Summary
박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.
Abstract
다양한 박테리아 종은 지질, 단백질, 핵산, 글리칸 및 모 세포에서 파생된 기타 분자로 구성된 ~20-300nm의 세포외 소포(EV)를 분비합니다. EV는 종내 및 종간 통신 벡터로 기능하는 동시에 감염 및 식민지화의 맥락에서 박테리아와 숙주 유기체 간의 상호 작용에 기여합니다. 건강 및 질병에서 EV에 기인하는 다양한 기능을 감안할 때 체외 및 생체 내 연구를 위해 EV를 분리하는 데 대한 관심이 증가하고 있습니다. 물리적 특성, 즉 크기에 기반한 EV의 분리는 다양한 박테리아 배양에서 소포의 분리를 용이하게 할 것이라는 가설이 세워졌습니다.
분리 워크플로우는 박테리아 배양에서 EV를 분리하기 위한 원심분리, 여과, 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 구성됩니다. 펌프 구동 접선 유동 여과(TFF) 단계를 통합하여 확장성을 향상시켜 시작 세포 배양 리터에서 물질을 분리할 수 있습니다. 대장균 은 EV 관련 나노루시퍼라제 및 비EV 관련 mCherry를 리포터 단백질로 발현하는 모델 시스템으로 사용되었습니다. 나노루시페라아제는 N-말단을 사이토리신 A와 융합하여 EV를 표적으로 삼았습니다. 관련 사이토리신 A-나노루크와 함께 20-100nm EV를 포함하는 초기 크로마토그래피 분획은 유리 단백질을 포함하는 후기 분획과 구별되었습니다. EV-관련 나노루시퍼라제의 존재는 면역금 표지 및 투과 전자 현미경에 의해 확인되었다. 이 EV 분리 워크플로우는 다른 인간 장 관련 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 종에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 원심분리, 여과, 한외여과/TFF 및 SEC를 결합하면 다양한 박테리아 종에서 EV를 확장 가능한 분리할 수 있습니다. 표준화된 분리 워크플로우를 사용하면 종 간 미생물 EV의 비교 연구가 용이해질 것입니다.
Introduction
세포외 소포(EV)는 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에서 분비되는 지질, 단백질, 글리칸 및 핵산으로 구성된 나노미터 크기의 리포솜 유사 구조입니다1. 그람 음성 박테리아2에서 EV의 방출을 시각화하는 초기 연구 이후, 박테리아 EV (직경 20-300 nm)에 기인 한 생물학적 기능의 수는 지난 수십 년 동안 지속적으로 증가하고 있습니다. 이들의 기능에는 항생제 내성전달3, 생물막 형성4, 쿼럼 감지5 및 독소 전달6이 포함됩니다. 또한 박테리아 EV를 치료제로 사용하는 것, 특히 백신학7 및 암 치료8에 대한 관심이 증가하고 있습니다.
EV 연구에 대한 관심이 높아지고 있음에도 불구하고 격리 방법에 대한 기술적 과제는 여전히 남아 있습니다. 특히, 재현 가능하고 확장 가능하며 다양한 EV 생산 유기체와 호환되는 분리 방법이 필요합니다. EV 분리 및 연구 방법을 계획하고 보고하기 위한 통일된 원칙을 만들기 위해 국제 세포외 소포 학회는 MISEV 입장 논문9를 발행하고 업데이트합니다. 또한 EV-TRACK 컨소시엄은 투명성을 높이기 위해 출판된 원고에 사용된 EV 격리에 대한 세부 방법론을 보고할 수 있는 개방형 플랫폼을 제공합니다10.
이 프로토콜에서, 포유류 세포 배양으로부터 EV의 분리에 사용된 이전의 방법론은 박테리아 세포 배양으로부터 EV의 분리를 가능하게 하기 위해11,12 조정되었다. 우리는 확장 가능한 다양한 미생물로부터 EV를 분리하고 EV 순도와 수율의 균형을 맞추는 방법을 사용하려고 했습니다(MISEV 입장논문 9에서 논의됨). 원심분리 및 여과로 박테리아 세포 및 파편을 제거한 후, 배양 배지는 원심 장치 한외여과(최대 ~100mL의 부피) 또는 펌프 구동 TFF(더 큰 부피의 경우)에 의해 농축됩니다. 그런 다음 EV는 소형 EV의 정제에 최적화된 컬럼을 사용하여 SEC에 의해 분리됩니다.
그림 1: 박테리아 EV 격리 워크플로 회로도 개요. 약어 : EV = 세포 외 소포; TFF = 접선 유동 여과; SEC = 크기 배제 크로마토그래피; MWCO = 분자량 컷오프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Escherichia coli (즉, E. coli MP113)의 마우스-공생 균주를 모델 유기체로서 사용하였고, 이전에 보고된 바와 같이, 세포리신 A에의 융합에 의해 EV-관련 나노루시퍼라제를 발현하도록 변형시켰다14. 여기에 사용 된 방법은 적어도 몇 리터의 박테리아 배양을 처리하고 EV 관련 단백질과 비 EV 관련 단백질을 효과적으로 분리 할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 다른 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 종에도 사용할 수 있습니다. 보고된 실험의 모든 관련 데이터는 EV-TRACK 지식 베이스(EV-TRACK ID: EV210211)10에 제출되었습니다.
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Protocol
알림: 박테리아 및 재조합 DNA와 관련된 모든 작업이 각 균주의 생물안전 위험 수준에 적합한 생물안전 억제를 위한 모범 사례를 따르는지 확인하십시오. 작업은 지역, 국가 및 국제 생물 안전 규정에 따라 수행되어야합니다.
1. 세균 균주 및 배양 조건
참고: 이 연구에 사용된 박테리아 균주는 대장균 MP113, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium Breve 및 Bifidobacterium dentium이었습니다 .
- 대장균의 경우 멸균 루프를 사용하여 단일 콜로니를 250-1,000mL의 Luria-Bertani(LB) 브로스에 접종하고 배양을 처리하기 전에 300rpm 및 37°C의 진탕 인큐베이터에서 48시간 동안 호기적으로 배양합니다. p114-mCherry-Clyluc(보충 방법 및 보충 그림 S1)이 있는 재조합 대장균 MP1 균주의 경우 최종 농도 17μg/mL로 LB 한천 및 브로스에 클로람페니콜을 추가합니다.
- A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve 및 B. dentium의 경우 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트에 줄무늬를 남기고 비닐 혐기성 챔버 내부에서 혐기성으로 배양합니다. 단일 콜로니를 미리 환원된 BHI 브로스 100mL에 접종하고 혐기성 48시간 동안 배양합니다.
