Summary
Dit protocol presenteert essentiële celkweektechnieken en -praktijken die in het laboratorium voor onderzoekscelkweek moeten worden gebruikt om besmetting door schimmels en bacteriën te voorkomen. Binnen de categorie bacteriën zal speciale nadruk worden gelegd op het voorkomen van mycoplasmabesmetting.
Abstract
Celkweek is een delicate vaardigheid die nodig is voor het kweken van menselijke, dierlijke en insectencellen, of andere weefsels, in een gecontroleerde omgeving. Het doel van het protocol is om de nadruk te leggen op de juiste technieken die in een onderzoekslaboratorium worden gebruikt om besmetting door schimmels en bacteriën te voorkomen. Speciale nadruk wordt gelegd op het vermijden van mycoplasmabesmetting, een groot probleem in de celkweekruimte vanwege de kleine omvang en resistentie tegen de meeste antibiotica die worden gebruikt voor celkweek. Deze zelfde technieken zorgen voor continue groei en behoud van gezonde cellen. Voor zowel nieuwe als ervaren gebruikers van celculturen is het belangrijk om zich consequent aan deze best practices te houden om het risico op besmetting te beperken. Eens per jaar moeten laboratoria de beste praktijken voor celkweek evalueren en indien nodig een discussie of aanvullende training volgen. Het nemen van vroege actie om besmetting in de eerste plaats te voorkomen, bespaart tijd en geld, in vergelijking met opruimen nadat besmetting is opgetreden. Universele best practices houden celculturen gezond, waardoor de noodzaak om voortdurend nieuwe cellen te ontdooien, dure celkweekmedia aan te schaffen en de hoeveelheid decontaminatie en downtime van de incubator wordt verminderd.
Introduction
Celkweek heeft vele toepassingen in het onderzoekslaboratorium. Sinds de oorsprong van celcultuur in het begin van de 20e eeuw hebben cellijnen de wetenschap vooruit geholpen. Cellijnen hebben verschillende voordelen; Verschillende cellijnen kunnen onderzoekers helpen celbiologie te bestuderen, baculovirus te produceren voor verdere studies of grote hoeveelheden van een interessant eiwit te produceren, om er maar een paarte noemen 1. Enkele aanvullende toepassingen zijn het bestuderen van weefselgroei, het helpen bevorderen van vaccinontwikkeling, toxicologisch onderzoek, het bestuderen van de rol van genen in gezonde organismen en zieke modellen, en de productie van hybride cellijnen 2,3. Cellijnen kunnen ook de productie van geneesmiddelen mogelijk maken3. Goede aseptische technieken zijn noodzakelijk bij het werken met cellijnen; De praktijken en technieken die in dit manuscript worden beschreven, zijn van toepassing op onderzoekslaboratoria waar celkweekwerk wordt uitgevoerd. Andere laboratoriumomgevingen worden niet besproken.
Contaminatie is vaak de primaire zorg bij het uitvoeren van celkweekwerk. In de context van dit artikel verwijst besmetting over het algemeen naar schimmels en bacteriën. Het algemene doel van de methode die in dit artikel wordt beschreven, is om de beste praktijken voor het voorkomen van besmetting grondig te beschrijven. Alle laboratoriumleden moeten zich aan deze praktijken houden wanneer ze in de celkweekruimte van een onderzoekslaboratorium werken. Laboratoria moeten ervoor zorgen dat alle werknemers actief deelnemen aan het gebruik van deze beste praktijken om besmetting te voorkomen. De kennis van de juiste praktijken en technieken zal helpen ervoor te zorgen dat celculturen levensvatbaar, gezond en vrij van besmetting blijven. De ontwikkeling van deze techniek is gebaseerd op literatuuronderzoek, zeven jaar ervaring met celculturen en de behoefte aan een methode waar zowel beginners als ervaren celkweekwerkers jaarlijks naar kunnen verwijzen.
Er is behoefte aan een duidelijke, gestandaardiseerde techniek die alle onderzoekscelkweeklaboratoria moeten volgen. Veel van de literatuur over celkweekbesmetting bespreekt de detectie van mycoplasma, aseptische technieken, bronnen van besmetting, eliminatie van verontreinigingen en preventie door het gebruik van antibiotica en regelmatige tests 4,5,6,7,8. Hoewel deze informatie nuttig is, zijn er geen video's aanwezig in de literatuur die de juiste celkweektechnieken demonstreren die men moet volgen. Het voordeel van de gepresenteerde praktijken ten opzichte van alternatieve technieken is een focus op het voorkomen van besmetting voordat het gebeurt, in plaats van het later detecteren en corrigeren van fouten. Bovendien zijn een grondige demonstratie van aseptische technieken, een discussie over het voorkomen van schimmels en bacteriegroei en informatie over de luchtstroom van bioveiligheidskasten waardevol voor zowel beginnende als ervaren celkweekwerkers.
