Name: Troca específica de resíduo de Proline por Análogos Proline em Proteínas Fluorescentes: Como a Cirurgia Molecular da espinha dorsal afeta o dobrável e a estabilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda a incorporar análogos de prolina em proteínas fluorescentes para estudar o dobramento e a estabilidade proteica. Este método de cirurgia molecular permite manipular propriedades proteicas com precisão em engenharia de proteínas.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis) à T.F. e N.B. e pelo Ministério da Educação e Ciência (Programa BMBF "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) ao F.-J.S. e T.M.T.T.

Os autores revelam todos e quaisquer conflitos de interesse.

Na natureza, manipulações com estruturas e funções proteicas ocorrem tipicamente devido a mutações, o fenômeno que leva à troca de uma identidade aminoácido em determinadas posições na sequência proteica. Este mecanismo natural é amplamente aplicado como método biotecnológico para engenharia proteica sob a forma de mutagênese, e conta com o repertório dos 20 aminoácidos canônicos envolvidos no processo. A troca de resíduos de prolina é problemática, no entanto. Devido à sua arquitetura especial de grupo backbone, dificilmente é intercambiável com os 19 resíduos restantes para substituição72. Por exemplo, proline é tipicamente conhecido como um disjuntor de estrutura secundária em sequências de polipeptídeos devido à sua baixa compatibilidade com as estruturas secundárias mais comuns, ou seja, α-hélice e β-strand. Esta característica proline é facilmente perdida quando o resíduo é mutado para outro aminoácido do repertório comum. A substituição da prolina por seus análogos químicos oferece uma abordagem alternativa, que permite manter as características básicas da espinha dorsal do resíduo prolina pai, ao mesmo tempo em que impõe viés em suas transições conformais específicas ou produz modulações do volume molecular e polaridade. Por exemplo, é possível fornecer culturas bacterianas com estruturas analógicas como hidroxy-, fluoro-, alquilo-, dehidroprolinas, estruturas com tamanhos variáveis de anel e muito mais, facilitando assim a produção de uma proteína contendo alterações específicas de resíduos proline.
O método de incorporação de pressão seletiva (SPI) descrito neste estudo permite uma substituição global, ou seja, específica de resíduos de todas as prolines na proteína alvo com análogos químicos relacionados. A importância do método é refletida pelo fato de que a SPI permite criar mudanças de sequência inacessíveis às técnicas comuns de mutagênese. Por exemplo, permite a produção de uma proteína-alvo contendo pequenas alterações estruturais que normalmente não excedem uma ou duas substituições/exclusões/adições de átomos, como demonstrado neste estudo. Tais modificações proteicas são apelidadas de "mutações atômicas"73,74. Em uma proteína fluorescente como a GFP, o resultado dessa intrusão molecular pode ser visto na velocidade da dobra, polaridades locais, embalagem de proteínas, estabilidade das características estruturais envolvidas. As mudanças nas propriedades de absorção e fluorescência são produzidas indiretamente devido ao impacto na dobra de proteínas e microambientes de resíduos. A precisão das alterações moleculares realizadas pelo SPI é tipicamente muito maior, em comparação com mutações de prolines a outros resíduos canônicos, sendo esta última tipicamente prejudicial para a dobra, produção e isolamento de proteínas.
Como método de produção, a abordagem SPI utiliza a tolerância do substrato do bolso de sintetizador aminoacila-tRNA para análogos químicos do aminoácido nativo. A sintetose é responsável pela identificação correta da estrutura do aminoácido, enquanto a incorporação em proteínas ocorre a jusante no processo de tradução. Instrumentalmente, a produção, isolamento e purificação de proteínas em SPI são realizadas de forma típica para quaisquer outras técnicas de expressão de proteína recombinante; no entanto, com algumas adições ao protocolo da seguinte forma: Proline, que está destinada à substituição, é fornecida no início do processo de fermentação, de tal forma que as células possam crescer e desenvolver suas máquinas celulares intactas. No entanto, a cultura celular não é permitida a atingir a densidade óptica máxima, para manter as células na fase logarítmica ideal para a expressão proteica. Existem duas grandes variações do método SPI neste momento. No primeiro, a concentração de prolina é ajustada no meio de crescimento inicial (um meio quimicamente definido) de tal forma que o esgotamento da prolina acontece sem qualquer intrusão externa. As células esgotam proline no meio antes de poderem sair da fase de crescimento logarítmico, e então, posteriormente, o analógico é adicionado, e a proteína da produção de juros é induzida. Na segunda versão do método, as células são cultivadas no meio contendo proline até o meio de sua fase logarítmica. Neste ponto, as células devem ser retiradas e fisicamente transferidas para outro meio, que não contém mais proline, apenas o analógico, com posterior indução da proteína de interesse. Em ambas as versões, o reagente analógico e de indução de proteína são fornecidos às células pré-cultivadas. O isolamento e purificação da proteína do tipo selvagem são realizados da mesma forma que para as variantes. Em princípio, todas as cepas pró-auxotróficas disponíveis podem ser usadas como um hospedeiro de expressão. No entanto, testes de expressão para identificar o hospedeiro mais adequado são aconselháveis. Além disso, testes de diferentes mídias quimicamente definidas podem ser usados para otimizar o rendimento da proteína.