2. EV 절연
- 원심분리 및 여과를 통한 박테리아 배양 배지 정화
- 단계 1에서 접종된 박테리아 세포 배양액을 250 mL 또는 500 mL 폴리프로필렌 원심분리 병에 부어 세척한다. 대용량 고정각 로터에서 병을 4°C 및 5,000×g에서 15 분 동안 원 심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 부어 원심분리기 병으로 옮기고 10,000× g 에서 15분 동안 다시 원심분리합니다.
알림: 생물학적 안전성에 적합한 세척 및 오염 제거 후 병을 재사용하십시오.- 두 번째 원심분리 후 박테리아 세포의 큰 펠릿이 존재하면 깨끗한 병에서 원심 분리를 반복하여 세포를 추가로 제거합니다.
- 상청액을 적절한 크기의 0.22 μm 폴리에테르술폰 진공 구동 필터 장치에 붓습니다. 여과 장치를 진공 벽 공급 장치에 연결하여 필터링합니다. 여과율이 크게 떨어지면 여과되지 않은 재료를 새 장치로 옮기기만 하면 됩니다. 여과된 배지를 4°C에서 밤새 보관하고, 원한다면 다음날 프로토콜을 계속한다.
참고: 위의 원심분리는 일반적으로 각 장치를 통해 표시된 세포 배양량의 ~2배를 처리할 수 있습니다. 예를 들어, 단일 500mL 필터 장치는 ~1,000mL의 사전 원심분리 배양물을 필터링할 수 있습니다. 이러한 장치는 일반적으로 재사용되지 않습니다. 이 단계에서 주사기 필터를 사용하는 것은 테스트 된 모델에서 상당한 손실이 발견되었으므로 최적화하지 않으면 권장되지 않습니다. 이것은 잠재적인 중지 지점입니다. - 여과된 상청액의 분취량을 적합한 한천 플레이트에 확산시킴으로써 이 시점에서 생존 세포의 완전한 제거를 확인하고 박테리아 균주에 대한 최적 조건에서 배양한 후 임의의 콜로니가 없는지 확인한다. 박테리아가 검출되면 추가 원심분리 및/또는 여과를 수행하여 위의 절차를 더욱 최적화하십시오.
- 단계 1에서 접종된 박테리아 세포 배양액을 250 mL 또는 500 mL 폴리프로필렌 원심분리 병에 부어 세척한다. 대용량 고정각 로터에서 병을 4°C 및 5,000×g에서 15 분 동안 원 심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 부어 원심분리기 병으로 옮기고 10,000× g 에서 15분 동안 다시 원심분리합니다.
- 여과된 매체의 농도
- 100mL> 부피로 작업하는 경우 2.2.2단계로 진행하십시오. ~100mL의 부피로 작업하는 경우 혈청학적 피펫을 사용하여 여과된 배양액 90mL를 각 용량 100kDa 분자량 차단(MWCO) 원심 한외여과 장치의 저장소에 로드합니다. 항상 일치하는 한외여과 장치와 균형을 이루고 상단 저장소의 배지 부피가 <0.5mL로 농축될 때까지 4°C 및 2,000× g 의 스윙 버킷 로터에서 15-30분 간격으로 원심분리합니다.
- 남은 여과된 배양 배지로 저장소를 채우십시오. "보충"하는 경우 장치 하단의 플로우 스루를 제거하고 모든 장치의 균형을 다시 조정하십시오.
참고: 이러한 장치를 사용하여 농축할 수 있는 여과된 배양 배지의 최대 부피는 권장 부피의 <2배인 것으로 관찰되었습니다. - 저장소에서 농축된 배지의 점도가 눈에 띄게 증가하면(어둡고 점성이 있는 물질), 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석하고 원심분리에 의해 다시 농축하여 100kDa의 MWCO보다 작은 임의의 비 EV 단백질을 희석한다.
참고: 이것은 잠재적인 정지 지점입니다. - 농축된 배지를 저단백질 결합 튜브로 옮기고, 4°C에서 밤새 저장하고, 원하는 경우 다음날 프로토콜을 계속한다.
- 남은 여과된 배양 배지로 저장소를 채우십시오. "보충"하는 경우 장치 하단의 플로우 스루를 제거하고 모든 장치의 균형을 다시 조정하십시오.
- 100mL> 부피로 작업하는 경우 처리할 부피를 수용할 수 있는 적절한 크기의 TFF 장치(100kDa MWCO)를 선택하십시오.
참고: 100mL에서 >1,000mL를 처리하기 위한 여과 장치는 상업적으로 이용 가능합니다. 현지 가용성, 비용 및 펌프 및 튜브/연결과의 호환성에 따라 가장 유용한 특정 모델이 결정됩니다. 필터를 청소하기 전에 재료 표에 표시된 장치로 최대 2L의 배양액을 처리했습니다(세척 프로토콜은 아래 2.3단계 참조).- 보충 그림 S16에 표시된 대로 #8 저바인딩/저침출 튜브, 1/8인치 호스 바브-Luer 어댑터, TFF 장치 및 연동 펌프로 여과 회로를 조립합니다.
알림: 생물안전 캐비닛 내에서 TFF를 수행하여 EV 준비를 환경 박테리아로 오염시킬 위험을 최소화하십시오. - 실온에서 여과되고 조절된 배지를 약 200mL/분(최소 100mL/분)으로 순환시키기 시작합니다. 눈금이 매겨진 용기에 200mL의 PBS를 펌핑하여 원하는 유량에 해당하는 적절한 RPM을 결정합니다. 여과된 조절 배지를 순환시킬 때, 한외여과막을 가로지르는 분자 <100 kDa를 별도의 용기에 폐기물로서 수집한다.
참고: 아래 예에서는 2L의 배양 시작 부피를 가정합니다. - 부피가 ~ 100-200 mL로 감소 될 때까지 조절 된 배지를 계속 순환시킵니다. 필요에 따라 더 작은 선박으로 이동하십시오. PBS로 2 배 희석하고 펌프로 계속 순환하여 75-100 mL까지 농축합니다. PBS로 2배 희석하고, 최종 부피 25 mL까지 계속 순환시킨다. PBS로 2 배 희석하고 <10mL까지 계속 순환시킵니다.
- 시료 저장소에서 공급 튜브를 들어 올리고 계속 펌핑하여 필터를 퍼지하고 최대량의 시료를 회수합니다.