Bacteriën en schimmels zijn de twee meest voorkomende soorten verontreinigingen. Binnen de categorie bacteriën is mycoplasma een grote zorg vanwege zijn kleine omvang en het vermogen om zich te vermenigvuldigen terwijl het onopgemerkt blijft. Het zijn zelfreplicerende organismen zonder stijve celwand die afhankelijk zijn van eukaryote cellen om te groeien. Ze hebben verminderde metabolische mogelijkheden en kunnen zich sterk vermenigvuldigen terwijl ze niet worden herkend in de routinematige visuele inspectie van celculturen en regelmatige microscopische analyse, hoewel transmissie-elektronenmicroscopie mycoplasma 9,10 kan detecteren. Bovendien kunnen ze door microbiologische filtersgaan 10. Celkweekmedium voorziet mycoplasma van voedingsstoffen, hoewel het aanvullen van media met antibiotica helaas geen invloed heeft op mycoplasma10. Men moet opmerken dat het in het algemeen niet nodig is om media aan te vullen met antibiotica; Goede technieken moeten volstaan om besmetting op afstand te houden. Infectie met mycoplasma leidt niet tot onmiddellijke celdood, maar het is zorgwekkend voor onderzoekers omdat het de reproduceerbaarheid en kwaliteit van gegevens beïnvloedt.
Al het laboratoriumpersoneel moet zich strikt houden aan goede celkweekpraktijken. Culturen moeten worden getest op mycoplasma nadat ze nieuw zijn gekocht, terwijl ze momenteel worden gekweekt, vóór cryopreservatie en wanneer ontdooid uit vloeibare stikstof 2,10. Er zijn verschillende tests op de markt beschikbaar met behulp van polymerasekettingreactie (PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of immunostaining. 3 De literatuur geeft aan dat "menselijke isolaten een groot percentage van de mycoplasmaverontreinigingen vertegenwoordigen die in celculturen worden aangetroffen"5. Hoewel meer dan 200 mycoplasma-soorten zijn beschreven, zijn ongeveer zes hiervan verantwoordelijk voor de meeste infecties. Deze zes soorten zijn M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale en Acholeplasma laidlawii10. Net als bij andere soorten verontreiniging brengen lucht en aerosolen deze in celculturen5. Dit wordt herhaald in andere artikelen, aangezien de "menselijke operator potentieel het grootste gevaar in het laboratorium is"7. Hoewel dit gebeurt door menselijke fouten, kan het risico worden geëlimineerd als een standaardprocedure wordt gevolgd. Het afstoten van personeel is niet beperkt tot alleen mycoplasmabesmetting; Celculturen in het ene laboratorium zijn meestal geïnfecteerd met dezelfde mycoplasma-soort, wat aangeeft dat besmetting zich van de ene kolf naar de andere verspreidt als gevolg van onjuiste celkweektechnieken10.
Het voorkomen van kruisbesmetting is ook een andere reden waarom de juiste celkweektechnieken moeten worden gevolgd. Opgemerkt wordt dat ten minste 15% -18% van de cellijnen wereldwijd kruisbesmet of verkeerd geïdentificeerd kan zijn11,12. Naast het testen van cellijnen op mycoplasmabesmetting, moeten ze ook worden getest op kruisbesmetting10. Voor menselijke cellijnen is cellijnauthenticatie door een goedkope DNA-gebaseerde techniek genaamd short tandem repeat (STR) -profilering de huidige internationale referentiestandaard, omdat het een eenvoudige manier is om cellijnidentiteit 2,10,13,14 te bevestigen. STR kan verkeerd gelabelde of kruisbesmette cellijnen identificeren, maar het kan geen onjuiste weefseloorsprong detecteren10,13,14. De validiteit van onderzoeksgegevens kan in het gedrang komen als cellijnen verkeerd zijn gelabeld, verkeerd zijn geïdentificeerd of besmet13. Net als bij andere soorten verontreiniging kan kruisbesmetting optreden als gevolg van een slechte techniek waardoor aerosolen zich verspreiden, verkeerd contact waardoor het verkeerde celtype een kolf binnendringt, of het gebruik van dezelfde mediafles en reagentia met verschillende cellijnen10. Er mag geen mediaflessen worden gedeeld; Door één fles media tussen twee verschillende cellijnen te delen, kunnen die celpopulaties worden gemengd, waardoor het sneller groeiende celtype de kolf volledig overneemt. Deze vervanging is niet merkbaar en leidt tot verkeerde etikettering en verkeerde identificatie2. Een cellijn kan ook voor een andere worden aangezien als culturen worden verward tijdens het hanteren of labelen10. Er moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan het gescheiden houden van reagentia, media en kolven. Elk lablid moet zijn eigen mediaflessen hebben; Er mag geen uitwisseling plaatsvinden tussen lableden. Cellijnen zelf moeten worden gekocht bij een gekwalificeerde celbank en provider. Laboratoria mogen geen cellen delen. Studies tonen aan dat, hoewel STR- en mycoplasmatests regelmatig worden gebruikt, veel onderzoeksartikelen in de literatuur al verkeerd geïdentificeerde of besmette cellijnen hebben gebruikt15. Het doorzoeken van het onderzoek om deze problematische artikelen te vinden en lezers met terugwerkende kracht over deze kwestie te informeren, is omslachtig. Preventie is de beste manier om ervoor te zorgen dat dit probleem zich in de eerste plaats niet voordoet.