Existem certos requisitos relativos aos análogos químicos que precisam ser considerados para sPI, como solubilidade e concentração. A disponibilidade metabólica e a absorção de aminoácidos dependem do número de moléculas dissolvidas no meio. Para aumentar a solubilidade de um determinado composto, podem ser escolhidas condições ligeiramente ácidas ou alcalinas. Uma vez que as moléculas artificiais podem causar efeitos inibitórios de crescimento devido à sua toxicidade celular, a concentração deve ser reduzida ao mínimo, a fim de evitar o estresse celular75.
Uma pequena fraqueza do SPI é a diminuição da eficiência de incorporação com maior número de posições que precisam ser trocadas. Em princípio, uma redução da frequência de aminoácidos dentro da biomolécula alvo por mutagênese dirigida ao local pode resolver esse problema. No entanto, as propriedades estruturais e funcionais de uma proteína desejada podem ser afetadas pela mudança da estrutura primária.
Como mencionado anteriormente, o SPI permite a substituição específica do resíduo do aminoácido canônico. Isso implica que aminoácidos não canônicos são inseridos em todas as posições do aminoácido canônico dentro da proteína alvo, incluindo resíduos conservados que são indispensáveis para a função proteica ou dobra. Métodos alternativos para incorporação específica do local são a única possibilidade de superar esse problema3. Nas últimas décadas, foi desenvolvido o método de par ortogonal que pode produzir proteínas contendo resíduos modificados em locais predefinidos. A modificação mais comum deste método é conhecida como supressão de códon stop. Este método é baseado em um sistema de tradução ortogonal projetado dedicado à incorporação específica do local de aminoácidos sintéticos76. Mais de 200 aminoácidos com diferentes modificações da cadeia lateral foram incorporados em proteínas até o momento usando esta abordagem77. No entanto, esses sistemas de tradução ainda não são adequados para inserções de análogos proline em proteínas-alvo. Além disso, o desempenho do método é considerado baixo no caso de pequenas modificações de aminoácidos porque alguma promiscuidade de fundo da síntese aminoacílico-tRNA normalmente permanece nos sistemas de tradução projetados.
Usando SPI, produzimos uma série de variantes de proteína fluorescente de β canos e estudamos os resultados da troca de proline com seus análogos não naturais. No caso da substituição proline por R-Flp e Dfp, uma proteína disfuncional foi produzida pelo hospedeiro de expressão. O efeito é provavelmente produzido por dobras proteicas. Este último pode se originar da conformação C 4-exo promovida pela R-Flp, que é desfavorecido pelas estruturas proteicas dos pais27. Com o Dfp, é provável que o descomposto seja produzido pela velocidade reduzida da isomerização da ligação de peptídeo trans-para-citídeo no resíduo proline27. Sabe-se que este último está entre os passos limitantes no perfil cinético da dobra de proteína que afeta a formação β-barril e a subsequente maturação do cromoforeiro. De fato, para ambos os aminoácidos, R-Flp e Dfp, a produção de proteína resultou em uma proteína agregada e insolúvel. Consequentemente, a formação do cromoforo não pôde ocorrer, e a fluorescência foi perdida completamente. Com S-Flp e Dhp, no entanto, observou-se a maturação adequada da proteína, resultando em amostras de proteína fluorescente para cada combinação analógica/proteica. Apesar de algumas modulações nas características de absorção e fluorescência da proteína, estas permaneceram em grande parte semelhantes às das proteínas do tipo selvagem. O efeito da substituição do aminoácido foi revelado nos estudos cinéticos redobrados. Este último mostrou uma redobramento mais rápida no caso de substituição por S-Flp. Estudos de modelo mostraram que esse resíduo pode gerar alguma melhora na velocidade de rotação de amide trans-para-cis e levar à formação da conformação C 4-endo. Ambos os fatores provavelmente contribuirão para os efeitos cinéticos benéficos desse resíduo no EGFP. Em contraste, a Dhp produziu perfis de dobramento cinéticos extremamente semelhantes à proteína dos pais. A diversidade dos desfechos produzidos por meras mutações atômicas nas proteínas fluorescentes examinadas ilustra o potencial do método de produção de SPI na alteração das propriedades proteicas-alvo. As alterações proteicas induzidas pela substituição proline pelos análogos têm implicações adicionais na engenharia das enzimas 78,79,80 e nos canais ion 81,82, bem como na engenharia geral da estabilidade proteica.
