В этом видео-статье мы представляем шаг за шагом демонстрацию о том, как собирать и cryopreserve хомяка ооциты с высоким после оттепели выживаемости. Аналогичная процедура может быть применен и к успешно замораживания и оттаивания эмбрионов мыши на разных этапах предимплантационной развития.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сбор и Криоконсервация ооцитов хомяка и мыши Эмбрионы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эмбрионы и ооцитов были впервые успешно криоконсервированных более 30 лет назад, когда Уиттингем
Протокол
Ухода за животными и процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами и положениями, утвержденными Комитетом по этике на человека и животных Исследование Universitat Автономного Барселоны, Испания.
И. ооцитов коллекции
- Проверить и выбрать женский хомяков (Mesocricetus рыбки; 8-12 недели назад) Золотой сирийской напряжение на наличие толстого выделения из влагалища (постовуляторной разряд).
- Вызвать выбранных самок superovulate путем внутрибрюшинного введения 40 МЕ PMSG (Беременные Маре Сыворотка гонадотропин), затем 40 МЕ ХГЧ (хорионический гонадотропин человека) 60 часов спустя.
- Эвтаназии женщины хомяков 16 часов после введения ХГЧ в камеру углекислого газа.
- Изолировать от яйцеводы женщины, как показано на видео и передавать их на каплю KSOM-H среды.
- Сбор ооцит-кучевые комплексов, оторвав яйцевода ампула под стереоскопическим микроскопом в капле гиалуронидазы (156 ед / мл) при 37 ° C. Ооциты будет освобожден от клеток кумулюса примерно в 5 минут.
- Возьмите ооцитов от гиалуронидазы и мыть их дважды в KSOM-H среды.
Для сбора эмбрионов мыши, самки мышей (Mus мышцы; 6-8 недели назад) индуцируются на superovulate путем внутрибрюшинного введения 5 МЕ PMSG затем 5 МЕ ХГЧ 48 часов спустя, и совокуплялись с самцов мышей. Женщины жертвуют цервикальным сдвигом на 24-26, 44-46 или 54-56 часов после введения ХГЧ для obtention из пронуклеусов, 2-клетки или 4-элементный эмбрионов этапе, соответственно. Сборник пронуклеусов эмбрионов выполняется точно так, как описано для хомяка ооцитов. Эмбрионы на 2-клеток и 4-элементным этапах собираются промывки яйцеводы с KSOM-H среды [6].
Примечание: В соответствии с этим протоколом примерно от 20 до 30 яйцеклеток / эмбрионов могут быть собраны с каждой женщиной.
II. Подготовка замораживания и оттаивания решения
- Подготовка решение, которое я разбавлением 0,57 мл propilenglycol в 5 мл KSOM-H (1,5 М propilenglycol).
- Подготовка оттаивания решение, добавив 2 мл KSOM-H для трубы с 0,2052 г сахарозы (0,3 М сахарозы).
- Подготовка замораживания решение, добавив 2 мл раствора я в трубку с 0,0684 г сахарозы (1,5 М propilenglycol и 0,1 М сахарозы).
Примечание: Я решение и замораживания и оттаивания решения должны быть подготовлены как раз перед их использованием. Тем не менее, указанное количество сахарозы, которые будут использоваться для подготовки замораживания и оттаивания решения могут быть взвешены заранее и хранить в 3 мл трубки при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
III. Замораживание протоколов
- Передача ооцитов / эмбрионов из KSOM-H средних каплю раствора я и инкубировать в течение 7-15 минут при комнатной температуре.
- Между тем, подготовить 90 мм чашки Петри для загрузки соломкой, разместив 90 мкл капли замораживания и оттаивания решения, как это показано на видео (1 капля каждого решения / соломы).
- Передача необходимое количество яйцеклеток / эмбрионов для замораживания капель раствора.
Примечание: Мы обычно передачи от 5 до 30 яйцеклеток или эмбрионов / вывода. - Прикрепить соломенного до устья управляемой системы аспирации и загрузить его следующим таком порядке: решение, которое я, воздуха, замерзания капли с ооцитов, воздух, таяние капли, воздух.
- После соломы загружена, сохранить аспирационных до первой капли введен (раствор I) достигает полимера на верхнем конце соломы и тюленей в этом направлении. Термо-печать другом конце соломы или печать с пластиковой заглушкой.
