Name: Síntese Microfluiídica de Blocos de Construção de Microgel para andaime de partículas recíprocas microporosas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a síntese microfluídica de microgéis monodispersos para andaimes microporosos em medicina regenerativa. Este método de alto rendimento permite controle preciso da porosidade e integração tecidual.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de reconhecer Joe de Rutte e o Laboratório Di Carlo da Universidade da Califórnia, Los Angeles, por sua ajuda com o design original do dispositivo microfluido do qual o dispositivo relatado foi desenvolvido, bem como sua orientação inicial na fabricação de dispositivos PDMS e solução de problemas. Esquemas de figuras foram criados com Biorender.com.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+microislands+in+microporous+annealed+particle+scaffolds+for+accelerated+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing.</a> Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337(2021).</li>
<li>Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+spatially+patterned+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogels+for+tissue+repair+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications.</a> Advanced Science. 5 (11), 1801046(2018).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Pruett, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microporous+annealed+particle+hydrogel+for+long-term+vocal+fold+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation.</a> Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).</li>
<li>Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+microporous+annealing+particle+%28MAP%29+hydrogels+in+the+stroke+cavity+reduces+gliosis+and+inflammation+and+promotes+NPC+migration+to+the+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion.</a> Advanced Materials. 29 (32), (2017).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Schaeffer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microannealed+porous+scaffold+for+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration.</a> Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Jivan, F., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal%2C+site-selective+conjugation+of+recombinant+proteins+to+microporous+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering.</a> Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148(2020).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+kinetics+of+thiol-maleimide+Michael-type+addition+gelation+kinetics+for+the+generation+of+homogenous+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomaterials. 101, 199-206 (2016).</li>
<li>Sandell, J. L., Zhu, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in-vivo+optical+properties+of+human+tissues+and+its+impact+on+PDT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT.</a> Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Este protocolo descreve métodos para sintetizar e caracterizar microgéis, que servem como blocos de construção para andaimes de partículas recadas microporos (MAP). Este protocolo utiliza uma abordagem microfluidica de alto rendimento para gerar grandes volumes de microgéis uniformes, que não podem ser alcançados com outros métodos como microfluidos com foco de fluxo 1,4,7,9 (alta monodisperiência, baixo rendimento), emulsão em lote 6,10 e eletros rezando 5,12 (baixa monodispersidade, alto rendimento). Com os métodos descritos aqui, microgel monodisperse podem ser feitos para uso em andaimes MAP que podem ser usados para uma variedade de aplicações de medicina regenerativa (por exemplo, parto celular, cicatrização de feridas).
Um passo crítico deste protocolo é a criação dos dispositivos microfluidos PDMS. Se os dispositivos não forem feitos corretamente, isso pode ter efeitos negativos a jusante na formação de microgel e na monodispersidade. É importante evitar a introdução de artefatos (ou seja, bolhas, poeira) no PDMS antes de curar, uma vez que isso poderia entupir os canais e impactar significativamente a formação de microgel. Para atenuar isso o máximo possível, deve-se usar fita para remover qualquer poeira, armazenar os dispositivos em um recipiente sem poeira e trabalhar em um capô sem poeira, se possível. Também é recomendado armazenar os dispositivos a 60 °C para obter os melhores resultados com o tratamento superficial.
Ao derramar os dispositivos PDMS, é importante manter uma espessura uniforme que seja quase igual ou inferior ao comprimento do soco da biópsia. Se o dispositivo for muito grosso, o soco da biópsia será incapaz de penetrar todo o caminho. Também é crucial não rasgar as entradas/saída do dispositivo PDMS enquanto perfura com o soco da biópsia e/ou inserção de tubos. Uma ruptura no dispositivo PDMS causará vazamento das entradas/saída, o que pode causar a perda da solução precursora do gel. Se houver vazamento em um dispositivo PDMS, a melhor solução é substituí-lo por um novo dispositivo o mais rápido possível.
Ao tratar o dispositivo por plasma, o uso de oxigênio puro e tratamento de plasma para 30 s produziu os melhores resultados para aderir PDMS ao escorregador de vidro. Se o dispositivo não se ligar corretamente (ou seja, o PDMS ainda pode ser levantado da lâmina de vidro após o tratamento de plasma), deve-se verificar duas vezes se o tratador de plasma está funcionando corretamente e que o dispositivo e os slides foram completamente limpos. Também é importante usar o tratamento correto da superfície de silano e, para melhores resultados, os dispositivos PDMS devem ser tratados diretamente pela superfície antes do uso. Outros métodos de tratamento superficial, como a deposição de vapor químico, também poderiam ser utilizados.
Outro passo crucial é usar os dispositivos microfluidos PDMS corretamente para a formação de microgel. Recomenda-se o uso de uma relação de fluxo de pelo menos 2:1 (este protocolo usa uma taxa de fluxo de óleo de 6 mL/h e uma taxa de fluxo aquoso de 3 mL/h), mas isso pode ser ajustado para alcançar o tamanho desejado do microgel. O pH da solução precursora do microgel também é uma métrica importante para otimizar para evitar entupimento do dispositivo. A solução salina tamponada com fosfato (PBS) acelera a formação de tioolato na química de adição do tipo Michael, e as concentrações de PBS utilizadas neste protocolo produzem os melhores resultados para a gelação de microgel nos dispositivos microfluidos. Uma vez iniciadas as bombas de seringa, pode haver algumas bolhas nos canais microfluidos, mas isso deve se equilibrar após alguns minutos. Recomenda-se monitorar a formação de microgel com um microscópio. Se o fluxo não se parece como neste vídeo e/ou há alguns canais produzindo partículas grandes, isso provavelmente se deve a problemas com a etapa de tratamento da superfície. A melhor solução é substituir o dispositivo por um que tenha sido recentemente tratado pela superfície.
Se os microgel parecem estar se fundindo, isso pode ser devido a uma concentração insuficiente de FluoroSurfactant. A solução recomendada é aumentar o wt% do surfactante na fase do óleo. No entanto, uma limitação ao uso de altas concentrações de surfactante é que pode ser mais difícil de remover durante a etapa de purificação. Recomenda-se o uso de dispositivos microfluidos apenas uma vez, mas os dispositivos podem ser reutilizados se lavados com óleo Novec imediatamente após o uso para remover qualquer solução aquosa que possa gelar no dispositivo e entupir os canais. Enquanto um dispositivo microfluido pode produzir um volume de alta produtividade de microgels (mL/h), essa taxa de produção pode ser dimensionada usando vários dispositivos microfluidos em paralelo.
A etapa de ressaramento do conjunto de andaimes MAP baseia-se no uso de um fotoin iniciador ativado pela luz de polimerização radical, e o fotoinitiador pode ser selecionado com base na aplicação desejada. Por exemplo, o fotoinitiador LAP tem tempos de ressaríndia rápidos (<30 s) ao usar luz UV de ondas longas, que tem impacto mínimo na viabilidade celular in vitro14. No entanto, esse comprimento de onda é altamente absorvido pelo tecido16 e pode não ter uma eficácia de ressaramento in vivo como in vitro.
Eosin Y é outro fotoinitiador ativado por comprimentos de onda visíveis (505 nm) e tem penetração mais profunda no tecido, o que aumenta a capacidade do andaime MAP a ser revido sob o tecido. No entanto, os longos tempos de exposição à luz necessários para o ressarem eosin y podem prolongar a exposição celular a radicais livres e impactar a viabilidade celular in vitro14. O uso desses métodos para a geração de alta produtividade de blocos de construção de microgel altamente uniformes acelerará a pesquisa focada em andaimes MAP e avançará o conhecimento no campo de materiais porosos injetáveis para medicina regenerativa.