참고: 이것은 잠재적인 정지 지점입니다. - 농축된 샘플을 원뿔형 튜브로 옮기고 원하는 경우 4°C에서 밤새 보관합니다. 또는 프로토콜을 계속 진행합니다.
- 농축된 샘플을 15 mL 용량의 100 kDa MWCO 원심 한외여과 장치로 옮긴다. 상단 저장소의 배지 부피가 <2mL로 농축될 때까지 4°C 및 2,000× g 의 스윙 버킷 로터에서 15-30분 간격으로 원심분리합니다.
참고: 이것은 잠재적인 정지 지점입니다. - 농축된 배지를 저단백 결합 튜브로 옮기고, 4°C에서 밤새 저장하고, 원하는 경우 다음날 프로토콜을 계속한다.
- 보충 그림 S16에 표시된 대로 #8 저바인딩/저침출 튜브, 1/8인치 호스 바브-Luer 어댑터, TFF 장치 및 연동 펌프로 여과 회로를 조립합니다.
- 100mL> 부피로 작업하는 경우 2.2.2단계로 진행하십시오. ~100mL의 부피로 작업하는 경우 혈청학적 피펫을 사용하여 여과된 배양액 90mL를 각 용량 100kDa 분자량 차단(MWCO) 원심 한외여과 장치의 저장소에 로드합니다. 항상 일치하는 한외여과 장치와 균형을 이루고 상단 저장소의 배지 부피가 <0.5mL로 농축될 때까지 4°C 및 2,000× g 의 스윙 버킷 로터에서 15-30분 간격으로 원심분리합니다.
- TFF 장치 청소(선택 사항)
알림: TFF 장치가 공정 중에 "막히기" 시작하면 여과 속도가 감소합니다(오염). 필요한 경우 필터 장치를 세척하여 동일한 정제 실행에서 추가 샘플을 쉽게 여과할 수 있습니다. 이론적으로는 가능하지만 교차 오염을 방지하기 위해 세척된 TFF 필터는 다른 정화 실행에 사용되지 않았습니다.- 청소하려면 TFF 장치에서 모든 튜브와 캡을 제거하고 잔류 액체를 배출하십시오.
- 연동 펌프와 튜브를 사용하여 TFF 장치의 내부 및 외부 구획(즉, 재료 표에 나열된 모델의 병렬 및 수직 포트를 통해)을 ~100mL의 증류수로 가득 채웁니다. 모든 튜브/캡을 제거하고 TFF 장치를 배출합니다.
- 외부(수직, 여과액) 포트를 덮고 증류수에 250mL의 20% 에탄올을 >200mL/분으로 내부 구획을 통해 10분 동안 순환시킵니다. 배수하고 증류수로 범람시킨 후 위와 같이 다시 배수하십시오.
- 내부 구획을 통해 250mL의 0.5N 신선한 NaOH 용액을 30분 동안 순환시키고 다시 배수합니다.
- 보충 그림 S2와 같이 모든 튜브와 캡을 입구, 출구 및 여과 포트에 다시 연결하고 0.5mL/cm2 필터 표면적의 >부피가 1mL/cm2 필터 표면적이 필터 멤브레인을 통해 침투하여 여액/폐기물로 수집될 때까지 0.5N NaOH 용액을 다시 순환시킵니다.
- 위와 같이 증류수로 TFF 장치를 헹굽니다. TFF 장치를 즉시 사용하거나 ~100mL의 20% 에탄올로 장치를 가득 채우고 4°C에서 밤새 보관하십시오.
알림: 에탄올에 보관하는 경우 >1mL/cm2 의 필터 표면적이 필터 멤브레인을 통해 스며들고 여과액/폐기물로 수집되어 시료 처리 전에 잔류 에탄올을 제거하기 위해 여과액/폐기물로 수집될 때까지 장치를 통해 2mL의 PBS를 배수하고 물로 헹구고 배수 및 순환시키십시오.
- 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
참고: SEC는 EV의 순도를 높이고 비소포 단백질을 제거하는 데 사용됩니다.- 출발 물질 <100mL에서 EV를 분리하려면 작은 SEC 컬럼(10mL 베드 부피)을 사용하고 >100mL의 출발 물질에서 EV를 분리하려면 더 큰 컬럼(47mL 베드 부피)을 사용합니다.
참고: 아래 예에서는 큰 열에 대한 볼륨을 나열하고 괄호 안에 작은 열에 대한 볼륨을 나열합니다. - SEC 컬럼과 PBS를 몇 시간에 걸쳐 실온에 둡니다. 표준 실험실 스탠드와 홀더를 사용하여 수직 위치에서 SEC 컬럼을 안정화합니다. 또는 상업용 크로마토그래피 컬럼 스탠드를 사용하십시오.
- SEC 컬럼에 연결하기 전에 5mL의 PBS가 프릿을 통해 폐기물 용기로 흐르도록 하여 시료 저장소에 수분을 공급합니다. SEC 컬럼의 입구 캡을 풀고 샘플 저장소에 PBS 2mL를 추가한 다음 PBS가 프릿을 통해 떨어지므로 저장소를 컬럼에 조심스럽게 연결합니다(작은 SEC 컬럼에는 적용되지 않음).
알림: 이 이전 단계는 기포가 SEC 열의 맨 위에 갇히는 것을 방지합니다. 공기가 갇힌 경우 저장소를 제거하고 컬럼을 탭하여 기포를 빼낸 다음 연결 절차를 반복하십시오. 더 작은 컬럼의 경우 SEC 컬럼의 상단을 열고 샘플 호퍼를 부착하기만 하면 됩니다. - 47mL(10mL)의 PBS를 시료 저장소에 추가하고 SEC 컬럼의 하단을 풉니다. 로드된 모든 샘플 버퍼가 평형을 위해 컬럼을 통과하도록 합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
- 최대 2mL(0.5mL)의 시료를 시료 저장소에 로드하고 플로우스루를 폐기한 후 시료가 컬럼에 완전히 들어갈 수 있도록 합니다.
- PBS를 시료 저장소 또는 호퍼에 14.25mL에서 시료 부피를 뺀 값(3mL에서 작은 컬럼의 경우 시료 부피를 뺀 값)으로 즉시 추가합니다. 용액이 컬럼을 통해 흐르도록 하고 컬럼 보이드 부피와 동일한 이 양을 폐기합니다.