A limitação básica do método SPI é o seu modo "tudo ou nenhum" na troca de proline reside com análogos relacionados. Seria de grande vantagem poder selecionar com precisão, quais resíduos de prolina devem ser substituídos pelos análogos, e quais devem permanecer não modificados. No entanto, no momento, não há nenhuma técnica que possa realizar uma produção tão sofisticada usando um hospedeiro de produção microbiana. A síntese química das proteínas83,84, bem como a produção livre de células85,86, são os dois métodos alternativos que podem produzir modificações proline específicas de posição. No entanto, sua complexidade operacional e baixo rendimento de produção os tornam inferiores em relação à produção em células vivas. A partir de agora, o SPI continua sendo a abordagem mais operacionalmente simples e robusta para a produção de proteínas complexas portadoras de mutações atômicas. Ao introduzir substitutos de aminoácidos não naturais, o método permite modificar características proteicas de forma direcionada, conforme exemplificado aqui por alterações na dobradura e absorção/emissão de proteínas fluorescentes geradas por substituições de prolina.

Mutagênese clássica dirigida por local permite a permutação de qualquer sequência de proteína codificada por genes existentes por manipulação de codon no nível de DNA. Para estudar a dobra de proteínas e a estabilidade, muitas vezes é desejável substituir aminoácidos semelhantes por contrapartes semelhantes. No entanto, a mutagênese proteica tradicional é definitivamente limitada a substituições estruturalmente semelhantes entre aminoácidos canônicos como Ser/Ala/Cys, Thr/Val, Glu/Gln, Asp/Asn, Tyr/Phe, que estão presentes no repertório padrão do código genético. Por outro lado, não existem tais possibilidades para outros aminoácidos canônicos como Trp, Met, His ou Pro, que muitas vezes desempenham papéis estruturais e funcionais essenciais nas proteínas1. Uma abordagem ideal para estudar essas interações no contexto da arquitetura interna altamente específica das proteínas e seu processo de dobramento é gerar modificações isostericas sem interrupções. De fato, quando os análogos isotéricos desses aminoácidos canônicos, também conhecidos como aminoácidos não canônicos (ncAAs), são inseridos em proteínas, permitem mudanças sutis mesmo no nível de átomos únicos ou grupos átomos como H/F, CH2/S/Se/Te conhecidos como "mutações atômicas"2. Essa "cirurgia molecular" produz proteínas alteradas cujas propriedades resultam apenas da troca de átomos únicos ou grupos de átomos, que em casos favoráveis podem ser analisados, e as alterações detectadas podem ser racionalizadas. Dessa forma, o escopo da síntese proteica para estudar a dobra de proteínas e a estrutura é estendido muito além da mutagênese clássica do DNA. Observe que as proteínas geradas pela mutagênese dirigida ao local são geralmente referidas como "mutantes", enquanto proteínas com aminoácidos canônicos substituídos são referidas como "variantes" 3, "aoproteínas"4 ou "congêneres proteicos"5.
A proteína fluorescente verde (GFP), identificada pela primeira vez no organismo marinho Aequorea victoria, exibe fluorescência verde brilhante quando exposta à luz ultravioleta-azul 6,7. Hoje em dia, o GFP é comumente usado como uma ferramenta de rotulagem altamente sensível para visualização rotineira da expressão genética e localização de proteínas em células através de microscopia fluorescente. A GFP também se mostrou útil em diversos estudos biofísicos 8,9,10 e biomédicos11,12, bem como em engenharia de proteínas 13,14,15. A análise rigorosa da estrutura GFP possibilitou a criação de inúmeras variantes caracterizadas pela estabilidade variada e fluorescência máxima16,17. A maioria das variantes GFP utilizadas na biologia celular e molecular são proteínas monoméricas tanto em solução quanto no cristal18. Sua principal organização estrutural é típica para todos os membros da família GFP, independente de sua origem filogenética, e consiste em 11 β-strands formando um chamado β-barril, enquanto uma α-hélice torcido está correndo pelo centro do barril e carrega o cromoforeiro (Figura 1A). A maturação autocatática do cromoóforo (Figura 1B) requer o posicionamento preciso das cadeias laterais ao seu redor no local central da proteína; muitas dessas cadeias laterais são altamente conservadas em outras variantes GFP19. Na maioria das proteínas fluorescentes de águas-vivas como a Aequorea victoria, o cromoóforo emissor verde consiste de dois anéis aromáticos, incluindo um anel de fenol de Tyr66 e a estrutura heterocíclica de cinco membros de imidazolinona (Figura 1B). O cromoforo, quando devidamente incorporado na matriz proteica, é responsável pela fluorescência característica de toda a proteína. Está localizada no centro da estrutura, enquanto a estrutura do barril a isola do meioaquoso 20. A exposição do cromoforo à água a granel resultaria em fluorescência saciando, ou seja, perda de fluorescência21.