A plataforma de andaime MAP é um biomamaterial injetável composto inteiramente de micropartículas de hidrogel (microgésis) que fornecem microporosidade em escala celular quando interligadas, o que permite migração celular independente da degradação e integração de tecido a granel1. Devido à sua capacidade de integrar-se rapidamente com o tecido hospedeiro e a imunogenicidade inerentemente baixa, a plataforma de andaime MAP demonstrou aplicabilidade pré-clínica para uma ampla variedade de terapias medicinais regenerativas 2,3,4,5,6,7,8,9,10, incluindo aceleração da cicatrização de feridas dérmicas 1,3 11, revascularizando a cavidade do derrame cerebral7, fornecendo células-tronco mesenquimais2, e fornecendo volume de tecido para tratar insuficiência glotática6. A MAP também tem sido demonstrada para transmitir efeitos anti-inflamatórios para hospedar tecidos através do recrutamento de macrófagos M23 e pode até mesmo ser sintonizado para promover uma resposta imune th2 "reparação tecidual"8. Essas propriedades favoráveis da plataforma de andaime MAP permitem que ela seja expandida para uma gama diversificada de aplicações clínicas.
Métodos publicados anteriormente para geração de microgéis para formação de andaimes MAP incluíram gotículas-microfluidics com foco de fluxo 1,4,7,9, eletros rezando 5,12 e fiação aérea com emulsão em lote 6,10. O método microfluido gotícula pode produzir partículas com alta monodispersidade, mas usa taxas de fluxo muito lentas que produzem baixos rendimentos de partículas (μL/h). Alternativamente, os métodos de emulsão eletros e em lote podem produzir um alto volume de partículas, mas com alta polidispersidade de partículas. Este protocolo utiliza um método microfluido de alto rendimento para produzir microgels com uma população monodisperse, com base no trabalho de De Rutte et al13. Este método utiliza técnicas de litografia macia para fazer um dispositivo microfluido de polidimtilsiloxano (PDMS) a partir de um fotomask, que é então ligado a um slide de vidro. O design do dispositivo conta com a emulsificação de passos para gerar um alto volume de partículas de microgel (mL/h). A monodispersidade que pode ser alcançada com este método proporciona um controle superior da porosidade em comparação com outras técnicas, uma vez que microgéis monodisperses podem formar andaimes com tamanhos de poros mais uniformes2.
Os métodos de sintetização e caracterização dos microgéis individuais que podem atuar como blocos de construção para andaimes MAP são descritos dentro deste manuscrito, especificamente em termos de criação de microgels que consistem em uma espinha dorsal PEG com um grupo de maleimida (MAL), que prontamente participa da adição eficiente do tipo Michael com crosslinkers estacionários para gelação de microgel. Para desvincular a gelação de microgel da map scaffold annealing, este manuscrito também descreve como sintetizar um macromer de annealing personalizadode 14 , MethMAL, que é um macromer PEG heterofuncional/maleimida de 4 braços. Os grupos funcionais de metanfetamina participam prontamente da fotopolimerização livre-radical (para recozimento de microgel), mantendo-se relativamente inertes às condições que promovem a adição do tipo Michael para os grupos funcionais MAL.
Além disso, este manuscrito descreve os protocolos para a criação de dispositivos microfluidos PDMS, determinando cinética de gelação de microgel e caracterizando o tamanho do microgel. A parte final do manuscrito detalha o enlatado map, que é quando os microgels são transicionados in situ em um andaime a granel através de um passo secundário, foto-iniciado crosslinking que covalentemente une as superfícies dos microgels. É importante notar que existem outros métodos de ressaramento que podem ser implementados em sistemas de andaimes MAP que não dependem de químicas baseadas em luz, como o ressarem mediado por enzimas, como descrito anteriormente1. No geral, esses métodos podem ser usados diretamente ou usados com diferentes químicas de formulação de hidrogel (por exemplo, à base de ácido hialurônico) para gerar andaimes MAP para qualquer aplicação.