De eenvoudige werking van het spuiten van items met 70% EtOH kan organismen doden; 70% EtOH werkt door eiwitten te denatureren en lipiden op te lossen in de meest vervuilende organismen, waaronder bacteriën en schimmels16. Studies hebben aangetoond dat 70% de meest effectieve concentratie is; oppervlakte-eiwitten stollen niet snel met 70% EtOH zodat ze de cel kunnen binnendringen, terwijl het water dat het bevat nodig is voor het denatureringsproces van eiwitten. Door het concentratieverschil van water en alcohol aan weerszijden van de celwand komt 70% EtOH de cel binnen om zowel enzymatische als structurele eiwitten te denatureren. Als schimmelgroei in kolven wordt waargenomen, moet de hele broedmachine worden ontsmet door deze eerst met 70% EtOH te besproeien en droog te vegen, gevolgd door een incubatie van 16 uur 's nachts bij 60 °C17. Dit doodt de meeste schimmels en eventuele bacteriën.
Het belangrijkste voordeel van preventiepraktijken ten opzichte van alternatieve technieken om besmetting te elimineren nadat deze zich heeft voorgedaan, is dat door besmetting vroegtijdig te voorkomen, laboratoriummedewerkers er zeker van kunnen zijn dat hun celculturen gezond zijn en dat er geen hoge kosten verbonden zijn aan de decontaminatie van incubators of het weggooien van celculturen. De eliminatie van mycoplasmaverontreinigingen daarna is bijvoorbeeld niet efficiënt7. Door in een vroeg stadium de tijd te nemen om ervoor te zorgen dat laboratoriumpersoneel goed is opgeleid, de celkweekruimte op zichzelf staat en een standaardprocedure wordt gebruikt, bespaart u tijd en geld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereidingen
- Algemeen
- Draag een schone laboratoriumjas die alleen in de celkweekruimte en niet in andere delen van het laboratorium mag worden gedragen.
OPMERKING: De laboratoriumjas hoeft niet steriel te zijn. - Draag nieuwe handschoenen die geen andere oppervlakken hebben aangeraakt. Zorg ervoor dat de handschoenen goed aansluiten. Nitril, poedervrije handschoenen zijn het beste.
OPMERKING: De handschoenen hoeven niet steriel te zijn. - Om u voor te bereiden op het werk, spuit u de handschoenen, laboratoriumjasmouwen en de binnenkant van de biologische veiligheidskast met 70% EtOH. Veeg het werkoppervlak en het glazen paneel droog met een pluisvrije papieren handdoek.
OPMERKING: Het gebruik van 70% EtOH doodt bacteriën met de hoogste efficiëntie16. Het keukenpapier hoeft niet steriel te zijn. - Houd waterbaden in de celkweekruimte en gebruik deze alleen voor het verwarmen van kweekmedia of het ontdooien van cellen. Giet de waterbaden eenmaal per week af en was ze, volgens de instructies van de fabrikant voor het reinigen.
- Draag een schone laboratoriumjas die alleen in de celkweekruimte en niet in andere delen van het laboratorium mag worden gedragen.
- In de biologische veiligheidskast
- Beperk het aantal items dat in de kast wordt gebracht. Onderbreek de luchtstroom in de biologische veiligheidskast niet door de voorste of achterste roosters te blokkeren.
OPMERKING: Zie figuur 1 voor een uitleg van hoe lucht in een kast stroomt. - Spuit alle items die in de kast zijn geplaatst met 70% EtOH en veeg ze droog. Begin met het spuiten van de bovenkant van de mediafles en werk naar beneden. Veeg het op dezelfde manier met een schone papieren handdoek droog en werk je geleidelijk naar de bodem. Ga niet terug naar boven richting de dop.
- Als de kast groot genoeg is om serologische pipetten te huisvesten, kunnen ze binnen worden geplaatst, anders kunnen ze worden opgeslagen in een recipiënt dat aan de buitenkant van de kast is gemonteerd. Controleer voor gebruik aan weerszijden van de omhulde pipet op gaten, scheuren of lekke banden in de verpakking. Scheur de verpakking niet af. Schil in plaats daarvan voorzichtig de uiteinden van de verpakking, steek de serologische pipet in een pipethulpmiddel en verwijder de verpakking in één vloeiende beweging.
- Beweeg niet over open flessen of flacons; Reik over open flessen of flacons, of open items over de toppen van reeds geopende items in de biologische veiligheidskast.
OPMERKING: De luchtstroom in de kast drukt naar beneden op het werkoppervlak, zodat eventuele verontreiniging die bijvoorbeeld op de huls aanwezig is, de celculturen kan binnendringen. - Giet geen vloeistoffen. Voeg ze in plaats daarvan toe met een serologische pipet. Na het aanvullen van de media, meng de inhoud grondig en initialiseer de fles. Zorg er ook voor dat je een label toevoegt voor waar de media mee is aangevuld.
- Beperk het aantal items dat in de kast wordt gebracht. Onderbreek de luchtstroom in de biologische veiligheidskast niet door de voorste of achterste roosters te blokkeren.
2. Werken met aanhangende cellijnen
- Als er een plastic kolf nodig is, spuit dan de hele zak en plaats deze in de kast.
