ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

في الواقع ما سأفعله ، قم بتثبيته هنا أولا ثم قم بتبديلك. لذا سأطمح الآن وأحاول أن أكون لطيفا قدر الإمكان. حسنًا. بضع ثوان فقط تمسك. حسنا ، حسنا.لذا فإن السمات المهمة لشبكة تصوير نمط الحياة لدينا هي أنه ، لذلك فهو نطاق مقلوب ، مما يعني أن الهدف ، العينات هنا في الهدف تحتها. لذا فإن الهدف هو الإشارة إلى الأعلى والنطاق بأكمله ، أو عمليا الكل ، عمليا النطاق بأكمله ، بما في ذلك الأهداف والعينة عند 37 درجة. لذا فإن كل شيء في هذا الصندوق البلاستيكي عند 37 درجة.وعلى رأس المسرح مباشرة لدينا مزيج من الهواء وثاني أكسيد الكربون. هذا هو 5٪ CO2. لذا فإن الفكرة هي أن العينة موجودة في الواقع في خلية ، إنها مثل حاضنة الخلية.وهكذا لدينا، هذا هو الخلاط الخاص بنا للهواء وثاني أكسيد الكربون2، ويتم ترطيبه وتسخينه ثم نقله على العينة على المسرح. حسنًا. واليوم سنقوم فقط بعمل مضان GFP أحادي القناة. هذا هو الخرطوم الذي يدخل فيه ثاني أكسيد الكربون و 5٪ CO2 ويتناسب تماما مع حامل المسرح.هذا مهم. وبعد ذلك يمكننا أن نغلقها، ونزيلها، ثم ننتقل إلى موضعنا الأول. وما سأفعله هو الذهاب إلى الحقل الأول ، وهو عينة التحكم الخاصة بي ، وسأختار المواضع بناء على ما أراه على الشاشة.لذلك أتأكد فقط من أنني أنظر بالفعل إلى المجهر في كل جديد ، حسنا ، لأن المستوى البؤري لكل بئر مختلف ، الطبق ليس مسطحا تماما في الأسفل. لذلك سوف تحتاج إلى إجراء تعديلات دقيقة عند الانتقال من البئر إلى البئر. لذا في الوقت الحالي أنا في البداية ، حسنا ، ما سأفعله هو أنني سأركز ، لذلك لقد ضربت للتو ، أخبرت للتو ، لقد قمت للتو بتشغيل الضوء ، الضوء المرسل للمجهر.وقد تأكدت من أن كل الضوء يذهب إلى قطع العين. ولذا فأنا فقط أنظر إلى الداخل ، وتأكد من حصولي على حقل نظيف لطيف. وبعد ذلك ما سأفعله هو إطفاء هذا الضوء ، وتشغيل ضوء التألق ، والتأكد من أن الخلايا التي أنظر إليها تبدو صحية وأنها ليست موت الخلايا المبرمج.وأنا أطفئ ذلك. وما أفعله بعد ذلك هو الإرسال ، لذا سأبدأ الآن في اختيار المواضع ، مما يعني أنه يجب علي إرسال مسار الضوء إلى الكاميرا. هذه هي الكاميرا هنا.لذلك أخبر المجهر أن يرسل كل الكاميرا ، فهم لا يرون أي شيء في قطع العين. ما سأفعله هو في البرنامج الذي يتحكم في المجهر ، سأختار مجموعة المرشحات المناسبة ، والتي هي لأغراضنا psy. ثم اضبط وقت التعرض.وأنا أعرف هذه الخلايا جيدا وأعلم أنها تستغرق وقتا تعريضا يبلغ 0.2 ثانية. لذلك أقول ، هذا ما أقول للبرنامج القيام به. وما سأفعله هو الضغط على التركيز.هذا هو ، وهو في الأساس على قيد الحياة. سيضيء الضوء ويمكنك، أوه، لا أعرف ما إذا كان بإمكانك رؤية الخلايا، ولكن السبب في أن هذا مجال جيد هو أن هناك، جميع الخلايا، حتى من حيث تألقها، لا توجد خلايا موت الخلايا المبرمجة. تميل الخلايا المبرمج إلى أن تكون ساطعة جدا ولا توجد أوساخ أو شموتز في الحقل.ويمكنكم أن تروا أنهم في الواقع ، هذه خلية طور الطور وهي خلية الطور ، وهي خلية ربما خرجت للتو من الانقسام. ويمكنني فقط أن أقول أنه لأنه يبدو وكأنه ، فإن هاتين المجموعتين من الكروماتين موجهتان بشكل جيد للغاية لبعضهما البعض. كما لو كانوا خرجوا للتو من الوجه.