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de 2-aminoetanetiol</td><td>Acros Organics</td><td>AC153770250</td><td>para síntese de metamal MW: 113,61 Da</td></tr><tr><td>rotor de placa de 35 mm</td><td>HAAKE</td><td>P35/Ti</td><td>Geometria para viscosímetro HAAKE</td></tr><tr><td>4 braços PEG-Maleimide (10 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-100MA</td><td>Para solução precursora de microgel</td></tr><tr><td>4 braços PEG-Maleimide (20 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporação</td><td>SUNBRIGHT PTE-200MA</td><td>Para Síntese de Métodos Peso molecular específico para cada lote</td></tr><tr><td>Seringa BD com Pontas Luer-Lok Becton</td><td>Dickinson</td><td></td><td>Seringas de plástico descartáveis</td></tr><tr><td>Punção de biópsia</td><td>Mitex</td><td>MLTX33-31A-P/25</td><td>1,5 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Clorofórmio-d</td><td>Acros Organics</td><td>AC209561000</td><td>Para Síntese de Métodos</td></tr><tr><td>Luz LED colimada Fonte:</td><td>ThorLabs</td><td>M365LP1-C1</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>Placa de cultura (15 cm)</td><td>Corning</td><td>CLS430599</td><td>150 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>DMTMM(4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina-2-il)-4-metil-morfol, cloreto)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>151882</td><td>For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da</td></tr><tr><td>Fluorosurfactant</td><td>Ran Technologies</td><td>008-Flurosurfactant-5wtH-200G</td><td>5 porcentagem em peso de 008- Flurosurfactante em HFE7500 Sistema de</td></tr><tr><td>Liofilização Tríade FreeZone</td><td>Série Labconco</td><td>7400000</td><td>Para Síntese MetMal Lâminas de vidro liofilizador</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Lâminas de vidro liso, não revestidas</td></tr><tr><td>Viscosímetro HAAKE Rheowin</td><td>HAAKE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>versão 1.8.0_172</td></tr><tr><td>Seringa de Duplo Pino KDS Legato 210 Bomba</td><td>Kd Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Driver de LED</td><td>ThorLabs</td><td>DC2200</td><td></td></tr><tr><td>Lítio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td>Fotoiniciador</td></tr><tr><td>Ácido Metacrílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>155721</td><td>para Síntese MetMal MW: 86,09 Da Densidade: 1,015g / mL</td></tr><tr><td>Dispositivo microfluídico SU8-Si wafer mestre</td><td>FlowJem</td><td>N / A</td><td>Feito sob medida, com silanização</td></tr><tr><td>MMP-2 reticulador degradável</td><td>FlowJem</td><td></td><td>Sequência: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2</td></tr><tr><td>Agulhas (25 G, chanfradas)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Comprimento: 15,88 mm Calibre: 0,5 mm</td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>3M</td><td>7100025016</td><td>Óleo fluorado</td></tr><tr><td>Oxigênio</td><td>Praxair</td><td>UN1072</td><td>Tubo Peek comprimido</td></tr><tr><td></td><td>Trajan Scientific</td><td>03-350-523</td><td>1/32" Diâmetro Externo; 0.02" Diâmetro Interno; 10' Comprimento</td></tr><tr><td>PFOCTS (tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Para tratamento de superfície</td></tr><tr><td>Tamponado com Fosfato Salino</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP3994</td><td>Diluído a 1x em água ultrapura, pH = 7.4</td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RGD peptídeo adesivo celular WatsonBio</td><td>Sciences</td><td></td><td>Sequência: Ac-RGDSPGGC-NH2</td></tr><tr><td>Rheowin software</td><td>HAAKE&nbsp;</td><td></td><td>Software compatível com lâmina de bisturi de viscosímetro HAAKE</td></tr><tr><td></td><td>Bard-Parker</td><td>371210</td><td>Tamanho: #10</td></tr><tr><td>Cabo de bisturi</td><td>Bard-Parker</td><td>371030</td><td>Tamanho: #3</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>Para Síntese MetMal MW: 58.44 Da</td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit de elastômero de silicone</td><td>DOW Chemical</td><td>2065622</td><td>Base e agente de cura</td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4884-100</td><td>Para Síntese Metamal MW: 101.19 Da Densidade: 0.73g/mL</td></tr><tr><td>Tubulação Tygon</td> Saint <td>Gobain Performance Plastics</td><td>AAD04103</td><td>ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm</td></tr><tr><td>Espectrômetro Varian Inova 500</td><td>Varian</td><td></td><td>NMR Localizado na Instalação de Ressonância Magnética Biomolecular UVA</td></tr></tbody></table>