A dobra adequada da estrutura semelhante ao barril é essencial para proteger o cromoforoforo contra a fluorescência saciando22. Os resíduos proline (Pro) desempenham um papel especial na organização estrutural da GFP23. Por serem incapazes de suportar uma β-fios, eles constituem laços de conexão responsáveis pela manutenção da estrutura proteica como um todo. Não surpreende que 10-15 resíduos de prolina são encontrados tanto em GFPs derivados de Aequorea quanto em Anthoathecata; alguns deles são altamente conservados em outros tipos de proteínas fluorescentes β-barril. Espera-se que as prolines influenciem criticamente as propriedades dobráveis devido às suas características geométricas peculiares. Por exemplo, em GFPs derivados da Aequorea, dos dez resíduos proline (Figura 2A), nove formam trans e apenas um forma uma ligação cis-peptídeo (Pro89). Pro58 é essencial, ou seja, não intercambiável com o resto dos 19 aminoácidos canônicos. Este resíduo pode ser responsável pelo posicionamento correto do resíduo Trp57, que tem sido relatado como crucial para a maturação do cromoforo e o GFP total dobrável24. O fragmento PVPWP com três resíduos de prolina (Pro54, Pro56, Pro58) e Trp57 é a parte essencial da "tampa inferior" na estrutura GFP da Figura 1A. O motivo estrutural PVPWP é encontrado em várias proteínas, como citocromias e canais de potássio ativados por tensão eucariótica25. Substituições pró-alanina nas posições 75 e 89 também são prejudiciais à expressão proteica e à dobra e abolim a maturação do cromoforino. Pro75 e Pro89 fazem parte da "tampa superior" que enterra o cromoforo (Figura 1A) e são conservados em proteínas fluorescentes de 11 canções β barris23. Essas duas "tampas" mantêm o cromoforoforo excluído do solvente aquoso, mesmo quando a estrutura terciária estável foi parcialmente quebrada26. Tal arquitetura molecular específica protege o fluoróforo da fluorescência collisional (dinâmica) saciando, por exemplo, por água, oxigênio ou outros ligantes difusíveis.
Para realizar a engenharia molecular da estrutura GFP, deve-se introduzir substituições de aminoácidos na estrutura primária da proteína. Inúmeras mutações foram realizadas no GFP, fornecendo variantes com estabilidade elevada, dobramento rápido e confiável e propriedades de fluorescênciavariável 17. No entanto, na maioria dos casos, a mutação de resíduos de prolina é considerada uma abordagem arriscada devido ao fato de que nenhum dos 19 aminoácidos canônicos restantes pode restaurar adequadamente o perfil conformacional do resíduo proline27. Assim, desenvolve-se uma abordagem alternativa, na qual os resíduos de prolina são substituídos por outras estruturas baseadas em prolina, apelidadas de análogos proline28. Devido à sua estrutura química cíclica única, a proline exibe duas transições conformais características (Figura 1C): 1) o enrijecimento do anel proline, um processo rápido que implica a organização da espinha dorsal, que afeta principalmente o ângulo de torção φ, e 2) a isomerização de ligação de peptídeo cis/trans, um processo lento que impacta a dobra da espinha dorsal através dos ângulos de torção ωrs. Devido à sua natureza lenta, a última transição é comumente responsável pelas etapas limitantes da taxa no processo de dobramento de toda a proteína. Foi demonstrado anteriormente que a isomerização de laços/trans de peptídeos em torno de alguns resíduos de prolinação apresenta passos lentos na dobra de variantes GFP. Por exemplo, a formação do vínculo cis-peptídeo no Pro89 apresenta o passo lento no processo de dobramento porque depende da transição de vínculo de trans para cis29. Uma redobramento mais rápida pode ser alcançada após a substituição do Pro89 por um loop de peptídeo totalmente trans, ou seja, abolindo um evento de isomerização cis-to-trans 30. Além da isomerização cis/trans, as transições mais pucker também podem gerar mudanças profundas na dobra de proteínas devido à organização da espinha dorsal e embalagem dentro do interior da proteína27,31.
Modificações químicas resultam em alteração das transições conformais intrínsecas dos resíduos prolinais, afetando assim a capacidade da proteína de dobrar. Certos análogos prolinas são candidatos particularmente atraentes para a substituição de proline em proteínas, pois permitem a manipulação e estudo das propriedades dobráveis. Por exemplo, (4R)-fluoroprolina (R-Flp), (4S)-fluoroprolina (S-Flp), 4,4-difluoroprolina (Dfp) e 3,4-dehydroproline (Dhp) são quatro análogos (Figura 1D) que diferem minimamente da prolina em termos de volume molecular e polaridade32. Ao mesmo tempo, cada análogo exibe um toque distinto: S-Flp estabiliza o disco C 4-endo, R-Flp estabiliza o disco C4-exo, Dfp não exibe nenhuma preferência aparente de pucker, enquanto Dhp aboli o puckering (Figura 1D)33. Usando esses análogos na estrutura proteica, pode-se manipular com a transição conformacional dos resíduos prolinais, e com isso, afetar as propriedades das variantes GFP resultantes.