- Gebruik glazen pipetten met autoclaaf of steriele plastic wegwerppipetten om de media of wasoplossingen op te zuigen. Verwijder voorzichtig de metalen dop uit de opslagcontainer. Isoleer één glazen pipet door de container voorzichtig schud onder een hoek. Wanneer u in de container reikt, mag u geen andere pipetten aanraken.
OPMERKING: Behandel de gekozen pipet slechts aan één uiteinde. - Vervang snel de doppen op de flessen zo snel mogelijk. Plaats de doppen ondersteboven op het werkoppervlak zodat de velg het werkoppervlak niet raakt. Pak de dop niet van de boven- of onderkant; Raak in plaats daarvan de doppen vanaf de zijkanten aan.
- Gebruik bij het aanzuigen van vloeistoffen een vacuümvangerkolf buiten de kast in een secundaire container op de vloer.
OPMERKING: Gooi geen vloeibaar afval in biohazard afvalzakken, omdat de zakken dan zullen lekken. Afval ontstaat tijdens het werken in de kast. Het te vaak in en uit de kast bewegen van de handen zal de luchtstroom onderbreken. Laat al het afval tijdelijk in de kast liggen. Plaats het aan de zijkant, zodat het het werk niet onderbreekt. - Spuit de handschoenen royaal in met 70% EtOH wanneer ze droog worden. Wrijf de handen tegen elkaar zodat de handschoenen niet nat druipen.
- Als een serologische pipet per ongeluk iets in de kast raakt, aarzel dan niet om het weg te gooien. Begin opnieuw met een schone serologische pipet in plaats van er een te gebruiken die mogelijk besmet is.
4. Cellen controleren en opslaan
- Voordat u cellen in de couveuse plaatst, controleert u hoe ze er onder de microscoop uitzien. Als de cellen grondig zijn gesuspendeerd, moeten afzonderlijke cellen worden geobserveerd.
- Spreek, nies, hoest of adem niet zwaar in de couveuses. Open en sluit snel de incubatordeuren. Door deuren langer open te laten dan nodig is, kunnen verontreinigingen in de lucht de couveuses binnendringen.
OPMERKING: Het dragen van een masker tijdens het werken in de celkweekruimte kan helpen, omdat mycoplasma aanwezig kan zijn in de menselijke mond. Vermijd het gebruik van mobiele telefoons in de celkweekruimte, omdat praten niet wordt aanbevolen. - Zorg ervoor dat de doppen op alle flessen goed gesloten zijn voordat u de flessen uit de kast haalt.
- Bewaar celkweekmedia in het donker bij 4 °C wanneer ze niet worden gebruikt, omdat deze lichtgevoelig zijn.
- Spuit de binnenkant van de kast opnieuw met 70% EtOH nadat het celkweekwerk is voltooid en veeg het oppervlak droog met een papieren handdoek. Leeg de biohazard afvalzakken. Herhaal dit proces en vervang de handschoenen bij het overschakelen naar een andere cellijn.
5. Werken met suspensiecellijnen
- Voor ophangcellen gekweekt in glazen kolven, zorg ervoor dat de handschoenen grondig worden besproeid met 70% EtOH, raak vervolgens de aluminiumfolie aan met de natte handschoenen en spuit alleen de bodem van de kolf voordat u deze in de kast plaatst.
- Wanneer u een monster neemt voor het tellen van cellen, verwijdert u slechts één buis van 1,5 ml uit de container. Raak geen andere buizen aan. Plaats de dop ondersteboven op het werkoppervlak. Raak de binnenrand niet aan. Behandel het met zorg vanaf de zijkanten en vervang het zodra het klaar is.
- Verwijder voorzichtig het dubbelgevouwen stuk aluminiumfolie dat de hele hals van de kolf bedekt. Behandel de glazen kolf alleen vanaf de bodem - raak hem niet aan vanaf de nek - zodra de folie eraf is. Gebruik een serologische pipet van 1 ml om een monster te nemen voor het tellen van de cellen.
- Laat geen media langs de zijkant van de kolven druppelen; als dat het geval is, spuit dan een papieren handdoek met 70% EtOH en maak het meteen schoon.
- Zorg ervoor dat doppen en aluminiumfolie worden aangedraaid voordat u flessen of kolven uit de biologische veiligheidskasten verwijdert.
6. Celincubatie
- Gebruik aparte incubators voor verschillende celtypen om kruisbesmetting van de verschillende celtypen te voorkomen.
7. Inzameling van vloeibaar afval
- Verzamel vloeibaar afval in een vacuümvangerkolf buiten de kast op de vloer in een secundaire container met het label 'Afval'.
OPMERKING: De slang is aangesloten op een hoogrendementsfilter voor deeltjesabsorberende deeltjes (HEPA), dat maandelijks wordt vervangen.
8. Opschonen
- Verwijder de biohazard afvalzak en was de glazen kolven zo snel mogelijk. Houd een glaswasprotocol bij de gootsteen. Zie Aanvullend dossier 1 voor het wasprotocol.
- Autoclaaf het glaswerk van de celcultuur in plaats van het naar een glaswasplaats te sturen. Houd het gescheiden van glaswerk in het hoofdgedeelte van het lab.