síntese microfluiídica de blocos de construção de microgel para andaime de partículas recíprocas microporosas

Microfluidic Synthesis of Microgel Building Blocks for Microporous Annealed Particle Scaffold

A plataforma de andaimes de partículas renasal (MAP) microporos é uma subclasse de hidrogéis granulares. É composto por um chorume injetável de microgels que podem formar um andaime estruturalmente estável com porosidade em escala celular in situ após um passo secundário de crosslinking químico baseado em luz (ou seja, ressarcir). O andaime MAP tem mostrado sucesso em uma variedade de aplicações de medicina regenerativa, incluindo cicatrização de feridas dérmicas, aumento de dobra vocal e entrega de células-tronco. Este artigo descreve os métodos de síntese e caracterização de microgésis poli (etileno glicol) (PEG) como os blocos de construção para formar um andaime MAP. Esses métodos incluem a síntese de um macromer de enraizamento personalizado (MethMAL), determinação de cinética de gelação precursora de microgel, fabricação de dispositivos microfluidos, geração microfluidica de microgel, purificação de microgel e caracterização básica do andaime, incluindo dimensionamento de microgel e enraizamento de andaimes. Especificamente, os métodos microfluidos de alta produtividade descritos aqui podem produzir grandes volumes de microgel que podem ser usados para gerar andaimes MAP para qualquer aplicação desejada, especialmente no campo da medicina regenerativa.