Neste trabalho, pretendemos incorporar o conjunto designado de análogos proline (Figura 1D) na estrutura das variantes GFP utilizando o método de incorporação de pressão seletiva (SPI, Figura 3)34. A substituição de resíduos de aminoácidos por seus análogos isoestruturais mais próximos é um conceito biotecnológico aplicado no desenhode proteínas 35,36. Assim, os efeitos dos análogos prolinatos em uma proteína modelo ilustram seu potencial para servir como ferramentas na engenharia de proteínas37. A produção de proteínas contendo análogos desejados foi realizada em cepas modificadas de E. coli que não são capazes de produzir proline (proline-auxotrofia). Assim, poderiam ser forçados a aceitar a substituição de substratos no processo de biosíntese proteica38. Esta substituição global de prolina é habilitada pela flexibilidade natural do substrato das sintetizações aminoáclicas endogensas39, as enzimas-chave catalisando a esterificação de tRNAs com aminoácidosapropriados 40. Em geral, conforme descrito na Figura 3, o crescimento celular é realizado em meio definido até que a fase de crescimento logarítmico seja alcançada. Na etapa seguinte, o aminoácido a ser substituído é intracelularmente esgotado do sistema de expressão durante a fermentação e posteriormente trocado pelo analógico ou ncAA desejado. A expressão proteica-alvo é então induzida para incorporação de aminoácidos não canônicos específicos de resíduos. A substituição do aminoácido cognato pelo seu análogo ocorre de forma proteome-wide. Embora esse efeito colateral possa ter um impacto negativo no crescimento da cepa hospedeira, a qualidade da produção de proteína-alvo não é afetada principalmente, uma vez que, na expressão recombinante, os recursos celulares são principalmente direcionados para a produção da proteína-alvo41,42. Portanto, um sistema de expressão fortemente regulado e indutível e fortes promotores são cruciais para a alta eficiência de incorporação43. Nossa abordagem baseia-se na incorporação de múltiplos ncAAs específicos em resposta a códons de sentido (redesignação de códons de sentido), pelo qual, dentro do gene alvo, o número de posições para inserção analógica Pro pode ser manipulado através da mutagênese direcionada ao local44. Uma abordagem semelhante foi aplicada em nosso relatório anterior sobre a preparação de peptídeos recombinantes com propriedades antimicrobianas45. Neste trabalho, aplicamos o método SPI, que permite que todos os resíduos de prolina sejam substituídos por análogos relacionados, para gerar proteínas que se espera possuir propriedades físico-químicas distintas não presentes em proteínas sintetizadas com o repertório de aminoácidos canônicos. Ao caracterizar o perfil de dobra e fluorescência das variantes resultantes, pretendemos mostrar os efeitos das substituições atômicas em variantes de GFP.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrila</td><td>VWR</td><td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA para LC-MS, 83642</td><td>Grau LC-MS necessário</td></tr><tr><td>Solução aquosa de acrilamida e bisacrilamida a uma proporção de 37,5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Ágar-ágar</td><td>Carl Roth</td><td>5210</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de amónio ((NH4)2MoO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidissulfato de amônio (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.2</td><td>&ge; 98 %, a.a., grau ACS necessário</td></tr><tr><td>Sulfato de amônio ((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Carl Roth</td><td>K029</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brillant Blue R 250</td><td>Carl Roth</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (CuSO4)</td><td>Carl Roth</td><td>CP86.1</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Carl Roth</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Bis-(dimetilamino)-etano,&nbsp; N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td>&ge; 99 %, p.a., para eletroforese</td></tr><tr><td>de 1,4-ditiotreitol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>P749.1</td><td></td></tr><tr><td>hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>X987</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 (forma de hidrogênio)</td><td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, EUA)</td><td>10731181</td><td>resina de permuta catiónica</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>VWR</td><td>HiPerSolv CHROMANORM para LC-MS, 84865</td><td>Grau LC-MS necessário</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Carl Roth</td><td>3738.5</td><td>100 %, p. a.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Carl Roth</td><td>X998</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogênio chlroide (HCl)</td><td>Merck</td><td>295426</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de ferro (II) (FeCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Carl Roth</td><td>AE73.1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4)</td><td>Carl Roth</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de manganês (MnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63535</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Carl Roth</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Carl Roth</td><td>7156</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>T879</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (NaC12H25SO4)</td><td>Carl Roth</td><td>0183</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Tris (Tris-HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)-aminometano (Tris)</td><td>Carl Roth</td><td>5429</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Carl