OPMERKING: SF-9-cellen laten een rand van dode cellen achter aan de zijkant van kolven als het glas niet goed wordt geschrobd. Zie Aanvullend dossier 1 voor het autoclaafprotocol.
9. Organisatie
- Organiseer de celkweekruimte zo dat alle benodigdheden zich in één gebied bevinden, waardoor laboratoriumleden de kamer niet hoeven te verlaten op zoek naar benodigdheden.
- Label alle plastic flessen die worden gebruikt om cellen te oogsten en daarna opnieuw worden gebruikt in celkweek als 'Alleen voor celkweekgebruik'. Gebruik de aangewezen celkweekflessen voor één specifiek celtype. Bewaar de flessen in de celkweekruimte voor gemakkelijke toegang.
10. Identificatie van bacteriën, schimmels en mycoplasmabesmetting
OPMERKING: Het niet volgen van de bovenstaande workflow kan leiden tot bacteriële, schimmel- en mycoplasmabesmetting.
- Observeer altijd voordat u met het werk begint kolven voor zware troebelheid, extra groei in de vorm van wazige ballen en dichte ophopingen van cellen aan de zijkant, die allemaal indicatoren zijn van besmetting.
OPMERKING: Een ervaren oog kan het verschil zien tussen troebelheid veroorzaakt door microbiële besmetting versus de werkelijke cellen. Terwijl cellen ervoor zorgen dat de normaal heldere media troebel lijken, veroorzaakt bacteriële besmetting zware troebelheid met witte kleur.- Identificeer schimmelverontreiniging visueel door het uiterlijk van ronde, wazige ballen die in de media zweven op te merken (zie figuur 2).
- Identificeer bacteriële besmetting visueel als media troebel, wit of turbulent zijn (zie figuur 2).
- Identificeer mycoplasmabesmetting door een maandelijkse mycoplasma-test uit te voeren. Een PCR-gebaseerde test instrueert gebruikers om een monster van 1,5 ml cellen te nemen, een celtelling uit te voeren met 10 μL, te verdunnen tot 0,08 x 106 cellen / ml, de cellen te spinnen, de cellen te lyseren met behulp van de buffer in de kit en nog een laatste keer te spinnen. Het supernatant wordt geïncubeerd met primers die een reeks mycoplasma-soorten versterken. Voer een DNA-gel uit om de banden te visualiseren. Geen banden betekent dat mycoplasma niet wordt geïdentificeerd.
OPMERKING: Deze belangrijke verontreiniging kan aanwezig zijn in de menselijke mond. Het is een goede gewoonte om te testen op mycoplasmabesmetting in cellen na het ontdooien ervan en voordat ze worden gebruikt voor experimenten. Controleer daarna de cellen eenmaal per maand op mycoplasmabesmetting. Veel bedrijven bieden mycoplasma testkits aan. Kies er een die geschikt is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als de juiste celkweektechnieken en -praktijken die in dit artikel worden beschreven niet worden gevolgd, kan besmetting door schimmels en bacteriën optreden in het laboratorium voor onderzoekscelkweek. Figuur 2 toont kolven met verontreiniging in zowel de suspensie- als de aanhangende cultuur.
Wanneer u geen aseptische technieken volgt, kan schimmelverontreiniging 2-3 dagen later optreden. Ronde wazige ballen die in de media zweven, zijn merkbaar in suspensiecellen, terwijl schimmelgroei in aangehechte cellen kan worden waargenomen als grote, onregelmatige, witte of groene vlekken.
Voor bacteriën wordt besmetting de volgende dag waargenomen. De media zijn turbulent, wit en troebel. De witte kleur is typerend voor bacteriële cellen, die zich veel sneller vermenigvuldigen dan cellijnen. Een ervaren oog is in staat om het verschil te zien tussen niet-verontreinigde media en verontreinigde media. Voor aangehechte cellen kan men een fles ongeopende media vergelijken met een kolf om te controleren of er turbulentie in de kolf wordt waargenomen.
In de biologische veiligheidskast moet het aantal items tot een minimum worden beperkt. Plaats geen voorwerpen op de achterste en voorste grills (zie figuur 3). In deze kast zitten een set pipetten, tips, geautoclaveerde glazen pipetten, een pipethulp en stiften. Het werkgebied in het midden is duidelijk. Kasten op deze manier georganiseerd houden is een goed idee. Bovendien moet de operator een schone laboratoriumjas en handschoenen dragen voordat hij aan het werk gaat. Een spuitfles met 70% EtOH moet in de buurt worden gehouden, zodat de operator zijn handschoenen vaak kan spuiten. De huid is bedekt met handschoenen of een laboratoriumjas. De machinist moet zijn stoel zo instellen dat zijn armen in een hoek van 90° staan wanneer hij in de kast werkt, en items moeten binnen handbereik zijn in de kast (zie figuur 4).
Veel soorten mycoplasma kunnen betrouwbaar worden geïdentificeerd met behulp van een PCR-gebaseerde test. Figuur 5 toont de resultaten van een negatieve mycoplasmatest. De band aan de linkerkant toont de moleculaire gewichtsnormen voor DNA. De vier banden aan de rechterkant zijn positieve controles. Er verschijnen geen banden onder de geteste celtypen omdat mycoplasma niet werd gedetecteerd.