O objetivo deste protocolo é delinear todas as etapas necessárias para sintetizar blocos de construção de microgel a serem usados em um andaime MAP. O macromer de relagem MethMAL é altamente seletivo e eficiente e é compatível com múltiplas espinhas polímeras14. É importante que pelo menos 67%-75% do PEG-maleimide de 20 kDa seja modificado com grupos funcionais de methacrilamida para garantir uma alta eficiência de ressarcer. A modificação percentual pode ser mais facilmente determinada analisando picosde espectro de 1 H-NMR, como mostrado na Figura 1. A cinética de gelação, determinada por um viscometro, é uma métrica importante a considerar para cada formulação de gel. Este protocolo usa uma solução precursora de gel que consiste em uma espinha dorsal PEG com um grupo MAL, que reage eficientemente com crosslinkers funcionalizados por thiol para gelação de microgel. No entanto, muitas químicas de hidrogel podem ser usadas para fabricar microgels através do método microfluido de alto rendimento descrito aqui. O tempo para o início da gelação fornecerá uma visão da duração da geração de microgel microfluido. Recomenda-se escolher um pH precursor de gel que possa iniciar a gelação entre 30 min (Figura 2) e 2 h.
Se o tempo de gelação for muito rápido, a solução precursora do gel começará a polimerizar dentro do dispositivo microfluido e entupir os canais. Além disso, é importante notar que a mudança das concentrações de ligantes thiolated (por exemplo, RGD) pode ter impactos na formação da rede durante a gelação e pode precisar ser contabilizada ajustando a formulação. As etapas de fabricação do dispositivo microfluido podem ser tediosas, mas os resultados representativos de um dispositivo ligado com sucesso são mostrados na Figura 3. Este protocolo utiliza um dispositivo microfluido de alta produtividade, paralelo, emulsificação de passos que foi adaptado a partir de um projeto de de Rutte et al.13, e a fabricação de wafer de silício foi terceirizada para uma empresa de tecnologia microfluidic. No entanto, as etapas descritas neste protocolo podem ser usadas com qualquer design de dispositivo gravado em uma fotomask de wafer de silício SU-8. É importante notar que o tamanho da etapa dos canais na máscara fotográfica deve ser otimizado durante a fabricação do dispositivo, pois impactará o tamanho das partículas de microgel.
As taxas de fluxo para a geração microfluida de microgels devem ser otimizadas para cada formulação de gel com base em fatores como tempo de gelação, tamanho de partícula desejada e design de dispositivo microfluido. Se usar o dispositivo de alto rendimento, as taxas de fluxo para a fase aquosa podem chegar a 5 mL/h. A Figura 4B mostra a configuração para dispositivos de alto rendimento usados neste protocolo. Se o dispositivo estiver funcionando corretamente, a formação de microgel deve ser semelhante à mostrada na Figura 4D. Antes da purificação, os microgels serão opacos. Depois de completar as várias lavagens de óleo, PBS e hexano, o gel deve parecer claro como a imagem representativa na Figura 5. Se incorporar um fluoróforo nos microgelos, o produto purificado pode ter uma leve tonalidade colorida, mas ainda deve estar perto da translúcida. Após a purificação e inchaço, os microgel devem ser muito uniformes de tamanho e ter um PDI entre 1,00 e 1,05, como mostrado na Figura 6. Vários fotoiniciais podem ser usados para fotoannealing andaimes MAP. Se usar uma alternativa ao LAP, descrita aqui, deve-se determinar a cinética de ressaramento como descrito anteriormente14. Além disso, várias fontes de luz podem ser usadas para fotoannealing, desde que a fonte de luz corresponda ao fotoinitiador. Deve-se ter certeza de calibrar e concentrar a fonte de luz. O tempo de ressaramento e a intensidade da luz podem precisar ser otimizados com base na formulação de gel e concentração de fotoiniciador. O método de ressaramento descrito neste protocolo pode ser utilizado para estudos in vitro e in vivo. Após a ressaração, os microgel formarão um andaime poroso que pode ser visualizado com microscopia de dois fótons (Figura 7B-C).

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para sintetizar os blocos de construção de microgel para andaime de partículas de annealed microporoso, que podem ser usados para uma variedade de aplicações de medicamentos regenerativos.

Síntese Microfluiídica de Blocos de Construção de Microgel para andaime de partículas recíprocas microporosas

The microporous annealed particle (MAP) scaffold platform is a subclass of granular hydrogels. It is composed of an injectable slurry of microgels that ...