Roth</td><td>8952</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Carl Roth</td><td>2363</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de zinco (ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr><tr><td>L-alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8381</td><td></td></tr><tr><td>L-aspártico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-ácido glutâmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2128</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-histidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-serina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-triptofano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-tirosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-valina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-fluoroprolina</td><td>Bachem</td><td>4033274</td><td>Certifique-se de que todos os análogos da prolina estejam livres de prolina, verifique o conteúdo. Caso contrário, inclua uma etapa para consumir contaminações por prolina durante a expressão.</td></tr><tr><td>(4R)-fluoroprolina</td><td>Bachem</td><td>4033275</td><td>Certifique-se de que todos os análogos da prolina estejam livres de prolina, verifique o conteúdo. Caso contrário, inclua uma etapa para consumir contaminações por prolina durante a expressão</td></tr><tr><td>3,4-desidroprolina</td><td>Bachem</td><td>4003545</td><td>Certifique-se de que todos os análogos da prolina estejam livres de prolina, verifique o conteúdo. Caso contrário, inclua uma etapa para consumir contaminações de prolina durante a expressão</td></tr><tr><td>4,4-difluoroprolina</td><td>Enamine</td><td>EN400-17448</td><td>Certifique-se de que todos os análogos de prolina estejam livres de prolina, verifique o conteúdo. Caso contrário, inclua uma etapa para consumir contaminações por prolina durante a expressão</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de poliestireno (Falcon), Tubos</td> cônicos de poliestireno (Falcon) <td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td></td>de 15 mL</tr><tr>, Membrana de diálise <td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td>de<td>50 mL</td></tr><tr><td>, Corte de peso molecular (MWCO) 5.000</td><td>Spectrum Medical Industries</td><td>Spectra/Por MWCO 5000 membrana de diálise, 133198</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados (IMAC) coluna 1 mL, Ni-NTA</td><td>GE Healthcare</td><td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer-Lock, 5 mL</td><td>Seringa Carl Roth</td><td>EP96.1</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock, 20 mL</td><td>Seringa Carl Roth</td><td>T550.1</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock, 50 mL</td> Tubos de microcentrífuga <td>Carl Roth</td><td>T552.1</td><td></td></tr><tr><td>, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>Placas de Petri (poliestireno, estéril)</td><td>Carl Roth</td><td>TA19</td><td></td></tr><tr><td>pQE-80L plasmídeo vector</td><td>Qiagen</td><td>já não disponível</td><td>substituído por N-terminus pQE Conjunto de vetores Cat No./ID: 32915</td></tr><tr><td>Pro-auxotrófico E. coli estirpe JM83</td><td>Addgene</td><td>50348</td><td>https://www.addgene.org/50348/</td></tr> <tr><td>Pró-auxotrófico E. coli estirpe JM83</td><td>ATCC</td><td>35607</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de fundo redondo, 14 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>Corning Falcon, 14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0.45 &micro; m com membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF)</td><td>Carl Roth</td><td>CCY1.1</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para LC-ESI-TOF-MS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 Coluna de HPLC, 3 &micro; m tamanho de partícula, 10 cm x 2,1 mm</td><td>com inserções de vidro cônicas de 0,1 mL, tampas de rosca e septos</td></tr><tr><td>Frascos de amostrador automático de HPLC 1,5 mL</td> Espectrômetro de massa <td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco 854165</td><td></td></tr><tr><td>para LC-ESI-TOF-MS</td><td>Agilent</td><td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td> Software de análise de dados de espectrometria de <td></td></tr><tr><td>massa</td><td>Agilent</td><td>MassHunter Software de análise qualitativa v. B.06.00</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada para tubos Eppendorf de 1,5 mL Eppendorf</td><td></td><td>5427 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de resfriamento para tubos Falcon de 50 mL</td> Sistema de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) <td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>&Auml; Espectrômetro de fluorescência puro KTA 25 L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Perkin Elmer</td><td>LS 55</td><td></td></tr><tr><td>Microfluidizer de alta pressão para ruptura de células bacterianas</td><td>Microfluídica</td><td>série LM com " Z&rdquo; </td><td></td>câmara de tipo</tr><tr><td>Agitador orbital para cultivo bacteriano</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica para cromatografia líquida (LC)</td><td>GE Healthcare</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador ultra-sônico para ruptura celular bacteriana</td><td>Omnilab</td><td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td><td>com ponta sonificadora MS72</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis</td><td>Biochrom</td><td>ULTROSPEC 2100</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis/NIR</td><td>Perkin Elmer</td><td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td><td></td></tr></tbody></table>

