Perinatal 국소 빈혈의 Hypoxic 허혈성 뇌증 모델

이 저산소성 뇌병증을 유도하기 위해, 허혈 모델, 출생 후. 7일째, Sprague 돌리 쥐 새끼는 미세 수술을 받고 총경동맥 결찰을 떠났습니다. 1-2시간의 회복 기간이 지나면 새끼를 섭씨 37도의 저산소 챔버에 100분 동안 넣습니다.

그런 다음 새끼는 안락사될 때까지 댐으로 돌아갑니다. 두 번의 전신 관류 단계에 따라 뇌를 제거하고 3mm 두께의 절편으로 절단합니다. 그런 다음 1%2, 3, 5, 트라이 회향, 테트라 올레움 클로라이드 또는 TTC 용액을 사용하여 절편을 염색하여 경색 영역을 나타냅니다.

안녕하세요, 저는 스탠포드 의과대학 신경학 및 신경과학과의 안드레 랩 랩(Andre Lab Lab)의 하이 탱고입니다. 오늘은 신생아 저산소성 허혈성 뇌 손상 모델에 대한 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 새로운 치료법을 개발하는 것을 궁극적인 목표로 신생아 뇌의 저산소성 허혈성 뇌병증의 메커니즘을 연구합니다.

시작하겠습니다. 절차를 시작하려면 출산 후 7일차 스프레이 돌리 쥐 강아지를 완전히 마취하십시오. ISO 불소를 사용하면 유도에 4%를 사용하고 유지 보수에 1-2%를 사용합니다.

몇 분 후 발가락 꼬집음 테스트를 수행하여 강아지가 마취되었는지 확인합니다. 그런 다음 솜 팁 애플리케이터를 사용하여 강아지의 목을 살균하여 10%포비돈 요오드를 바른 다음 70%의 이소프로필 알코올을 바르십시오. 다음으로, 정밀 과학 도구의 멸균 및 매우 얇은 홍채 가위를 사용하여 정중선에서 약 5mm 떨어진 곳에 작은 절개를 만들고 둔기 절개를 통해 왼쪽 총경동맥 또는 CCA를 노출시킵니다.

CCA를 얽힐 수 있는 결합 조직과 미주신경을 반드시 제거해야 합니다. 그런 다음 Ethicon의 5 제로 실크 봉합사를 사용하여 접합합니다. CCA입니다.

결찰 부위 위의 혈관 색은 결찰 직후 흰색으로 변해야 합니다. 결찰 후 시아노아크릴레이트 접착제로 절개 부위를 봉합하고 테이프로 덮습니다. 그런 다음 마취를 중지하고 강아지가 의식을 되찾는지 확인하십시오.

따뜻한 패드의 회복 상자에 강아지를 놓습니다. 필요에 따라 추가 강아지에 대해 절차를 반복합니다. 새끼를 댐으로 되돌리기 전에 최소 5분 동안 새끼를 관찰하십시오.

실험 전에 1-2시간 동안 강아지가 회복할 수 있도록 합니다. 8%의 산소를 함유하고 92%질소와 균형을 이루는 저산소 챔버를 조립합니다. 이렇게하려면 직경이 2cm인 두 개의 구멍이 있는 플라스틱 덮개가 장착된 마우스 케이지를 구하십시오.

하나의 구멍은 8%의 산소와 92%의 질소를 포함하는 혼합 가스 탱크에 연결된 튜브를 수용합니다. 그리고 다른 구멍은 가스가 흘러나오도록 하고 챔버를 수조에 넣은 다음 챔버에 온도계를 놓습니다. 온도계는 저산소증이 시작되기 전에 섭씨 37도를 기록해야 합니다.

새끼가 회복되면 섭씨 37도에서 100분 동안 저산소 챔버에 넣습니다. 그런 다음 저산소증이 끝난 후 24시간 후에 새끼를 댐으로 되돌리고 이소 불소로 깊은 마취로 새끼를 안락사시킵니다. 다음으로 차가운 생리식염수를 사용하여 좌심실을 통해 심장 내를 관류한 다음 P-B-S-T-T-C의 차가운 1% TTC 용액은 빛에 민감하므로 빛으로부터 보호해야 합니다.

관류 단계 후. 머리를 얼음 위에 1-2분 동안 올려 놓은 다음 얼음으로 냉각된 면도날을 사용하여 뇌를 노출시켜 뇌 조직을 4단계로 자릅니다. 주걱을 사용하여 뇌 절편을 퍼내고 뇌 절편을 TTC 용액에 담급니다.

TTC 염색이 일어나도록 섭씨 37도의 인큐베이터에 8분 동안 슬라이스를 놓습니다. 다음으로, 섹션을 PBS 커버의 4%Paraform aldehyde로 이동합니다. TTC는 빛에 민감하기 때문에 섹션을 섭씨 4도에 놓고 하룻밤 고정 후 밤새 고정할 수 있도록 합니다.

TTC 염색 단면을 스캔 및 디지털화하고 결과 분석을 진행합니다. 다음은 TTC로 염색된 저산소성 허혈성 뇌병증, 관상동맥 수치 1에서 4까지의 대표적인 결과입니다. 염색되지 않은 흰색 영역은 이미지 J를 사용하여 경색 영역을 나타냅니다.다음은 각 수준, 경색 A 영역 및 동측 반구 B 영역에 대해 측정됩니다.이러한 측정을 기반으로 슬라이스당 경색 면적 비율은 동측 반구 면적에 대한 경색 면적 또는 B 1에 대한 A의 경색 면적으로 계산됩니다. A 2 오버 B 2, A 3 오버 B 3, A 4 오버 B 4.

그런 다음 경색의 부피 퍼센트는 A 1, 2, 3, 4의 합에 3mm를 곱한 값에 B 1, 2, 3, 4의 합에 3mm를 곱한 값으로 계산합니다. 피질 또는 SAL 손상 영역도 유사한 방식으로 별도로 정량화할 수 있습니다. 방금 주산기 허혈의 저산소성 허혈성 뇌병증 모델을 생성하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 각 CCA 결찰에 대해 마취를 10분 이하로 제한하고 항상 저산소 챔버에 온도계를 배치하고 온도를 37센트로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.