Als het medium pH-indicatoren bevat, is deze rood voor de optimale pH-waarde van cellen bij 7,4. Zodra de cellen groeien, zullen de media van kleur veranderen van rood naar geel3. Deze kleurverandering kan ook optreden als bacteriën de kolf overnemen en overwoekeren (figuur 6). De gele kleur geeft aan dat de pH laag is. Het observeren van een nieuwe, ongeopende fles media naast een kolf is een objectieve manier om besmetting in aangehechte cellen waar te nemen. Bij suspensieculturen kan de gebruiker de kolf nauwkeurig observeren op eventuele gezwellen die in de media drijven of dat er een dikke ring van overwoekerde bacteriële cellen aanwezig is rond de binnenkant van de glazen kolf. Voor beide celtypen kan een klein monster worden genomen en onder de microscoop worden geobserveerd. Als andere gezwellen of celvormen worden waargenomen, vooral als de cellen bewegen, dan is dit een indicator van besmetting (figuur 7). Een grondige reiniging van de hemocytometer moet worden uitgevoerd voorafgaand aan het tellen van de cellen, omdat dit type puin alleen op de hemocytometer aanwezig kan zijn en niet in de celculturen zelf.
De geur kan een andere indicator zijn van besmetting in een couveuse. Bacteriële overgroei heeft een typische geur die een ervaren celkweekgebruiker zal opmerken. De geur valt altijd samen met een besmette kolf, hoewel één geïnfecteerde kolf niet altijd de hele couveuse doet ruiken.
Schimmelbesmetting komt vaker voor in HEK 293 S-cellen die in suspensie worden gekweekt. Bacteriële besmetting komt vaker voor in SF-9-cellen. Dit kan zijn omdat RIC-cellen worden gekweekt met vochtigheid, wat leidt tot vochtophoping in de couveuses. SF-9-cellen worden gekweekt zonder vochtigheid, dus de omgeving is droger. De mate van besmetting in aanhangige culturen is lager dan de mate van besmetting in suspensieculturen. Dit kan te wijten zijn aan de kleinere kolfgrootte, de niet-herbruikbare aard van de kolf of de geventileerde dop in plaats van het gebruik van aluminiumfolie.
Mycoplasma kan niet worden waargenomen met het blote oog of met een gewone lichtmicroscoop, hoewel gespecialiseerde transmissie-elektronenmicroscopie mycoplasma kan detecteren. Een mycoplasma-identificatiekit moet worden gebruikt om de celculturen maandelijks te testen. Veel soorten mycoplasma kunnen betrouwbaar worden geïdentificeerd met behulp van een PCR-gebaseerde test. Een korte beschrijving over hoe deze PCR-test wordt uitgevoerd, is te vinden in de protocolsectie en meer informatie over mycoplasma is te vinden in de discussiesectie.
Figuur 1: Hoe lucht stroomt in een bioveiligheidskast. Biologische veiligheidskasten trekken vervuilde lucht uit de kamer zelf en uit de kast via de voor- en achterroosters. Deze lucht gaat onder het metalen werkoppervlak, naar de achterkant van de kast en naar de bovenkant van de unit waar zich een HEPA-filter bevindt. Daar gaat de lucht door het filter en wordt gefilterd. Deze schone lucht drukt naar beneden op het werkoppervlak. Vanwege de manier waarop de stroom gefilterde lucht in de kast naar beneden wordt geduwd, is het een goede gewoonte om niet te zweven. Het is bijvoorbeeld onwenselijk om een hoes bovenop een open fles te hebben en het risico te lopen dat mogelijke verontreinigingen in de media worden geduwd. Het aantal items dat in de kast wordt gebracht, moet tot een minimum worden beperkt en items mogen niet op de voorste of achterste roosters worden geplaatst om de luchtstroom niet te onderbreken. Ook het te snel in en uit de kast bewegen van armen kan de luchtstroom verstoren. Gemaakt voor NuAire, Inc., door Jeff Kaphingst, Jeff the Designer, LLC. Gebruikt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Niet-verontreinigde suspensie- en aanhangcellen en cellen besmet met schimmels of bacteriën. De eerste afbeelding links bevat insectencellen (SF-9 cellen) die niet besmet zijn. De tweede afbeelding toont een andere kolf van deze cellen besmet met schimmel. De derde kolf was besmet met bacteriën, zoals kan worden opgemerkt door het dikke, witte, troebele uiterlijk. De tweede en derde kolf waren besmet omdat geen van de juiste celkweektechnieken en -praktijken werd gevolgd. Alle kolven werden op dezelfde dag klaargemaakt. De groei werd de volgende dag waargenomen voor bacteriële besmetting en 2 dagen later voor schimmelbesmetting. Niet-besmette adherente cellen worden getoond (Hek293-cellen) samen met schimmel- en bacteriële besmetting in aanhangende culturen. Schimmelbesmetting wordt getoond in de tweede regel in een ronde petrischaal. De foto is genomen vanaf de bovenkant van het gerecht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Celkweekkastorganisatie. In de biologische veiligheidskast moet de hoeveelheid items tot een minimum worden beperkt. Het plaatsen van items op de achter- en voorroosters moet worden vermeden. In deze kast zitten een set pipetten, tips, geautoclaveerde glazen pipetten, een pipethulp en stiften. Het werkgebied in het midden is duidelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De juiste manier voor een operator om onder de stroomkap te