troca específica de resíduo de proline por análogos proline em proteínas fluorescentes: como a "cirurgia molecular" da espinha dorsal afeta o dobrável e a estabilidade

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

A substituição de resíduos proline (Pro) em proteínas pela mutagênese tradicional dirigida ao local por qualquer um dos 19 aminoácidos canônicos restantes é muitas vezes prejudicial à dobra de proteínas e, em particular, à maturação do cromoforino em proteínas fluorescentes verdes e variantes relacionadas. Uma alternativa razoável é manipular a tradução da proteína para que todos os resíduos Pro sejam substituídos especificamente por análogos, um método conhecido como incorporação de pressão seletiva (SPI). As modificações químicas incorporadas podem ser usadas como uma espécie de "cirurgia molecular" para dissecar finamente mudanças mensuráveis ou mesmo manipular racionalmente diferentes propriedades proteicas. Aqui, o estudo demonstra a utilidade do método SPI para estudar o papel das prolines na organização da estrutura típica β-barril de variantes espectrais da proteína fluorescente verde (GFP) com prolines 10-15 em sua sequência: proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP), NowGFP e KillerOrange. Os resíduos pro estão presentes na conexão de seções entre β-fios individuais e constituem as tampas de fechamento do andaime do barril, sendo assim responsável pelo isolamento do cromoforo da água, ou seja, propriedades de fluorescência. Experimentos seletivos de incorporação de pressão com (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp) e 3,4-dehidroproline (Dhp) foram realizados utilizando uma cepa proline-auxotropo E. coli como hospedeiro de expressão. Descobrimos que as proteínas fluorescentes com S-Flp e Dhp são ativas (ou seja, fluorescentes), enquanto os outros dois análogos (Dfp e R-Flp) produziram proteínas disfuncionais e mal dobradas. A inspeção dos perfis de absorção e emissão de fluorescência UV-Vis mostrou poucas alterações características nas proteínas que contêm análogos Pro. O exame dos perfis cinéticos dobráveis nas variantes EGFP mostrou um processo acelerado de re dobrar na presença de S-Flp, enquanto o processo foi semelhante ao tipo selvagem na proteína que contém Dhp. Este estudo mostra a capacidade do método SPI de produzir modificações sutis de resíduos proteicos a um nível atômico ("cirurgia molecular"), que podem ser adotadas para o estudo de outras proteínas de interesse. Ilustra os resultados das substituições de prolina com análogos químicos próximos nas propriedades dobráveis e espectroscópicas na classe de proteínas fluorescentes de β barris.

Para superar as limitações da mutagênese clássica dirigida ao local, os análogos proline com modificações específicas foram incorporados em várias proteínas fluorescentes. Mostramos como a substituição do hidrogênio por flúor ou do single por dupla ligação em resíduos de prolina ("cirurgia molecular") afeta propriedades proteicas fundamentais, incluindo sua dobra e interação com a luz.

Troca específica de resíduo de Proline por Análogos Proline em Proteínas Fluorescentes: Como a "Cirurgia Molecular" da espinha dorsal afeta o dobrável e a estabilidade

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

Na maioria dos casos, a mutagênese convencional dirigida ao local não é apropriada para estudar o papel funcional das prolinas em proteínas. Aqui, apresentamos um método para incorporar análogos prolinas como aminoácidos não canônicos em proteínas ribosicamente sintetizadas para investigar o papel dos resíduos de prolina em dobras e funções de proteínas. A substituição de prolines por aminoácidos padrão é uma abordagem arriscada.A incorporação de análogos prolinas permite uma espécie de cirurgia molecular. Em outras palavras, introduz mudanças moleculares sutis para influenciar racionalmente e manipular propriedades proteicas. Uma vez que os resíduos de prolinação desempenham um papel essencial na estabilidade dos andaimes proteicos, nossa tecnologia pode ser útil para entender as razões por trás dos déficits de dobramento de proteínas, que estão por trás de certos estados patológicos em humanos.As alterações proteicas induzidas por substituições prolinas têm implicações para a engenharia biotecnológica das enzimas e oferecem oportunidades para o aprimoramento da tradução ou dobra da proteína ribossômica. Este método não requer equipamentos especiais e instrumentação cara. Deve-se tomar cuidado especial com as etapas de protocolo, nas quais a prolina nativa é esgotada das culturas E.coli antes da adição de análogos proline.Para iniciar a produção das proteínas fluorescentes com prolina nativa, inocular 200 mililitros de meio NMM fresco em um frasco erlenmeyer de dois litros com dois mililitros da cultura da noite para o dia. Incubar as células a 37 graus Celsius em um agitador orbital a 220 RPM por aproximadamente 3,5 horas. Durante a incubação, meça a densidade óptica em 600 nanômetros em um espectotômetro a cada 30 minutos.Quando a densidade óptica atingir 0,7, gire a suspensão celular e decante suavemente o supernatante em resíduo. Em seguida, lave as células reutilizando em 50 mililitros de NMM gelado sem aminoácidos ou NMM sem prolina. Gire as células novamente e decante o supernatante em lixo.Em seguida, resuspenque a pelota celular por tubulação suave em 200 mililitros de NMM sem proline e complementado com ampicilina em um frasco Erlenmeyer de dois litros, e incubar as células em um agitador orbital por 30 minutos para permitir o esgotamento completo da prolina. Após a incubação, adicione um volume apropriado de L-proline ou os