Name: Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprenda a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongo usando o método da gota suspensa. Esta técnica permite a formação de corpos embrioides para estudos em biologia celular e medicina regenerativa.

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<ol><li> Gelatinizar T75 frasco com uma solução 0,1% de gelatina e placa de incubação em 37 ° C 5% CO, 2 de cultura de tecidos incubadora durante a noite um dia antes. </li><li> Retire as células MES de incubação, aspirar o médio, lavar a cultura de células ES com PBS, adicione solução de tripsina 0,05% para revestir o fundo do prato (2 placa ml/100mm). </li><li> Incubar a 37 ° C por aproximadamente 1 minuto, até que as células são sloughing fora do prato. </li><li> Suavemente triturar (pipeta cima e para baixo) as células tripsinizados quatro a seis vezes para dispersar as células ES com uma pipeta Pasteur ligado,. Transferência das células ES dispersos em um tubo de centrífuga de 15 ml cônico contendo pré-aquecido (37 ° C), médio MES. </li><li> Coletar células por centrifugação. Aspirar o sobrenadante, adicionar 10 ml de meio de MES e pipeta cima e para baixo para formar uma suspensão única célula. </li><li> Transferir a suspensão celular para um balão T75 pré-revestido com 0,1% de gelatina e incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 por uma hora * Depois de uma hora, os fibroblastos ter anexado à placa, mas as células-tronco permanecem no meio. Pipeta até o meio para coletar as células-tronco. </li><li> Girar as células a 1000 rpm por 5 min e aspire o meio off MES. Em seguida, adicione 10 ml de uma outra MES médio diferenciação e ressuspender as células por pipetagem repetitiva, até parece haver uma suspensão fina de células. </li><li> Contagem de células com um meio de diferenciação hemocitômetro usar para diluir a suspensão de células-tronco a uma concentração de 400 a 500 células por 20ul (20ul/drop) em uma bacia estéril. </li><li> Levante a tampa, cuidadosamente invertê-lo e colocá-lo em cima do prato contendo 10 ml de PBS. Usando uma pipeta multicanal, fazer linhas de gotas 20ul na superfície até que virou interna da tampa do prato de cultura de tecidos. </li><li> Cuidadosamente coloque o prato na incubadora por dois dias. Depois de dois dias, cuidadosamente vire a placa de cobertura, aspirado 180 médias diferenciação ul fresco e colocar algumas gotas para dentro do poço de uma placa de fixação de 96 poços ultralow. Em seguida, pegar a queda das gotas da pipeta e transferir, um por um, para a placa de 96 poços. Coloque as placas na incubadora sem ser perturbado por 3 dias. </li><li> Casaco de cada poço de uma placa de 48 poços de cultura de tecidos com 300ul de 0,1% de gelatina. Depois de adicionar a gelatina, incubar a placa durante a noite a 37 ° C um dia antes antes da transferência o EBS. </li><li> No dia seguinte, aspire a gelatina a partir da placa de 48 também. Em seguida, adicionar 300 ul do meio de diferenciação para cada poço. Transferir os EBs dos 96 pratos bem aos 48 bem gelatina revestido placas de um por um. Mudar o meio do dia seguinte e depois mudar o meio em dias alternados para manter as células. </li><li> Contrações espontâneas cardiaomyocyte deveria ser evidente dentro de 7 dias. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

As desvantagens do método de gota em suspensão são as seguintes: o volume de líquido de uma queda é limitado a menos de 50uL, devido à manutenção de gotas de suspensão na tampa pela tensão superficial, e é impossível mudar o meio para pendurar gotas. Observação da formação de EBs em gotas diretamente com microscopia também é muito difícil durante o cultivo. Ainda mais, o método de gota em suspensão consiste em duas etapas, portanto, uma série de etapas do método de gota em suspensão pode ser problemático.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Reagente</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reagente</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>fator inibidor de leucemia (LIF)</td><td>Reagente</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços com aderência ultrabaixa</td><td>Ferramenta</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (mes) células usando o método da gota de suspensão