A fabricação de alto rendimento de blocos de construção de microgel monodispers para andaimes de partículas recíprocas microporos fornecem um controle aprimorado da porosidade do andaime. Isso pode afetar o tamanho dos poros e os resultados subsequentes de integração tecidual. Este protocolo usa uma abordagem microfluida de alto rendimento para gerar grandes volumes de microgéis monodispersados que não podem ser alcançados com outros métodos, como microfluidos com foco de fluxo, emulsão em lote e eletros rezando.Os microgésis gerados podem ser formados em andaimes de partículas recadas microporos que são vantajosos para aplicações de medicina regenerativa devido à porosidade da escala celular que permite tecido rápido e crescimento. Comece preparando um slide de vidro por dispositivo microfluido PDMS. Use fita, ar filtrado ou lavações de álcool isopropílico para remover qualquer poeira do slide.Coloque um slide de vidro em um dispositivo PDMS deslize um ao lado do outro em uma tampa de placa de 96 poços e coloque-o em um limpador de plasma. Feche a porta e a válvula de fluxo de ar e ligue a bomba de vácuo. Deixe-o correr por pelo menos 30 segundos, e depois desligue.Conecte o tubo de gás do tanque de oxigênio à válvula de fluxo de ar. Deixe a câmara de plasma encher com oxigênio por 30 segundos, depois desligue o oxigênio e feche a válvula de fluxo de ar. Ligue a bomba de vácuo e coloque o nível de frequência de rádio em alta.Espere até que a câmara vire uma cor rosa violeta e deixe passar 30 segundos. Quando o temporizador se apagar, desligue o plasma e o vácuo e, em seguida, abra lentamente a válvula de fluxo de ar para liberar o vácuo. Remova a bandeja do limpador de plasma.Vire suavemente o dispositivo PDMS sobre a lâmina de vidro para relacioná-los. À medida que a ligação acontece, observe a pequena diferença na transparência do PDMS. Para obter os melhores resultados, armazene os dispositivos ligados a 60 graus Celsius até imediatamente antes do uso.Prepare o tratamento superficial diluindo o óleo PFOCTS e Novec e use um mililitro para três a quatro dispositivos. Transfira o volume para uma seringa de um mililitro e conecte uma agulha de calibre 25. Corte um pedaço de 10 a 12 centímetros de tubulação Tygon por dispositivo.Corte um pedaço de tubo PEEK aproximadamente uma polegada de comprimento. Insira um par de milímetros da tubulação PEEK na extremidade da tubulação Tygon para evitar que a agulha punca as entradas de tubos de Tygon. Tire os dispositivos da câmara aquecida e insira a extremidade não-PEEK da tubulação Tygon no orifício aquoso da entrada.Insira a agulha da seringa de tratamento de superfície na tubulação PEEK e cubra o orifício de saída da câmara de óleo. Injete o tratamento lentamente e certifique-o de encher o dispositivo sem bolhas. Aguarde as câmaras aquosas para encher primeiro, seguido pelos canais menores e depois pela câmara de petróleo.Remova a tubulação Tygon do dispositivo. Uma vez que o dispositivo tenha sido preenchido, deixe descansar por 10 minutos em temperatura ambiente. Encha uma seringa de cinco mililitros apenas com óleo e conecte uma agulha calibre 25.Aspire o tratamento superficial para fora do dispositivo através das entradas e saída. Insira tubos de Tygon na entrada aquosa. Insira a seringa com óleo na tubulação PEEK e lave cada dispositivo com óleo.Aspire o óleo do dispositivo. Repita a descarga de óleo duas vezes e remova a tubulação Tygon. Insira a extremidade não-PEEK da tubulação Tygon nas entradas dos dispositivos microfluidos.Insira o restante da tubulação Tygon sem tubo PEEK na extremidade na saída do dispositivo microfluido. Adicione pelo menos três mililitros de óleo a uma seringa de plástico de cinco mililitros e fixe-a a uma agulha calibre 25. Insira cuidadosamente a agulha na tubulação PEEK em uma das entradas tygon.Lave suavemente a tubulação e o dispositivo com óleo. Recolhe o óleo da tomada em um tubo cônico. Repita a descarga