참고: 일반적인 2mL 샘플의 경우 샘플 저장소 또는 호퍼에 추가할 PBS의 양은 12.25mL입니다. - 2mL 저결합 마이크로튜브를 SEC 컬럼 바로 아래에 놓습니다. 즉시 2mL(0.5mL)의 PBS를 샘플 저장소에 추가하고 컬럼에 들어가도록 합니다. 이 처음 2mL(0.5mL)의 플로우스루를 분획 1로 표시합니다. 한 번에 2mL (0.5mL)를 샘플 저장소에 계속 추가하여 각각의 후속 분획을 수집합니다.
알림: 대부분의 박테리아 EV는 처음 5개의 분획에서 용리됩니다. 최적화하는 동안 처음 12 개의 분획이 수집되었습니다. - 분획을 단기 보관(일)의 경우 4°C에서 저장하거나 장기 보관의 경우 -80°C에서 보관하십시오.
- 재사용 가능한 SEC 컬럼의 청소 및 보관
참고: 이 프로토콜에 설명된 SEC 열은 제조업체에 따라 최대 5회까지 재사용할 수 있습니다. <5회 사용 후 SEC 컬럼의 유속이 감소하면 제조업체는 농축된 샘플을 10,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 SEC 전에 응집체를 제거할 것을 권장합니다. 그런 다음 EV 분리를 위해 이 원심분리의 상청액을 SEC 컬럼에 로드합니다.- 사용 후 SEC 컬럼을 세척하고 보관하려면 0.5M NaOH 2mL(0.5mL)를 넣고 컬럼에 완전히 들어가도록 합니다. 컬럼을 통해 20% 에탄올 100mL(20mL)를 실행하고 다음 사용 때까지 4°C에서 보관합니다. 다음 사용 전에 에탄올을 위와 같이 실온으로 평형화하고 컬럼을 통해 PBS 150mL(30mL)를 추가로 실행하여 PBS 완충액으로 교환합니다.
- 사용 후 SEC 컬럼을 세척하고 즉시 재사용하려면 0.5M NaOH 2mL(0.5mL)를 넣고 컬럼에 완전히 들어가도록 합니다. 약 150mL(30mL)의 PBS 버퍼를 실행하여 NaOH를 씻어냅니다. 용출액의 pH가 PBS(~7)와 같으면 새 샘플을 로드할 수 있습니다.
- 출발 물질 <100mL에서 EV를 분리하려면 작은 SEC 컬럼(10mL 베드 부피)을 사용하고 >100mL의 출발 물질에서 EV를 분리하려면 더 큰 컬럼(47mL 베드 부피)을 사용합니다.
3. EV 준비 품질 관리
- 무균 테스트
알림: 이러한 EV는 박테리아 배양에서 나오기 때문에 다운스트림 사용 전에 무균성을 보장하는 것이 중요합니다.- 분석에 사용할 분획 100μL(20μL)를 얻고 공급원 박테리아를 성장시키는 데 사용된 배지 3mL를 접종합니다. 각각의 최적 조건 하에서 적어도 3일 동안 배양하고 탁도를 관찰한다. 또는 분획 샘플을 생산 박테리아를 성장시키는 데 사용되는 배지가 포함된 한천 플레이트에 적용하고 콜로니 형성을 찾습니다.
알림: 박테리아 오염이 감지되면 실험에 EV 준비를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대신, (a) 조절된 박테리아 세포 배양 배지의 충분한 원심분리/여과를 수행하고, (b) 깨끗한 병, 튜브, 필터 및 크로마토그래피 컬럼을 사용하고, (c) 적절한 무균 기술을 사용하여 박테리아 오염 위험을 최소화하도록 주의하면서 분리를 반복합니다.
- 분석에 사용할 분획 100μL(20μL)를 얻고 공급원 박테리아를 성장시키는 데 사용된 배지 3mL를 접종합니다. 각각의 최적 조건 하에서 적어도 3일 동안 배양하고 탁도를 관찰한다. 또는 분획 샘플을 생산 박테리아를 성장시키는 데 사용되는 배지가 포함된 한천 플레이트에 적용하고 콜로니 형성을 찾습니다.
- 단백질 정량
참고: 고감도 형광 기반 단백질 정량 키트가 사용되었습니다( 재료 표 참조). 이 키트는 485/590 nm의 여기/방출 파장에서 일치하는 독점 형광계와 함께 작동합니다.- 모든 시약, 표준물질 및 샘플을 실온으로 가져옵니다.
- 분석할 각 샘플 및 표준물질에 대해 1μL의 시약을 199μL의 버퍼에 추가하여 단백질 시약과 버퍼의 마스터 믹스를 준비합니다. 얇은 벽의 0.5mL PCR 튜브를 사용하여 각 표준 튜브에 10μL 표준 + 190μL의 마스터 믹스를 추가합니다.
참고: 분석 범위 내에 있으려면 각 샘플 튜브에 첨가되는 각 분획의 양은 정제의 예상 단백질 수율에 따라 다릅니다. 전형적으로, 각 분획의 5 μL + 195 μL의 마스터 믹스가 사용되었다. 샘플 + 마스터 믹스의 최종 부피는 200 μL여야 합니다. - 분석 튜브를 와동시키고, 암실에서 실온에서 적어도 15분 동안 배양한다.
- 적절한 독점 형광계( 재료 표 참조)에서 화살표 버튼을 사용하여 단백질 분석 옵션을 선택하고 GO 버튼을 눌러 확인합니다. 화면의 지시에 따라 각 표준 튜브를 삽입하고 GO를 누릅니다.
- 실험 샘플 튜브를 삽입하는 단계; 읽으려면 GO 를 누르십시오. 그리고 분석 완충액/샘플 혼합물의 실제 단백질 농도인 표시된 결과를 확인합니다. 샘플의 단백질 농도를 얻으려면 화살표 키를 사용하여 샘플 농도 계산 옵션을 선택하고 GO를 누른 다음 화살표 키를 사용하여 주어진 샘플의 분석 버퍼에 추가된 샘플 부피 를 선택합니다. GO 를 누르고 샘플 단백질 농도를 기록합니다. 분석할 각 샘플에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 입자 계수 및 크기 분포
참고: 미세유체 저항성 펄스 감지(MRPS)를 사용하여 EV 농도 및 크기 분포를 정량화했습니다.- 0.02μm 주사기 필터를 통해 여과된 1% Tween-20이 보충된 PBS에서 샘플을 약 0.1μg/mL의 단백질 농도로 희석합니다.