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Células-tronco têm o extraordinário potencial de se transformar em vários tipos de células diferentes. Quando uma célula-tronco se divide, cada nova célula tem potencial para ou manter uma célula-tronco ou se tornar um outro tipo de célula com uma função mais especializada, esta promissora da ciência é levando os cientistas a investigar a possibilidade de terapias baseadas em células para tratar a doença. Quando a cultura em suspensão sem fatores antidiferenciação, células-tronco embrionárias espontaneamente diferenciar e forma tridimensional agregados multicelulares. Esses agregados celulares são chamados corpos embrióides (EB). Hanging cultura queda é amplamente utilizado EB método de indução de formação. O fundo arredondado de gota em suspensão permite a agregação de células-tronco embrionárias, que podem fornecer células MES um bom ambiente para a formação de EBs. O número de células ES aggregatied em uma gota em suspensão pode ser controlado variando o número de células em suspensão de células inicial para ser pendurado como uma queda da tampa da placa de Petri. Usando esse método, podemos reproducibly forma homogênea EBs de um número predeterminado de células-tronco embrionárias.

Este vídeo demonstra como realizar a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos para corpos embrióides usando o método da gota pendente.

Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão

As células-tronco possuem o potencial notável de se desenvolverem em muitos tipos celulares diferentes. Quando uma célula-tronco se divide, cada nova célula tem o potencial de...

As células-tronco possuem a notável capacidade de se desenvolver em muitos tipos diferentes de células no organismo. Atuando como um tipo de sistema de reparo para o corpo. Elas podem, teoricamente, se dividir sem limite para repor outras células.Quando uma célula-tronco se divide, cada célula nova tem a capacidade de permanecer como célula-tronco ou se tornar outro tipo de célula com uma função mais especializada. Essa área promissora da ciência está levando os cientistas a investigar a possibilidade de terapias baseadas em células para tratar doenças in vitro. A diferenciação de células-tronco embrionárias ocorre quando as células são permitidas se agregar em cultura em suspensão.Na ausência de fibroblastos embrionários de camundongo, camadas de sustentação e fator inibidor de leucemia, esses agregados celulares são chamados de corpos embrionários. O método da gota suspensa é um procedimento eficaz para a diferenciação de células-tronco em corpos embrionários in vitro. Olá, sou Sha Juan da divisão de Medicina Cardiovascular da Universidade de Stanford.Hoje vamos mostrar um procedimento para diferenciação individual de células-tronco embrionárias em corpos embriónicos utilizando o método de gota suspensa. Normalmente utilizamos este método para diferenciar células-tronco embrionárias em cardiomiócitos. Este procedimento inclui as seguintes etapas: preparação de uma suspensão simples de células-tronco embrionárias, geração de culturas em gota suspensa, transferência das culturas em gota suspensa para placas com aderência ultrabaixa e o plaqueamento de corpos embriónicos em placas revestidas com gelatina.Ok, vamos começar. O primeiro passo do procedimento é preparar uma suspensão de células isoladas de células-tronco embrionárias. Como cultivamos nossas células-tronco embrionárias indiferenciadas fazendo-as crescer sobre fibroblastos embrionários de camundongo, devemos destacar as células e separá-las dos fibroblastos.Para fazer isso, realizamos a tripsinização das células utilizando procedimentos padrão. Após a conclusão do tratamento com tripsina, adicione meio de células-tronco embrionárias de camundongo para neutralizar a tripsina. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.Em seguida, desagregue as colônias celulares pipetando para cima e para baixo contra o fundo do tubo até obter uma suspensão fina de células sem aglomerados visíveis. Agora, centrifugue as células a mil RPM por cinco minutos. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células com 10 mL de meio para células-tronco embrionárias de camundongo.Transfira a suspensão celular para um frasco T 75 pré-revestido com gelatina a 0,1% e incube a 37 graus com 5% de CO2 por uma hora. Após uma hora, os fibroblastos terão aderido à placa, mas as células-tronco permanecerão no meio. Pipete o meio para cima para coletar as células-tronco.Centrifugue as células a mil RPM por cinco minutos e aspire o meio. Em seguida, adicione mais 10 mL de meio de diferenciação e re-suspenda as células por pipetagem repetitiva até que pareça haver uma suspensão fina de células. Conte as células utilizando um hemocitômetro.Agora estamos prontos para cultivar a suspensão celular utilizando o método da gota pendente. Para iniciar o cultivo em gota pendente, use meio de diferenciação para diluir a suspensão de células-tronco até uma concentração de 500 células por 20 microlitros. Em seguida, inverta a tampa de uma placa de cultura de tecidos de 150 milímetros.Em seguida, pipete 20 microlitros da suspensão celular na superfície interna da tampa da placa. Usando uma pipeta multicanal, adicione 10 mililitros de PBS na placa. Inverta rapidamente a tampa da placa e coloque-a suavemente sobre a placa para formar as gotas suspensas.Uma vez que a tampa da placa esteja no lugar, transfira cuidadosamente a placa para a cultura em incubadora. As células permanecerão indisturbadas por dois dias. Após a conclusão da incubação, prosseguiremos com a transferência da cultura em gota suspensa para placas de adesão ultra baixa.Após dois dias, vire cuidadosamente a tampa da placa e, em seguida, aspire 180 microlitros de meio de diferenciação fresco e coloque várias gotas em uma placa de 96 poços com aderência ultrabaixa. Em seguida, recolha as gotas com uma pipeta e transfira-as uma a uma para a placa de 96 poços. Coloque as placas no incubador sem perturbá-las por três dias.Os corpos embrionários continuarão a crescer em formato esférico. Quando a incubação estiver concluída, estaremos prontos para semear os corpos embrionários, a fim de ajudá-los a continuar a se diferenciar.Transferimos para uma placa de 48 poços revestidos com gelatina. Para fazer isso, primeiro revestimos cada poço da placa com 300 microlitros de gelatina 0,1%. Após a adição da gelatina, incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, aspire a gelatina da placa de 48 poços. Em seguida, adicione 300 microlitros de meio de diferenciação a cada um. Agora, transfira os corpos embrioides, um a um, da placa de 96 poços para as placas de 48 poços revestidas com gelatina.Normalmente trocamos o meio no dia seguinte e depois a cada dois dias para manter as células. Utilizamos este método para buscar protocolos melhores para a diferenciação de células-tronco embrionárias. Nos cardiomiócitos, acabamos de mostrar como realizar a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongo utilizando culturas em gota suspensa.Este método é eficaz porque o fundo arredondado da gota suspensa permite a agregação de células-tronco embrionárias, proporcionando, assim, um bom ambiente para a formação de corpos embrionários. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o número de células-tronco embrionárias agregadas em uma gota suspensa pode ser controlado variando-se o número de células na suspensão celular inicial. É isso.Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