análogos prolinas das soluções de estoque de 50 mililitros para obter uma concentração final de um mililitro na suspensão celular. Em seguida, induzir a expressão proteica alvo adicionando 500 iPTG de 500 micromolar de uma solução de estoque de um molar.Expresse a proteína alvo durante a noite a 37 graus Celsius em um agitador orbital e meça a densidade óptica no dia seguinte. Recolher as células bacterianas por centrifugação e decantar o supernante em resíduos. Em seguida, lave as células com tubos cuidadosos em 50 mililitros de tampão de ligação contendo 10% de glicerol.Gire as células novamente, decante o supernante, e armazene a pelota celular em um tubo de 50 mililitros a menos 20 ou 80 graus Celsius até usar mais. Antes de avaliar a emissão de fluorescência, realize um SDS-PAGE para garantir que a pureza da amostra esteja acima de 95%, em seguida, ajuste as amostras de cada variante proteica purificada para uma concentração de 0,3 micromoles, tomando o valor de absorção calculado no comprimento de onda apropriado como referência. Certifique-se de que o volume final aproximado da amostra seja de 200 microliters.Deixe as amostras diluídas equilibrarem-se à temperatura ambiente. Após uma hora, transfira as amostras para um cuvette de quartzo de um centímetro e meça o espectro de emissão de fluorescência das amostras usando um espectrômetro de fluorescência. Para induzir a desnaturação, dilui as amostras de cada variante proteica vinte vezes adicionando os dois microliteres de 300 amostras de micromolar a 18 microliters de 1,11X PBS tampão contendo 8,89-molar ureia e 5,56 mililitros DTT.Incubar as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, diluir as amostras 100 vezes adicionando 1.980 microliters de PBS contendo DTT de cinco mililitros para induzir renaturação e transferir imediatamente 200 microliters das amostras em um cuvette de quartzo de um centímetro. Insira o cuvette de quartzo em um espectrômetro de fluorescência apropriado e monitore a redobramento da proteína adquirindo um espectro de fluorescência a cada três segundos ao longo de 30 minutos.Transfira as amostras de reabascamento em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro, em seguida, feche a tampa e armazene as amostras à temperatura ambiente no escuro para permitir o reabascamento completo das variantes EGFP. Após 24 horas, meça a emissão de fluorescência das amostras de proteína reamostos usando o mesmo comprimento de onda de excitação de antes para capturar o ponto final temporal da recuperação da fluorescência. Pelotas de células expressando proteína nativa e variantes com S-fluoroproline e dehydroproline tinham uma cor brilhante típica devido ao cromoforo intacto.Em contraste, variantes contendo R-fluoroproline e difluoroprolina permaneceram incolores, indicando dobras erradas e deposição de proteína desdobrada em corpos de inclusão. A análise SDS-PAGE verificou a presença de proteínas insolúveis contendo r-fluoroprolina. Em contraste, proteínas nativas e variantes de s-fluoroprolina e dehydroprolina foram encontradas nas frações solúveis.Na análise de cromatografia líquida/espectrometria de massa, cada substituição de proline por S-fluoroproline produziu uma mudança positiva de 18-dalton por resíduo de prolina, enquanto a substituição por dehidroprolina produziu uma mudança negativa de dois daltons por resíduo. Em espectrância de absorção e emissão de luz, a absorção de cromoforeiros foi encontrada em 488 nanômetros para EGFP e 493 nanômetros para NowGFP. Em KillerOrange, a região de absorção de cromoforeiro era composta por duas bandas correspondentes a dois possíveis estados configuracionais e de carga do complexo cromoforeiro.Além disso, espectros de fluorescência registrados após excitação nos comprimentos de onda máximo de absorção correspondentes implicavam que os análogos não alteravam o ambiente químico dos cromóforos. Em experimentos de reamosscação, a fluorescência cromopária nativa de EGFP recuperou-se parcialmente, embora a fluorescência específica do triptofano tenha sido maior após a renaturação. Foi observado comportamento semelhante para a variante contendo dehidroprolina.Em S-fluoroproline contendo EGFP, um resultado semelhante foi observado com uma excitação de 295 nanômetros, enquanto a fluorescência recuperou-se em uma extensão muito maior em 488 nanômetros. Apenas as variantes EGFP mostraram cinética de remassagem rápida com a recuperação de emissões de triptofano sendo duas vezes mais rápida em comparação com a emissão de cromoforeiro. Devem ser utilizadas culturas bacterianas frescas com meios de crescimento adequados.Técnicas estéreis e monitoramento regular do crescimento da cultura também são importantes pré-requisitos para o sucesso do experimento. Este método é aplicável à engenharia proteica, pois permite estudar o papel de outros aminoácidos canônicos. Para isso, são necessárias cepas auxotróficas adequadas de E.coli e análogos de aminoácidos.A espectrometria de massa de proteínas inteiras é necessária como evidência analítica para confirmar a incorporação de análogos de aminoácidos não canônicos. O método SPI para incorporar análogos prolinas permite manipular diretamente o backbone proteico, e oferece vantagens para o design racional e facilitar a produção de proteínas através da estabilização global e melhoria da tradução ribossômica ou dobrável.

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Troca específica de resíduo de Proline por Análogos Proline em Proteínas Fluorescentes: Como a "Cirurgia Molecular" da espinha dorsal afeta o dobrável e a estabilidade

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