyum aktivitesi sırasında floresan yoğunluğundaki değişiklikleri izlemek için konfokal bir...

Fare Embriyolarından Türetilen Ventral Orta Beyin Nöronlarında Kalsiyum Akışının Görselleştirilmesi

Kaynak: Kulkarni, M. et al. Fare retinasının koni fotoreseptörü akson terminallerinde Ca2+ dinamiği. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, transgenik bir fare retinasının koni fotoreseptörlerindeki kalsiyum dinamiklerini izlemek için iki foton mikroskobunun kullanımını göstermektedir. Arka plan aydınlatması ve ışık stimülasyonu altında kalsiyum seviyelerini ölçmek için retina dilimleri hazırlama, FRET tabanlı kalsiyum biyosensörlerini görüntüleme ve floresan değişikliklerini analiz etme adımlarını ana...

Fare Retina Koni Fotoreseptörlerinde Kalsiyum Dinamiğini İzlemek için İki Foton Mikroskobu

Kaynak: Zhilyakov, NV ve diğerleri, Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Yüksek Zamansal Çözünürlüğe Sahip Fare Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Akımlarının Kaydı. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, konfokal mikroskopi kullanılarak sinir uçlarında hızlı kalsiyum geçişlerinin kaydedilmesine yönelik görüntüleme tekniğini göstermektedir. Siniri uyararak ve kalsiyum bağlayıcı boyalardan gelen floresan değişikliklerini yakalayarak, sinir ucundaki dinamik kalsiyum akışını ve klerensini görselleştirerek...

Fare Sinir Uçlarında Hızlı Kalsiyum Geçişlerinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görüntülenmesi

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Burada, sinir uçlarına kurbağa sinir kütüğünden kalsiyuma duyarlı bir boya yüklemek için bir yöntem açıklıyoruz. Ayrıca, periferik sinir uçlarında hızlı kalsiyum geçişlerinin kaydedilmesi ve analizi için bir protokol de sunuyoruz.

Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Öğrenin fare nöromüsküler kavşağında konfokal mikroskopi ile yüksek zamansal çözünürlükte kalsiyum geçici maddeleri kaydetme yöntemini. Bu teknik sinaptik iletim ve nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için önemli bilgiler sunar.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Daha fazla video keşfet