Summary
ويستخدم على نطاق واسع لطباعة Microcontact نمط البروتينات والجزيئات الأخرى على السطوح المادية. نحن لشرح الخطوات الأساسية لهذه العملية ، وختم أنماط فبرونيكتين على الزجاج.
Abstract
القدرة على نمط البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى على ركائز مهمة لالتقاط التعقيد المكاني للبيئة خارج الخلية. تطور الطباعة microcontact من قبل مجموعة ايتسايدز (
Protocol
1. تحضير محاليل ومواد
وينبغي تنفيذ هذه الخطوات من قبل عدة أيام.
- coverslips الزجاج. وتم تنظيف Coverslips عن طريق الغمر لمدة 10 دقيقة في حل من المنظفات 7X Linbro : المياه ، ومختلطة في 1 : 3 نسبة وساخنة ، مع التحريك حتى اضحة. وتشطف بالماء على نطاق واسع Coverslips منزوع الأيونات ، ويخبز في درجة مئوية ثم 450 لمدة 6 ساعات. تحميل coverslips في رفوف تلوين السيراميك (انظر الكواشف) تبسيط هذه العملية.
- حل البروتين للدمغ. فبرونيكتين إعادة اتباع الإرشادات مصنعين الى حل الأسهم التركيز ملغ / 1 مل.
2. المدلى بها من الطوابع سيد طوبولوجي
ويمكن تنفيذ هذه الخطوات من قبل عدة أيام. طوابع تخزين نمط المتابعة في صحن مغطى ، مثل الأنسجة صحن الثقافة.
- إزالة الغبار فضفاضة من سيده باستخدام تيار من ضغط الهواء أو الغاز الخامل تصفيتها.
- المكان الرئيسي ، جنبا منقوشة فوق ، في قعر طبق من البلاستيك أكبر من مجرد الرئيسي. هي مناسبة تماما أو 100 ملم أطباق زراعة الأنسجة لهذا الغرض -- 60.
- جهاز للطرد المركزي في أنبوب 50 مل البوليسترين ، والجمع بين مكونات Sylgard في نسبة الشفاء وكيل : وزنا (10) : قاعدة الاستومر 1. مزيج دقيق باستخدام جهاز من البلاستيك ، مثل ماصة المتاح. إعداد ما لا يقل عن 0.2 مل من المطاط الصناعي لكل سنتيمتر مربع من مساحة الطبق.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 50 مل في 300 G لمدة 5 دقائق لإزالة فقاعات الهواء.
- صب الاستومر على الماجستير ، ثم ضع في مجفف ، تحت فراغ ، لمدة 30 دقيقة.
- علاج الاستومر في الفرن عند 65 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة. علاج عند ارتفاع درجات الحرارة والنتائج أوقات أطول في صلابة المطاط الصناعي. السماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- ورقة منفصلة من الطوابع من الربان.
3. Microcontact الطباعة على الزجاج من فبرونيكتين
- قطع طابع واحد. طوابع قياس 4 مم X 4 ملم إلى 1 سم × 1 سم في المنطقة و1-2 مم هي أسهل لتبدأ. مكان نمط الجانب حتى على شريحة زجاجية أو صحن صغير من البلاستيك.
- مكان الطوابع في نظافة البلازما ، والعملية ، في ظل فراغ ، لمدة 30 ثانية. وسوف يحافظ على نظافة Harrick البلازما العلمية (انظر معدات) ، التي وضعت في إطارها أعلى الإخراج تجعل سطح ماء PDMS. في أوقات أطول نتيجة تشقق المطاط الصناعي.
- تمييع الحل فبرونيكتين مع الماء منزوع الأيونات إلى تركيز ختم 50 ميكروغرام / مل.
- وضع قطرة صغيرة (10-50 ميكرولتر) ختم حل على الطوابع. وسوف تنتشر عبر سطح ماء. إضافة الحل الوحيد يكفي أن الانخفاض يشمل الطابع ، ولكن لا يعمل على الحواف. اسمحوا كثف البروتين للقضاء لمدة 5 دقائق.
- باستخدام ® Kimwipe أو غيرها من المناديل الورقية النظيفة ، والفتيل من أكثر من البروتين من الحل الطابع ، من دون لمس المنطقة منقوشة.
- تجفيف حل ما تبقى من الطابع تحت سيل من تنظيف والغاز والخاملة الجافة ، مثل النيتروجين.
- باستخدام الملقط ، وإزالة الطابع من شريحة زجاجية ، قلب ، ومكان وعلى اتصال مع تنظيف الزجاج ساترة (يتم منقوشة على السطح). وضع الوزن على رأس لتشجيع الاتصال الجيد. الوزن النوعي الذي يوفر أفضل الزخرفة يعتمد على حجم طابع ونمط ؛ يبدأ الوزن ز 5 ، وبين ضبط تركيب الجمله. ترك في اتصال مع طابع السطحية : 1 دقيقة.
- تفكيك المكدس بعناية ، وختم منفصلة عن ساترة.
- شطف بقوة ساترة منقوشة في برنامج تلفزيوني ، يليه الماء منزوع الأيونات ، لإزالة البروتين الذي لا كثف إلى السطح. ساترة الجافة تحت دفق النيتروجين.
ممثل النتائج
الطباعة Microcontact هو عملية قوية لجزيئات الزخرفة على الأسطح. هذه العملية لديه القدرة على خلق ملامح ذات أبعاد تتراوح بين عشرات الى مئات ميكرومتر نانومتر ، في الشكل. 1A ، والشعارات على اليسار هي كل 200 ميكرومتر في الارتفاع ، في حين أن البقع الخضراء هو موضح في الشكل. 1B هي 1 ميكرون في القطر ، وعلى فترات متباعدة 4 ميكرون ، ويقاس المركز إلى المركز. التين. 1B يوضح أيضا خاصية الطباعة microcontact قوية ، وهي أنه من وعملية المضافة. ويمكن تطبيق جولات متعددة من microcontact الطباعة على سطح واحد لإنشاء نظم متعدد المكونات 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عملية الطباعة microcontact المفهوم بسيط وقوي جدا ، بعد أن تم تطبيقه على الزخرفة مجموعة واسعة من الجزيئات على مجموعة متنوعة من ركائز. ومع ذلك ، فإن هذه العملية لا تزال شيئا من الفن. هندسة محددة لنمط المزمع إنشاؤها ، لتكون منقوشة البروتين والوزن التطبيقية ، وطلاء / الشروط ختم كل ذلك يؤثر على جودة دمغ. على سبيل المثال ، والوزن القليل جدا ، وتطبيقها على ميزات كبيرة ، وغالبا ما ينتج عنه ثغرات في نمط كما يمكن أن يرى في شعار اليمنى العليا من الشكل. 1A. على العكس ، الكثير من الوزن ويسبب ترهل وانهيار الطابع ، مما أدى إلى ترسب البروتين في غير مقصودة من المناطق بين منقوشة features.As مثال ثان ، بروتينات معينة (مثل الأجسام المضادة) مع نمط أفضل الإخلاص إذا تم حذف خطوة العلاج البلازما ، ترك PDMS ماء. يتم تقديم ختم فبرونيكتين على الزجاج هنا كنقطة انطلاق لهذه التعديلات والتحسينات ، مما يدل على التقنيات الأساسية لهذه العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
- Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).
- Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).
- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