참고: 희석의 목표는 EV 함유 분획에서 1010 particles/mL 범위의 예상 입자 농도에 도달하는 것입니다. 최적의 희석은 경험적으로 결정될 필요가 있을 수 있다. 이후 분수(분수 6 이상)에 대해서는 EV가 거의 없을 것으로 예상됩니다. 따라서 입자 농도는 낮은 희석률로 분석하더라도 <1010 particles/mL일 것입니다. - 각 시료 3μL를 마이크로피펫으로 일회용 미세유체 카트리지에 로드하고 카트리지를 MRPS 기기에 삽입한 다음 파란색 조명 테두리가 있는 금속 버튼을 누릅니다.
- 수집 소프트웨어에서 Go! 를 클릭하고 기기에서 샘플을 분석할 때까지 기다립니다. 1,000개에서 10,000개의 파티클 이벤트를 수집하여 분석의 기술적 통계적 오류를 최소화합니다. 이 시점에서 중지 및 실행 종료 를 클릭하여 샘플 수집을 완료합니다.
참고: 원시 데이터 파일과 함께 기기는 샘플의 입자 농도를 나열하는 요약 스프레드시트를 출력합니다. 샘플 희석에 따라 이 값을 수정합니다. - 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 로드하고 크기 분포의 맞춤형 그래프를 생성합니다.
- 0.02μm 주사기 필터를 통해 여과된 1% Tween-20이 보충된 PBS에서 샘플을 약 0.1μg/mL의 단백질 농도로 희석합니다.
4. EV 스토리지
- 개별 또는 풀링된 분획을 저단백질 결합 튜브에서 개별 분획 크기(사용된 컬럼 크기에 따라 다름)의 25-50%로 분취하고 동결-해동 주기를 피하기 위해 -80°C에서 보관합니다.
참고: 다른 응용 분야에서는 각 실험에 사용된 예상 양에 따라 더 작거나 더 큰 분취량이 필요할 수 있습니다. 이것은 경험적으로 결정되어야합니다. 비 EV 함유 분획은 연구 목표에 적용 할 수없는 경우 폐기 할 수 있습니다.
5. 투과전자현미경
- 음성 염색
- 5μL의 EV 샘플을 탄소 코팅된 구리 400메쉬 그리드에 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 5 mM Tris 완충액(pH 7.1) 5방울로 시편 면을 세척한 다음 증류수 5방울로 세척합니다.
- 표본면을 2 % 우라 닐 아세테이트 5 방울로 얼룩지게합니다. 여과지로 여분의 얼룩을 닦아내고 그리드를 몇 시간 또는 밤새 완전히 건조시킵니다. 80kV에서 작동하는 전자 현미경으로 표본을 시각화합니다.
- 면역골드 라벨링
- EV 현탁액 10μL를 포름바/탄소 400 메쉬 그리드에 적용하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그리드를 PBS로 3회 세척한 다음 4% 파라포름알데히드를 10분 동안 적용하여 샘플을 고정합니다. PBS로 그리드를 5 번 씻으십시오.
- 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS를 3회 세척하여 그리드를 차단한다. 그런 다음 실온에서 40분 동안 1차 항체 10μL를 적용합니다(여기서는 nluc 항체 1μg/mL). 0.1% BSA가 함유된 PBS로 다시 3회 세척합니다.
- 10μL의 2차 금 표지 항체를 그리드에 추가하고 실온에서 40분 동안 배양합니다. PBS로 그리드를 세 번 씻으십시오.
참고: 여기서, 10nm 금 나노입자와 접합된 염소 항-마우스 항체를 블로킹 완충액에서 1:10으로 희석한 후 사용하였다. 금 라벨링이 EV 시각화를 가리는 경우 더 작은 금 나노입자(예: 5nm)를 가진 2차 항체를 대신 사용할 수 있습니다. - 그리드를 실온에서 10분 동안 10μL의 2.5% 글루타르알데히드로 사후 고정합니다. PBS로 세 번 씻으십시오. 2% 우라닐 아세테이트(10μL)로 15분 동안 음성 염색을 수행합니다. 샘플을 10 μL의 0.5 % 우라 닐 아세테이트 및 0.13 % 메틸 셀룰로오스 용액에 10 분 동안 삽입합니다.
- 전자 현미경으로 이미징하기 전에 샘플 그리드를 실온에서 밤새 건조시킵니다.
- 현미경 획득 소프트웨어에서 최적의 이미지 품질(예: 이 특정 설정에서 0.80851초)을 얻기 위해 경험적으로 노출을 결정하고 노출 시간 옵션 상자에 이 값을 입력하여 조정합니다. 80kV 옵션을 선택하고 획득 시작을 클릭하여 이미지를 캡처합니다.
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Representative Results
EV에 대해 어떤 SEC 크로마토그래피 분획이 농축되었는지 평가하기 위해 SEC 컬럼에 TFF에 의해 1,000배 농축된 대장균 MP1 조절 배양액 2mL를 로드하고 순차적 분획을 수집했습니다. MRPS를 사용하여 분획 1-6에 가장 많은 EV가 포함되어 있음을 알 수 있습니다(그림 2A). 후속 분획에는 EV가 없는 단백질 대신 포함된 EV가 거의 포함되어 있지 않았습니다(그림 2B). EV는 주로 직경이 <100nm였습니다(그림 2C). TEM은 특히 분획 2-6에서 EV 농축 및 크기를 확인했습니다(그림 2D).
상기 방법이 비 EV 관련 단백질로부터 EV를 분리 할 수 있는지 확인하기 위해, 세포 리신 A- 나노 루시퍼 라제 융합 단백질과 유리 (융합되지 않은) mCherry를 발현하는 대장균 MP1의 재조합 균 주가 생성되었다 (도 3A의 도식화). 사이토리신 A 융합 단백질은 이전에 대장균 EV14와 연관되는 것으로 나타났습니다. mCherry 형광을 모니터링하기 위해 각 크로마토그래피 분획의 분취량 100μL를 96웰 플레이트의 웰로 옮겼습니다. 이들의 형광은 각각 흡수 및 방출 파장으로 580nm 및 620nm를 사용하여 마이크로플레이트 판독기에서 측정되었습니다.