werken. Een operator moet een schone laboratoriumjas en handschoenen dragen voordat hij aan het werk gaat. Een spuitfles met 70% EtOH moet in de buurt worden gehouden, zodat de operator zijn handschoenen vaak kan spuiten. De huid wordt bedekt door de handschoenen of labjas. De machinist moet zijn stoel zo instellen dat zijn armen in een hoek van 90° staan wanneer hij in de kast werkt. Items moeten binnen handbereik zijn in de kast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Een negatief mycoplasma testresultaat. Veel soorten mycoplasma kunnen betrouwbaar worden geïdentificeerd met behulp van een PCR-gebaseerde test. De band aan de linkerkant toont de moleculaire gewichtsnormen voor DNA. De vier banden aan de rechterkant zijn positieve controles. Er verschijnen geen banden onder de geteste celtypen omdat mycoplasma niet werd gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Normale mediakleurverandering van rood naar geel. Celkweekmedia veranderen de kleur van rood naar geel als pH-indicatoren aanwezig zijn. De gele kleur geeft aan dat de pH laag is en dat de media moeten worden vervangen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Verontreinigingen waargenomen onder de lichtmicroscoop. Als andere gezwellen of celvormen onder de lichtmicroscoop worden waargenomen tijdens het uitvoeren van celtellingen, kan dit een indicator zijn van besmetting. Opgemerkt moet worden dat een grondige reiniging van de hemocytometer moet worden uitgevoerd voorafgaand aan het tellen van de cellen, omdat dit type puin alleen op de hemocytometer aanwezig kan zijn en niet in de celculturen zelf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Bijlage Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel besmetting een van de belangrijkste zorgen is bij het uitvoeren van celkweekwerk, zullen de praktijken en technieken die in dit manuscript worden beschreven, helpen de risico's te beperken. De kritieke stappen omvatten het dragen van een schone laboratoriumjas, die alleen wordt gebruikt in de celkweekruimte, met behulp van schone, poedervrije handschoenen die vaak met 70% EtOH worden besproeid en die worden vervangen bij het schakelen tussen cellijnen, het aanmoedigen van elk individu om geen mediaflessen te delen, het grondig reinigen van de kast voor en na het voltooien van het werk, Serologische pipetten netjes uitpakken, langdurig nauw contact met open flessen of kolven vermijden, mediaflessen niet delen tussen meerdere cellijnen en snel incubatordeuren openen en sluiten. Bovendien zorgt het wassen en autoclaveren van het eigen glaswerk voor kwaliteitscontrole, waardoor de kans op het introduceren van verontreinigingen van buitenaf wordt verminderd. Kwaliteitscontrolemethoden omvatten het gebruik van autoclaaftape om aan te geven of de sterilisator de juiste temperatuur van 121 °C heeft bereikt, regelmatig preventief onderhoud van de apparatuur en visuele inspectie van de kolf om ervoor te zorgen dat deze correct is geschrobd18. Een ander belangrijk punt is om afzonderlijke incubators voor verschillende celtypen te gebruiken om ervoor te zorgen dat besmetting van het ene celtype niet wordt overgedragen op andere en om er ook voor te zorgen dat kruisbesmetting met cellen niet optreedt.
Bacteriële en schimmelinfecties zijn de twee meest voorkomende indringers in celculturen. Een van de belangrijkste verontreinigingen, M. orale, is de meest voorkomende mycoplasma-soort in de menselijke mond en vertegenwoordigt ook "het meest voorkomende isolaat dat goed is voor 20% -40% van alle mycoplasma-infecties in celculturen"4. Met andere woorden, laboratoriumpersoneel is de belangrijkste bron van deze besmetting. Het is altijd een zorg in de celkweekruimte, omdat mycoplasma een klein, langzaam groeiend micro-organisme is zonder een stijve celwand die door 0,45 μm filters kan gaan4. Studies tonen aan dat de incidentie van mycoplasmabesmetting 15%-35% is van continue menselijke of dierlijke cellijnen4. Bovendien geven statistieken aan dat ongeveer 5% tot 30% van de cellijnen in de wereld besmet zijn met mycoplasma's6. Helaas is mycoplasma resistent tegen de meeste antibiotica die worden gebruikt voor celkweek en kan infectie de celfysiologie en het metabolisme beïnvloeden 4,6. Hoewel besmetting het celmetabolisme niet vertraagt, kan het het eindproduct wel besmetten6. Infecties kunnen blijven hangen zonder dat laboratoriumleden celschade opmerken. Als er besmetting optreedt, zijn de kosten van het ontdooien van nieuwe cellen, de tijd die wordt besteed aan het verspreiden van de nieuwe culturen, de dure media die zijn verspild, het ontsmetten van couveuses en de hoeveelheid tijd die collega's besteden aan het wachten om hun experimenten opnieuw te beginnen, enorm. Ons laboratorium schat dat de totale verloren tijd goed is voor 2 weken en de totale kosten in verband met besmetting van een typische menselijke zoogdierceleiwitexpressie van 8 L $ 1.400 bedragen. De praktijken en technieken die in dit manuscript worden beschreven, bieden goede preventieve maatregelen om extra kosten, verloren cellen en downtime te beperken.
