بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 3 يصف عملية وضع العلامات fluorescently تضخيم الحمض النووي الريبي من كل من المضيف والعينات الفيروسية التي اقتران الآليل الأمينية من الأصباغ. الجزء 3 من 3.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 3
في هذه المقالة
ملخص
البروتوكول
الجزء 1 : آرنا العلامات : الأمينية اقتران الآليل من الأصباغ
- إضافة 1μg من العينات آرنا في أنابيب microcentrifuge 1.5mL.
- فراغ تجفيف العينات في درجة حرارة منخفضة أو معدومة حتى تجف تماما. سقف كل أنبوب في أقرب وقت كما هو جاف -- لا overdry!
- إضافة إلى اقتران 9μl العازلة لكل أنبوب وresuspend وآرنا بواسطة vortexing بلطف لمدة 1 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع العينات في الجزء السفلي من الأنبوب ثم يسمح العينة الجلوس على ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خطوات حاسمة
عند إجراء اقتران الأمينية الآليل ، فمن الأهمية بمكان أن resuspend الصبغة DMSO في فترة وجيزة (أقل من 1 ساعة) قبل توصيل المياه وضمان عدم وجود مزيج يحصل في صبغ / DMSO ، لأنها سوف تتفاعل مع مجموعة نشطة على صباغة. لا overdry الحمض النووي الريبي (يمكن أن تجفف وصولا الى 2uL - 1 بدلا من يجف تماما) ، وكذلك في resuspend العازلة اقتران. خلال رد فعل اقتران ، والحفاظ على رد الفعل في الظلام ، مع التحريك بين الحين وتد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
معهد وايتهيد زملاء صناديق
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| مجموعة صبغات CyDye التفاعلية للوسم اللاحق | كاشف | GE Healthcare | RPN5661 | تحتوي على صبغتي Cy3 وCy5 |
| مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND-1000 UV-VIS | أخرى | NanoDrop | ND-1000 | أو مقياس طيف ضوئي مكافئ |
المراجع
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickso....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