유사하게, 발광 측정을 위해, 각 분획의 20μL 분취량을 384-웰 플레이트에서 동일한 부피의 루시페라아제 분석 용액과 혼합하고, 15분 동안 배양하고, 가시광선 발광을 측정하였다. EV가 풍부한 분획 (분획 2-7)은 후기 분획에 필적하는 높은 나노 루시퍼 라제 활성을 갖지만 EV와 관련이없는 mCherry의 형광 신호는 매우 낮은 것으로 관찰되었습니다 (그림 3B). 동일한 양의 음성 대조군 EV(나노루시퍼라제 발현이 없는 일치하는 박테리아 균주에서 분리)의 배경 신호는 EV 분획에서 >1,000배 낮았습니다. 양성 대조군(나노루시페라아제 발현 박테리아 세포 펠릿)의 신호는 EV 분획(표시되지 않음)의 신호보다 약 1,000배 높았습니다. 후자는 각각 분석된 세포 또는 EV를 산출하는 세포 배양 물질의 초기 부피로 정규화되었습니다. 나노루시퍼라아제의 EV-연관성은 면역금 표지(도 3C)에 의해 분획 2-5에서 확인되었으며, 분리된 작은 ~20nm EV 내의 표지를 관찰하였다.
마지막으로, 다른 박테리아 종에 대한 이 프로토콜의 적용 가능성을 평가하기 위해 EV는 다음과 같은 다양한 혐기성 박테리아의 ~100mL 배양물에서 분리되었습니다: A. 뮤시노필라, B. 테타이오타오미크론, B. 브레브 및 B . 상아질 BHI 배양 배지에서 준비되었습니다. 대조군으로서, EV는 신선한 BHI 배양 배지로부터 분리되었다. EV 수율은 종에 따라 다르지만 초기 크로마토그래피 분획 1-4가 EV에 대해 풍부하다는 것이 다시 관찰되었습니다(그림 4A). 복합 BHI 배지에는 EV 크기의 입자도 포함되어 있지만 이러한 제제에서 총 EV 수율의 <25%입니다(그림 4A, 검은색 막대). 이 박테리아의 EV는 또한 주로 크기가 <100nm인 것으로 밝혀졌습니다(그림 4B).
그림 2: 초기 크로마토그래피 분획에서 대표적인 대장균 MP1 EV 용리. (A) 순차적 2mL 크로마토그래피 분획에서 MRPS에 의한 입자 수. SEC는 2 mL로 농축된 박테리아 배양 상청액 2 L를 투입하였다. 실선은 평균을 나타냅니다. 음영 영역은 SEM을 나타냅니다. (B) 각 분획의 단백질 농도. (C) MRPS로 측정한 분획 3 EV의 크기 분포. 실선은 평균을 나타냅니다. 음영 영역은 95% CI를 나타냅니다. 기기는 입자를 <50nm로 정량화할 수 없습니다. (D) 순차적, 풀링된 크로마토그래피 분획 및 신선한 배양 배지(대조군)의 투과 전자 현미경 사진. 모든 이미지는 동일한 스케일(100nm)로 촬영되었습니다. 광시야 TEM 이미지는 보충 그림 S3에 나와 있습니다. 약어 : EV = 세포 외 소포; MRPS = 미세 유체 저항성 펄스 감지; SEC = 크기 배제 크로마토그래피; SEM = 평균의 표준 오차; CI = 신뢰 구간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: SEC에 의한 EV 없는 단백질에서 대장균 MP1 EV 분리. (A) 세포질 및 주변질-트래피킹 사이토리신 A-나노루시페라아제 융합 단백질(옐로우 다이아몬드)에서 재조합 mCherry(빨간색)를 발현하는 대장균 MP1의 개략도. (b) 나노루시페라제 생물발광 활성 및 mCherry 형광을 순차적으로 용리된 크로마토그래피 분획에서 모니터링하였다. 수직 점선은 그림 2의 분석을 기반으로 한 EV 농축 분율의 한계를 나타냅니다. (c) EV 분획 (F2-5)을 항나노루시퍼라제 항체로 염색한 후 면역금 표지하였다. 청록색 화살촉은 소형 EV와 함께 국소화되는 금 접합 2차 항체를 가리킵니다. 야생형 대장균 MP1의 대조군 EV는 무시할 수 있는 비특이적 염색을 가졌습니다. 두 이미지 모두 동일한 스케일(100nm)로 촬영되었습니다. 광시야 TEM 이미지는 보충 그림 S4에 나와 있습니다. 약어 : EV = 세포 외 소포; SEC = 크기 배제 크로마토그래피; F = 분수; TEM = 투과 전자 현미경; ClyA-nLuc = 사이토 리신 A- 나노 루시페라제 융합 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 다양한 박테리아 종에서 EV의 분리. 지시된 종은 혐기성 조건하에 BHI 배지에서 48시간 동안 배양하였다. EV는 한외여과+SEC. (A) MRPS로 측정한 처음 4초 분획의 EV 농도에 의해 분리되었다. 평균 ± SEM. 검은색 막대는 새로운 BHI 배지(대조군)의 배치에서 검출된 입자를 나타냅니다. (B) 분획 2의 EV 크기 분포. 약어 : EV = 세포 외 소포; MRPS = 미세 유체 저항성 펄스 감지; SEC = 크기 배제 크로마토그래피; BHI = 뇌 심장 주입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: p114-m체리-클릴룩 플라스미드. (A) p114-m체리-클라이룩 플라스미드의 지도. (b) J23114-m체리-클리아-nluc 영역의 서열. 바이올렛, J23114 프로모터; 핑크, 엠체리 유전자; 회색, clyA 유전자; 녹색, 링커 서열; 오렌지, nLuc 유전자. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 접선 유동 여과(TFF) 설정 개략도. 그림과 같이 미늘 호스가 있는 튜브를 TFF 장치에 연결했습니다. 공급 흐름 튜브는 여과되고 조절된 배양 배지 용기에 잠기기 시작하여 연동 펌프를 통해 계속되고 TFF 장치 입구 포트에 연결됩니다. 반환 흐름은 TFF 장치 출구 포트에서 시작하여 여과되고 조절된 배양 배지의 표면 위에서 끝납니다. 선택적으로, 배압 클램프(예를 들어, 스크류 너트 + 볼트 또는 간단한 종이 클램프)가 여과 속도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 펌프가 조절된 매체를 순환함에 따라 TFF 장치 내의 압력이 발생하면 한외여과가 이루어지고 여과액/폐기물 흐름 튜브를 통해 <100kDa의 구성 요소가 제거되며, 이는 폐기를 위해 별도의 용기(마젠타색)에 수집될 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S3: 광시야 투과 전자 현미경 사진. 순차적, 풀링된 크로마토그래피 분획 및 신선한 배양 배지(대조군)의 TEM 이미지는 그림 2D에 나와 있습니다. 이미지는 대장균 MP1 세포외 소포가 초기 크로마토그래피 분획에서 용리됨을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S4: 그림 3C에 대한 광시야 TEM 이미지. EV 분획 (F2-5)을 항-나노루시페라제 항체로 염색한 후 면역금-표지하였다. 청록색 화살촉은 소형 EV와 함께 국소화되는 금 접합 2차 항체를 가리킵니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 방법: p114-mCherryClyluc이 있는 재조합 대장균 MP1 균주의 경우. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위의 프로토콜에서는 확장 가능하고 다양한 그람 음성/양성 및 호기성/혐기성 박테리아로부터 EV를 안정적으로 분리하는 방법이 설명되어 있습니다. 절차 전반에 걸쳐 몇 가지 잠재적인 정지 지점이 있지만 컨디셔닝된 박테리아 배양 배지에서 EV를 분리하는 데 48시간 이상 걸리지 않는 것이 좋습니다.