Wijzigingen van deze praktijken worden niet aanbevolen. Alle lableden moeten worden opgeleid voordat ze in de celkweekruimte werken en vervolgens elk jaar een opfriscursus krijgen7. Lableden moeten ook de celkweekruimte zo organiseren dat alle benodigde benodigdheden zich in één gebied bevinden, waardoor de noodzaak voor laboratoriumleden om de celkweekruimte te verlaten op zoek naar benodigdheden wordt geminimaliseerd.
Beperkingen van de gepresenteerde technieken worden waargenomen als besmetting afkomstig is van externe bronnen zoals serum, couveuses, slecht functionerende autoclaven, vuile laboratoriumjassen of de bron van de cellen. Probleemoplossing van de techniek kan nodig zijn als besmetting optreedt ondanks strikte naleving van dit protocol. Veel externe factoren kunnen bijdragen aan dit type besmetting. Lableden moeten voorzichtig zijn en externe bronnen controleren. De partij foetaal runderserum (FBS) die bij de leverancier is gekocht, kan bijvoorbeeld zijn verontreinigd met mycoplasma. In vergelijking met de jaren 1950 is dit nu een zeldzame gebeurtenis, maar het kan nog steeds gebeuren6. Alle mediaflessen moeten worden weggegooid als er verontreiniging wordt opgemerkt en het protocol moet opnieuw worden gestart door nieuwe cellen te ontdooien en nieuwe media te gebruiken. De besmetting kan al aanwezig zijn geweest in de couveuse als het schimmels of bacteriën zijn; De andere kolven in dezelfde couveuse moeten worden gecontroleerd om te zien of bacterie- of schimmelgroei wordt waargenomen. Alle besmette kolven moeten worden weggegooid en de couveuse moet worden ontsmet. Als er geen verontreiniging wordt gevonden, moet de autoclaaf worden gecontroleerd op defecte fouten; Het glaswerk is misschien in de eerste plaats niet goed geautoclaveerd. De autoclaaftape kan van kleur veranderen ondanks dat de autoclaaf geen 121 °C bereikt. Daarna moeten de vervaldatums op de gebruikte antibioticaoplossingen worden gecontroleerd; Mogelijk moeten er nieuwe oplossingen worden aangeschaft. Ten slotte moet de bron van de cellen worden overwogen; Waren ze van een vertrouwde lableverancier of geleend van een ander lab? Cellen moeten altijd worden gekocht bij een vertrouwde laboratoriumleverancier en mogen nooit worden geleend van een ander laboratorium. Ten slotte moeten laboratoriumjassen worden gewassen om hun netheid te garanderen19. Decontaminatie van incubatoren moet worden overwogen wanneer een kolf is verontreinigd. Bacteriecellen of schimmelsporen mogen zich niet vermenigvuldigen en besmetting blijven verspreiden.
Bestaande methoden reflecteren op het elimineren van verontreiniging. De methoden die in dit manuscript worden beschreven, richten zich op preventie in plaats van het elimineren van besmetting. Er bestaan verschillende procedures met betrekking tot het gebruik van antibiotica om mycoplasma20 te verwijderen. Het gebruik van antibiotica is echter riskant omdat ze de infectie mogelijk niet volledig elimineren en "resistente organismen in staat kunnen stellen zich te ontwikkelen"12. In feite bleek "72% van de culturen die continu in antibiotica werden gekweekt mycoplasma-positief te zijn, terwijl slechts 7% gekweekt in afwezigheid van antibiotica geïnfecteerd was"12. Deze gegevens benadrukken het idee dat hoewel het gebruik van antibiotica wordt aanbevolen en nuttig kan zijn, overmatig gebruik of volledige afhankelijkheid van antibiotica niet gunstig is. Bovendien kan het gebruik van antibiotica om besmetting te verwijderen het probleem alleen maar laten voortbestaan. Antibiotische oplossingen zijn niet nodig; Als de technieken in dit artikel worden gevolgd, moet besmetting met succes worden voorkomen.
De praktijken en technieken die in dit manuscript worden beschreven, kunnen in de toekomst worden gebruikt om een aseptische omgeving te behouden bij het uitvoeren van de maandelijkse mycoplasma-test en bij het maken van zelfgemaakte competente bacteriële cellen. Beide protocollen vereisen een schone omgeving, vergelijkbaar met celkweekwerk, zodat het eindproduct niet besmet is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft geen tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
Dit werk is mogelijk gemaakt dankzij financiering van het Howard Hughes Medical Institute (HHMI). We willen ons hoofd van het lab, Jue Chen, bedanken voor het lezen van het manuscript en voor haar voortdurende steun, Donna Tallent voor haar behulpzame bewerkingen en opmerkingen, en Jeff Hennefeld van de afdeling Informatietechnologie aan de Rockefeller University voor zijn hulp bij de videocomponent van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
- Stacey, G. N.
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R.
- Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
- Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020).
- Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
- Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
- Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
- Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties (2023).
- United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004).
- Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023).
- Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020).
- Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