Vamos mostrar um método simples e rápido para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides.

Shrinky Dink-Hanging Drops: Uma maneira simples para formar e Cultura corpos embrióides

Nós descrevemos o uso de um ensaio de células de rato ES base para identificar janelas de tempo crítico para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP durante a indução cardiogênico. O método fornece uma plataforma padronizada, que quantifica a eficiência confiável cardiogênico, e é aplicável ao estudo de linhagens de célula.

Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

Desenvolvemos um novo protocolo para melhorar a eficiência de diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias em neurônios motores. As células-tronco diferenciadas adquirido neurônios motores apresenta como evidenciado pela expressão de marcadores neuronais e neurônio motor utilizando técnicas de imuno-histoquímica.

Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

O vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) em corpos embrióides (EBs) pelo método de gota suspensa. Ao suspender as mESCs em gotas suspensas e incubadas, as células se agregam para formar EBs, que são posteriormente diferenciadas em células progenitoras neuronais (NPCs) usando um meio de diferenciação suplementado com ácido retinóico (RA).

Geração de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos pelo método Hanging Drop

Este vídeo demonstra um método para a geração in vitro de células progenitoras neurais (NPCs) a partir de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs). As mESCs são cultivadas em suspensão para formar corpos embrióides (EBs), que são então guiados para se diferenciar em NPCs por meio de tratamento com ácido retinóico em uma cultura aderente.

Uma técnica para gerar células progenitoras neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

Aprenda a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongo usando o método da gota suspensa. Esta técnica permite a formação de corpos embrioides para estudos em biologia celular e medicina regenerativa.

Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão

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