첫째, 컨디셔닝 된 박테리아 배양 배지를 생성하기 위해 박테리아를 배양하는 것으로 구성됩니다. 배양 시간을 최소 48시간으로 늘리고 최적의 성장 배지를 사용하면 EV 수율을 극대화하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다. 각 박테리아 종은이 두 매개 변수와 관련하여 최적화되어야 할 것입니다. 박테리아 배양의 부피는 원하는 응용 분야에 대해 충분한 EV를 분리하는 데에도 중요합니다. 시험관 내 연구의 경우 EV는 일반적으로 최소 100mL에서 분리되는 반면, 생체 내 연구의 경우 EV는 일반적으로 >1L의 배양 배지에서 분리됩니다. 다시 말하지만, 각 박테리아 균주의 EV 생산 특성과 다운스트림 분석에 필요한 EV 양은 최소 시작 배양량을 결정합니다.
컨디셔닝 된 배양 배지를 사용할 수있게되면 세포와 큰 비 EV 파편을 제거해야합니다. 원심 분리는이 과정에서 중요한 단계라는 것이 밝혀졌습니다. 위의 프로토콜에서 언급했듯이 두 가지 증가하는 g-force 원심분리가 수행되었습니다. 때때로, 두 번째 스핀의 펠릿이 콤팩트하지 않다는 것이 주목되는 경우 추가로 10,000 × g 원심 분리가 수행됩니다. 이어서,이 상청액의 멸균 여과는 0.22 μm 필터를 통해 수행된다. 불충분한 원심분리는 이 여과 단계의 막힘 및 성능 저하로 이어집니다. 여과 속도가 상당히 느려진 후에도 상청액을 계속 여과하면 필터 오작동 및 EV 제제가 모 박테리아로 오염될 수 있음이 주목되었습니다. 필터의 지속적인 막힘에 대한 해결책은 상청액을 다시 원심분리 및/또는 다시 여과하여 멸균을 보장하는 것입니다. 설명된 원심분리 및 진공 구동 여과 단계는 최대 총 4L의 박테리아 배양에 대해 테스트되었습니다. EV 절연의 추가 확장에는 수정이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 이 두 단계 모두 기공 크기가 0.22μm까지 감소하는 호환 필터 장치를 사용하는 순차 펌프 구동 여과로 대체될 수 있습니다. 그러나 이것은 테스트해야합니다.
현재 프로토콜에서는 박테리아 배양의 시작 부피에 따라 두 가지 변형이 설명됩니다. 부피가 <100mL인 경우 원심 한외여과 장치를 사용하여 배양 배지를 농축합니다. MWCO는 이러한 단계에서 매우 중요합니다. 포유류 EV의 경우 이전에 >300kDa MWCO가 사용되었습니다11,12. 그러나 이로 인해 박테리아의 EV 수율이 매우 낮아졌는데, 이는 아마도 크기 분포가 더 작기 때문일 것입니다. 따라서 100kDa MWCO를 사용하는 것이 좋습니다. 더 작은 MWCO도 사용할 수 있지만 원심분리 시간이 길어지고 분자량이 작은 오염 물질이 덜 제거되어 시료 점도가 증가합니다. 또한 프로토콜 전반에 걸쳐 다양한 시작 부피의 시료를 농축하는 데 도움이 되도록 100kDa MWCO에서 다양한 크기의 한외여과 장치를 사용하는 것이 도움이 됩니다.
또는 시료 크기가 100mL> 경우 펌프 구동 TFF를 사용하여 시료를 농축하십시오. 다시 말하지만, 100kDa MWCO를 사용하는 것이 중요합니다. 이 방법을 사용하면 대량의 배양 배지를 반자동 방식으로 처리 할 수 있습니다. 시작 배양 부피에 적합한 크기의 TFF 장치를 얻는 것이 중요합니다. 사용 된 장치는 제조업체에서 최대 200mL의 재료를 처리하는 것으로 평가되었습니다. 약 2 L까지 처리 할 수있었습니다. 그러나 더 큰 부피를 처리하려고 할 때 여과율이 심각하게 떨어지는 것이 관찰되어 추가 처리 전에 공정을 중지하고 장치를 청소해야 했습니다. 따라서, 각 박테리아 배양물의 특성 및 출발 물질의 양은 TFF 장치의 요구되는 크기를 결정할 것이다. 또한 달성 가능한 펌프 속도는 TFF의 또 다른 중요한 매개 변수입니다. ~100mL/min의 낮은 속도에서는 여과를 용이하게 하기 위해 추가 그림 S2에 표시된 대로 클램프를 사용하여 TFF 장치의 배압을 증가시켜 필터의 오염률을 증가시켜야 했습니다. 튜브는 적절한 오염 제거 및 고압 멸균 후 최대 2 회 재사용되었습니다.
샘플이 농축되면 SEC 컬럼에 로드하여 EV를 분리할 수 있습니다. 소형 EV 절연에 최적화된 상업용 컬럼이 사용되었습니다. 작은 시작 샘플의 경우 로딩 부피가 0.5mL인 컬럼을 사용하고 최대 2L의 큰 시작 샘플의 경우 로딩 부피가 2mL인 컬럼을 사용하십시오. 시작 배양 >2 L의 처리에는 더 큰 컬럼이 필요할 수 있습니다. EV에 최적화된 컬럼 제조업체는 현재 >100mL의 농축 물질을 수용할 수 있는 SEC 컬럼을 제공합니다.
절연 EV를 특성화하기 위해 다양한 방법이 사용되며 대부분은 널리 사용 가능합니다. 정규화는 대부분의 분석에서 단백질 농도를 기반으로 했는데, 이는 다른 정량 방법(즉, MRPS와 같은 기술에 의한 입자 정량화)이 매우 작은 EV<50nm를 검출할 수 없기 때문에 영향을 받지 않기 때문입니다. MRPS 및 기타 나노 입자 정량화 기술은 서로 다른 분획 간의 EV의 상대적 정량화에 여전히 유용합니다.