- Включите программируемых морозильник и выберите замораживании программы. Замораживание программы, используемые в настоящем протоколе основан на скоростях охлаждения первоначально опубликовано Лассаля и др.. [7]:
- 2 ° С / мин от комнатной температуры до -7 ° C
0 ° С / мин в течение 10 мин, чтобы обеспечить равновесие температуры и индукции посева (см. ниже) - 0,3 ° С / мин от -7 ° C до -30 ° С
0 ° С / мин в течение 2 мин, чтобы обеспечить температуру равновесия - 35 ° С / мин от -30 ° С до -130 ° С
- 2 ° С / мин от комнатной температуры до -7 ° C
- Нагрузка на соломинки слотов владельца программируемых морозильник, убедившись, что часть соломы с каплей оттаивания решение наружу. Начать замораживание программы.
- Когда температура образца достигает -7 ° С и охлаждение на удержание, произвести ручную посева: окунуться щипцов в жидкий азот, потяните держатели немного не в морозильник, чтобы выставить часть соломинки содержащие капли оттаивания решение, и сразу же коснуться этой части соломинки с щипцами. Повторите эти действия для каждого держателя, и каждый соломы в держатель, а затем пусть замораживание программы продлится до конца.
- Когда программа завершится, окунуться держателей в жидком азоте.
- Удалить из соломкивладельцы и передавать их на помечены gobelet.
- Наконец, хранить gobelet внутри резервуар жидкого азота.
IV. Размораживание протокола
- Удалить из соломы резервуар жидкого азота.
- Поддерживать соломы при комнатной температуре в течение 40 секунд.
- Замочите соломы на водяной бане при температуре 30 ° С в течение 40 секунд.
- Удалить вилку из соломы или вырезать термо-запечатанном чаевые.
- Пустые соломы в 35-мм чашки Петри и хорошо смешайте две капли, содержащие замораживания и оттаивания решений.
- Оставьте ооцитов / эмбрионов в смеси в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Передача ооцитов / эмбрионов свежие капли KSOM-H для еще 15 минут при 37 ° C.
- Ооцитов / эмбрионов теперь готовы для дальнейшей манипуляции.
Примечание: Во время действия 6 и 7 вы увидите, что талые яйцеклеток / эмбрионов медленно раздуваются за счет регидратации.
Результаты В. представитель
Использование протокола криоконсервации сообщили здесь результаты в выживаемости примерно 95% для хомяка ооцитов и> 90%, 85% и 80% для мыши B6CBAF1 эмбрионов на пронуклеусов, 2-клеток и 4-элементным этапах соответственно. Когда мышь эмбрионы культивировали в пробирке в KSOM после оттаивания, по крайней мере от 70 до 80% должна достичь стадии бластоцисты в оптимальных условиях культуры.
Рекомендуется, чтобы вы включили контрольной группе (соломы) ооцитов / эмбрионов в каждом замораживания эксперимент, и что вы оттепель эту группу раньше остальных яйцеклеток / эмбрионов используются для дальнейших манипуляций. Если выживаемость в контрольной группе ниже, чем ожидалось, оттепель другой соломы от той же партии. Если выживаемость для этой второй группы также низко, отбросить оставшиеся соломинки из этого замораживания много.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
С помощью этого протокола хомяка ооцитов и эмбрионов мыши могут быть успешно криоконсервированных. Как только замороженные, ооциты / эмбрионы могут храниться в жидком азоте танки на неопределенный срок и восстановления в любое время или место лучшего. Это дает преимущество, что образцы почти готова к использованию, когда это необходимо. С другой стороны, этот протокол также может быть использован для создания эмбриона криобанков из ценных линий мышей (например, трансгенные линии), а экономические и безопасной альтернативой для поддержания ж...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Эта работа была поддержана испанский Ministerio де Educación у Ciencia (BIO 2006-11792) и Женералитата Каталонии (2005-SGR00437). Авторы хотели бы поблагодарить Марка Puigcerver и Джонатан Лукас за техническую помощь в подготовке информации. Все сотрудники Servei d'Estabulari признается для содержания животных, и особенно Хуан Хосе Мартин и Хавьера Бенито для их дополнительного взноса на запись часть этого видео. НЦБ является членом португальской Fundação пункт Ciencia электронной Tecnologia и SG является членом испанской Ministerio де Educación у Ciencia.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Название материала | Тип | Компания | Номер по каталогу | Комментарий |
| Мини-соломинки французского типа 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Гиалуронидаза | Sigma | H-3884 | ||
| Среда KSOM-H | Ref. [11] | |||
| Жидкий азот | Air Liquide | |||
| Пластиковые пробки | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Пропиленгликоль | Fluka | 82280 | ||
| Сахароза | Merck | 107687 | ||
| Хирургические ножницы | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Термозапаиватель | SIZ | 220 | ||
| Чашки для культивирования 35 и 90 mm | Nunc | 153066; 150350 | ||
| Пробирки 10 ml | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Азотный резервуар | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Программируемый морозильник | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Пинцеты | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
Ссылки
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