de óleo na outra entrada Tygon.Coloque as bombas de seringa nas taxas de fluxo desejadas. Conecte a seringa contendo o surfactante à entrada de óleo através de uma agulha de calibre 25 e distribua suavemente óleo suficiente para preparar a tubulação e o canal de óleo do dispositivo microfluido. Uma vez que o dispositivo e as entradas de óleo tenham sido configuradas, adicione 0,5 mililitros de óleo a uma nova seringa de cinco mililitros que conterá o precursor do gel.Use esta pequena quantidade de óleo para ajudar a lavar a solução precursora através do dispositivo microfluido. Em um tubo cônico, combine 1,5 mililitros da solução de backbone PEG e 1,5 mililitros da solução cross-linker. Vórtice por 30 segundos e transfira rapidamente a solução precursora de gel combinada para a seringa de cinco mililitros.Conecte a seringa com a solução precursora do gel à entrada aquosa através de uma agulha de calibre 25. Dispense suavemente solução suficiente para preparar a tubulação e o canal aquoso. Fixar as seringas nas bombas de seringa e pressionar a execução.Procure partículas de tamanho uniforme dos canais. Colete os microgéis da tomada em um tubo cônico. Uma vez que a gelação esteja completa, use uma pipeta para remover cuidadosamente a fase do óleo da parte inferior do tubo.Deposite isso em um recipiente de resíduos apropriado para resíduos fluorados. Adicione mais óleo no tubo de coleta de microgel. Misture invertendo suavemente o tubo de coleta.Deixe o tubo de coleta se contentar por cinco minutos para permitir que as fases se separem. Procure a fase do óleo na parte inferior e a fase aquosa do microgel na parte superior. Repita as lavagens de óleo pelo menos duas vezes mais.Adicione mais óleo com o gel como demonstrado anteriormente, em seguida, adicione PBS ao gel. Inverta para misturar várias vezes. Para separar as camadas, centrifugar o tubo a 2.000 RCF por cerca de 30 segundos.Procure a fase de óleo na parte inferior do tubo, gel no meio e PBS por cima. Remova a fase do óleo com uma pipeta e descarte-a em um recipiente de resíduos. Repita o óleo e o PBS lave duas vezes.Procure o gel para a transição de opaco para claro até a lavagem final. Remova todo o óleo. Não remova o PBS do tubo cônico.Em uma capa de fumaça química, use uma pipeta de vidro para adicionar hexanos ao tubo em um volume igual ao PBS. Vórtice o tubo cônico por 30 segundos ou até que esteja completamente misturado. Centrifugar a 4.696 RCF por cinco minutos.Após a separação, procure hexanes na camada superior, PBS no meio e gel na parte inferior. Remova a camada de hexano e descarte-a em um recipiente para resíduos orgânicos. Aspire a PBS.Repetir o hexano no PBS lava pelo menos duas vezes ou até que o gel pareça quase translúcido. Lave o gel com PBS mais uma vez para remover qualquer resíduo de hexano restante. Centrifugar a 4.696 RCF por cinco minutos e aspirar a camada PBS.Cerca de 67-75% dos 20 kilodalton PEG maleimide foram modificados com grupos funcionais de metanfetamina para garantir uma alta eficiência de ressarcer. A modificação percentual foi determinada analisando os picos de espectros 1H NMR. O início da gelação forneceu uma visão da duração da geração de microgel microfluido.Recomenda-se escolher pH precursor de gel que pode iniciar a gelação entre 30 minutos e duas horas. Após a purificação e inchaço, os microgels apresentaram tamanho uniforme e índice de polidispersidade entre 1,00 e 1,02 definido como população monodispersada. Após a ressarização, os microgel formaram um andaime poroso visualizado com microscopia de dois fótons.A conexão correta do dispositivo PDMS ao slide de vidro e o tratamento correto do dispositivo é crucial para o melhor desempenho do dispositivo microfluido. Esta técnica permite a produção rápida de blocos de construção de microgel uniformes para formar andaimes de mapa que podem ser usados para uma variedade de aplicações regenerativas in vivo, incluindo a cicatrização da ferida.