MRPS 정량화의 중요한 측면 중 하나는 희석 수준입니다. 적절하게 희석하면 기기가 입자를 < 50nm 정량화할 수 없기 때문에 검출된 EV의 주파수는 대부분의 경우 검출 한계까지 계속 증가해야 합니다. 희석이 충분하지 않으면 기기 소음이 높아져 피크가 >65nm인 인공물 종 모양의 곡선이 생성됩니다(권장 C-300 미세유체 카트리지 사용 시). 크기 주파수 분포 데이터 분석 중에 적절한 희석에도 불구하고 50nm(기기의 절대 검출 한계)와 60nm 사이의 인공적인 피크가 여전히 관찰되는 경우가 있습니다. 이는 MRPS에 의한 정확한 감지 한계 미만이고 다시 계기 소음으로 이어지는 매우 작은 박테리아 EV(TEM, 그림 2D에서 시각화됨)가 상당수 존재하기 때문일 수 있습니다. 이 경우 관찰된 "피크"보다 작은 데이터 포인트를 제외하면 주어진 샘플의 사실상 정량 하한이 됩니다.
이 프로토콜에 설명된 바와 같이, 용리된 크로마토그래피 분획에서 EV 풍부도, 총 단백질 농도 및 비 EV 단백질의 풍부도를 정량화하면 사용자가 다운스트림 분석에 사용할 분획을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 소형 EV는 풀링된 분획 7-8에서 검출되었습니다(그림 2D). 그러나, 그들의 풍부도는 직전 분획보다 낮았고, 총 단백질 농도 (그림 2B)는 더 높았다. 이는 분획 7-8이 더 많은 양의 비 EV 관련 단백질을 함유하므로 특정 다운 스트림 응용 분야에 바람직하지 않을 수 있음을 시사 할 수 있습니다.
요약하면, 상업적으로 이용 가능한 재료에 의존하는 다목적 EV 절연 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다. 널리 사용되는 초원심분리 기반 방법과 비교하여 이 방법론의 중요성은 다양한 사용자가 쉽게 재현할 수 있고 확장성이 뛰어난 단계를 포함한다는 것입니다. 이는 생체내 연구를 위한 충분한 물질의 생성을 촉진하는데 특히 중요하다. EV를 100mL 내지 2L의 배양물로부터 분리하는데 사용하였다. 사용 가능한 TFF 장치의 범위가 넓기 때문에 이 프로토콜은 약간의 수정을 통해 대규모 정제에 적용될 수 있습니다. 설명 된 분리 프로토콜은 주로 EV의 물리적 특성, 즉 크기를 기반으로하며이 연구에서 설명한 것 이상의 박테리아 종에 적용 할 수 있습니다.
설명된 프로토콜의 한 가지 한계는 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이 소형 EV, 특히 <100nm의 분리를 선호한다는 것입니다. 이전 보고서는 또한 더 큰 박테리아 EV15,16의 존재를 설명합니다. 더 큰 박테리아 EV를 분리하려면 예를 들어 더 큰 EV에 최적화된 SEC 컬럼을 사용하여 위의 프로토콜을 수정해야 할 수 있습니다. 이러한 SEC 컬럼은 또한 상업적으로 입수가능하다. 또한 다른 프로토콜은 더 높은 EV 순도(예: 밀도 구배 초원심분리 또는 면역 분리)를 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 이 연구에서 설명한 방법의 처리량과 확장성이 부족합니다. 향후 추가 정제 단계를 통해 이 프로토콜을 수정하면 제제의 수율과 순도가 더욱 증가할 수 있으며, 이는 실험 및 치료 응용 분야에 중요할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
위에서 설명한 연구는 NIH TL1 TR002549-03 교육 보조금의 지원을 받았습니다. 입자 크기 분석기 기기에 쉽게 접근할 수 있도록 해주신 John C. Tilton 박사와 Zachary Troyer 박사(케이스 웨스턴 리저브 대학교)에게 감사드립니다. 입자 크기 분포 데이터의 분석에 대한 기술 지원을 위한 루라다인(Spectradyne); 코넬 대학교의 데이비드 퍼트넘 박사가 pClyA-GFP 플라스미드14를 제공한 공로; 펜실베니아 대학의 Mark Goulian 박사는 대장균 MP113을 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | 3430 | it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron microscopy sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter | Beckman Coulter | 392077 | Allows Vivacell to fit in rotor |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI centrifuge | Beckman Coulter | No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Brain Heart infusion (BHI) broth | Himedia | M2101 | After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains. |
| C-300 microfluidics cartridge | Spectradyne | ||
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Electron microscope | FEI company | Tecnai G2 SpiritBT | |
| Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dr. Mark Goulian (gift) | commensal bacteria derived from mouse gut | |
| Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter | ThermoFisher | 010-0151-05 | used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture |
| Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor | ThermoFisher | F12-6x500-LEX | fits 6 x 500 mL bottles |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper | Electron microscopy sciences | FCF-400-CU | |
| Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) | Electron microscopy sciences | 16100 | |
| Hematin | ChemCruz | 207729B | Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as 1.2 mg/mL |
| Infinite M Nano+ Microplate reader | Tecan | This equibment was used to measure the mCherry fluorescence | |
| In-Fusion HD Cloning Plus | Takara | 638909 | For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Lauria Bertani (LB) broth, Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | J.T. Baker | 2071-05 | It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer - special | HV-30800-08 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer - special | HV-30800-24 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft | Cole Palmer | EW-06435-16 | low-binding/low-leaching tubing |
| Menadione (Vitamin K3) | MP | 102259 | Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL |
| MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein |
| NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 | R&D Systems | MAB10026 | |
| nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | Analysis software for particle size distribution | |
| OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482 | DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking |
| Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning |
| qEV original, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 0.5 mL | |
| qEV rack | Izon | for use with the qEV-original SEC columns | |
| qEV-2, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 2 mL | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher | Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238) | |
| Qubit protein assay kit | ThermoFisher | Q33211 | Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C. |
| Sorvall Lynx 4000 centrifuge | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x Microplate reader | Molecular Devices | This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence | |
| Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE |
One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size. |
| Uranyl acetate | Electron microscopy sciences | 22400 | |
| Vinyl anaerobic chamber | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100,000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) | MilliporeSigma | WHA68093002 | to filter MRPS diluent |
References
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
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