microfluidic-synthesis-microgel-building-blocks-for-microporous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Apresentamos um protocolo para sintetizar micro-hidrogéis Janus compostos inteiramente do mesmo material base, poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), com uma estrutura claramente compartimentada baseada na separação de fases de uma solução supersaturada de monômero NIPAAm. Os microhidrogéis Janus sintetizados apresentam propriedades únicas, como termorresponsividade anisotrópica e capacidade de carga organofílica/hidrofílica.

Síntese de Poli (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels para anisotrópica Thermo-resposta e Organophilic / Carregando Capability hidrofílico

Propomos uma técnica simples de automontagem de nanopartículas coloidais de sílica para criar uma junção nanofluídica entre dois microcanais em polidimetilsiloxano (PDMS). Usando esta técnica, uma membrana de grânulo nanoporosa com um tamanho de poro de até ~ 45 nm foi construída dentro de um microcanal e aplicada à pré-concentração eletrocinética de amostras de DNA.

Criação de Sub-50 nm nanofluidic Junções em PDMS Microfluidic Chip via processo de automontagem de coloidal Particles

Aqui, descrevemos a fabricação e operação de um sistema microfluídico de camada dupla feito de polidimetilsiloxano (PDMS). Demonstramos o potencial deste dispositivo para aprisionamento, direcionando a via de coordenação de um material molecular cristalino e controlando reações químicas em estruturas presas no chip.

Gaiolas pneumáticas microfluídicos: uma nova abordagem para In-chip de cristal Trapping, Manipulação e controlada Tratamento Químico

Os protocolos são descritos para a fabricação de hidrogel degradáveis thermoresponsive baseado no hidrazona cross-linking de oligômeros polímeros na escala a granel, microescala e escala nanométrica, último para preparação do gel de nanopartículas e nanofibras.

Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

Desenvolveu-se uma estratégia de fabricação de aditivos para processamento de hidrogel UV-ligado. Esta estratégia permite a montagem de camada por camada de estruturas de hidrogel de microfabricated, bem como a montagem de componentes independentes, produzindo dispositivos integrados contendo componentes móveis que são responsivos a atuação magnética.

Um aditivo fabricação técnica para a preparação fácil e rápida de Micromachines baseada em hidrogel com componentes magneticamente responsivos

Ensaios de gotículas de água em óleo são úteis para química analítica, evolução enzimático e análise de células únicas, mas normalmente requerem microfluidos para formar as gotículas. Aqui, descrevemos a emulsificação de modelos de partículas, uma abordagem microfluida livre para realizar ensaios de gotículas.

Emulsificação de modelos de partículas permite ensaios de gotículas livres de microfluídicos

Este trabalho descreve métodos simples, adaptáveis e de baixo custo para fabricar microgels com fragmentação de extrusão, processar os microgésis em hidrogéis granulares injetáveis e aplicar os hidrogéis granulares como tintas de impressão extrusão para aplicações biomédicas.

Fragmentando hidrogéis a granel e processando em hidrogéis granulares para aplicações biomédicas

Hastes de microgel com grupos reativos complementares são produzidas via microfluídica com a capacidade de se interligar em solução aquosa. Os microgéis anisométricos encravam e se interligam em construções estáveis com poros maiores em comparação com sistemas baseados em esféricos. Microgéis modificados com GRGDS-PC formam construções 3D macroporosas que podem ser usadas para cultura celular.

Andaimes 3D macroporosos interligados de hastes de microgel

Minimizar a variabilidade na fração de partículas dentro de andaimes granulares facilita a experimentação reprodutível. Este trabalho descreve métodos para a geração de andaimes granulares com frações de partículas controladas para aplicações de engenharia de tecidos in vitro .

Controlando a Fração de Partículas em Andaimes de Partículas Microporosas Recozidos para Cultura de Células 3D

O presente protocolo descreve uma plataforma microfluídica para estudar o desenvolvimento de biofilme em meios porosos quase-2D, combinando imagens de microscopia de alta resolução com medidas simultâneas de diferença de pressão. A plataforma quantifica a influência do tamanho dos poros e das taxas de fluxo de fluido em meios porosos no bioentupimento.

Uma plataforma microfluídica para o estudo do bioentupimento em meios porosos

Este artigo descreve protocolos para a fabricação de microgel de metacriloíla de gelatina de alto rendimento usando dispositivos microfluídicos, conversão de microgéis em pó ressuspendível (micro-aerogéis), montagem química de microgéis para formar arcabouços de hidrogel granular e desenvolvimento de biotintas de hidrogel granulares com microporosidade preservada para bioimpressão 3D.

Suportes de hidrogel granular de metacriloíla de gelatina: fabricação de microgel de alto rendimento, liofilização, montagem química e bioimpressão 3D

Aprenda a síntese microfluídica de microgéis monodispersos para andaimes microporosos em medicina regenerativa. Este método de alto rendimento permite controle preciso da porosidade e integração tecidual.

Síntese Microfluiídica de Blocos de Construção de Microgel para andaime de partículas recíprocas microporosas

Explorar mais vídeos