لذلك هذا مجال جيد. لذا ، والآن بعد أن عرفت أن وقت التعرض ومجموعة المرشحات صحيحان ، وسيكون هذا خاصا بالبرنامج ، سأذهب وسأتخذ مواقف والآن حفظ البرنامج موضع X و Y و Z لهذا المجال. وبعد ذلك عندما أختار حقلا آخر ، فسيكون ، وسأفعل ذلك ، لذلك عندما أختار ، عندما أختار حقول جديدة ، ولكن في نفس الوقت ، حسنا ، سأستخدم ، سأحرك ، سأدير الغالق ، سأفتح الغالق وسأبحث لأرى ما أراه على الشاشة وسأختار الحقول بناء على ذلك مقابل النظر في الحقل.لذلك لا أرى أيا من المقويات الخاصة بي هناك. ولكن مرة أخرى ، حتى في المركز الجيد ، ستمر هذه الخلايا عبر PS الخاص بي ، وأتابع ، إليك مثال جيد. إليك مثال جيد على ما أود تجنبه ، انظر إلى أي مدى سطوع؟هذا مشرق جدا. ربما تكون هذه بقايا خلية موت الخلايا المبرمج. والسبب في أنني سأتجنب ذلك هو أنه نظرا لأنه ساطع جدا ، عندما يركز البرنامج تلقائيا ، فإنه سيقوم بالتركيز التلقائي على ذلك فقط ولن يكون في نفس المستوى مثل كل هذه الخلايا الأخرى.ولذا لن أحصل على أي معلومات من هذا المجال. هذا يبدو لطيفا. هناك ، هذا هو الطور الاحترافي هنا ، هذا هو الطور الطوري.لذا ، وسأتخذ ثلاثة مراكز لكل بئر. كانت هذه ثلاثة أوضاع والآن سأذهب إلى بئر التالي ، لذا يمكنك ذلك ، لذا ما سأفعله على الأرجح هو التقاط الصور كل 10 دقائق. لذلك فهو حل وسط.تصوير نمط الحياة هو دائما حل وسط، أليس كذلك؟ عليك أن تتخيل ، عليك أن تحافظ على صحة الخلايا ، خاصة إذا كنت مهتما بالانقسام. لذلك عليك تقليل تعرضهم لخط الفلورسنت.ولكنك تريد الحصول على معلومات. لذلك عليك أن تلتقط الصور ، عليك أن تفعل ذلك ، لذلك عليك أن تتنازل ، عليك أن تختار ما تريد التقاطه ، ونوع المعلومات التي تريد التقاطها. لأغراضنا ، يميل الانقسام إلى أن يستغرق حوالي ساعة.لذا إذا كنا نأخذ فترات زمنية مدتها 10 دقائق ، فهذا جيد جدا. نرى الطور الأولي ، ونرى الطور ، ونرى الطور ، ويمكننا أن نرى عندما تكون هناك علاجات أو أدوية أو siRNAs تؤثر على مراحل دورة الخلية المحددة. لذلك لأغراضنا ، هذا يكفي ، لكننا نريد دائما المزيد.نريد دائما المزيد من المراكز أو الوقت الدقيق والفاصل الزمني أو شيء من هذا القبيل. لذلك فهو حل وسط. لذا ، وبعد ذلك سأضغط على البدء.وهكذا فإن برنامجنا يقوم بتمرير التركيز التلقائي في التمريرة الأولى. لذلك بمجرد أن أضغط على ابدأ ، يجب أن يبدأ التركيز التلقائي التلقائي وسترى الغالق مفتوحا ومفتوحا ويغلق بين التركيز البؤري التلقائي. لذلك سأضغط على البداية.إذن هذا هو فتح وإغلاق الغالق. محرك Z جذاب ويحاول في الواقع العثور على الطائرة ذات التباين الأكبر ، والتي ستكون الأكثر تركيزا. يمكنك في الواقع أن ترى على الشاشة الدخول والخروج من العثور على أفضل مستوى للتركيز قد يكون مقلقا.إذن ما يفعله هو أنه يدفع محرك Z للعثور على الأفضل ، والأكثر تركيزا على مستوى التركيز ، والأكثر في الصورة. ثم يكتسب الصورة هناك ثم يتعلم أن الموضع Z. وبعد ذلك سنستخدم موضع Z في التمريرات ال 12 التالية.وبعد ذلك سنقوم بتمرير التركيز التلقائي مرة أخرى. ما نوع التجارب التي يقومون بها؟ حسنا ، مختبرنا مهتم في الغالب بفهم ما ينظم تقدم القذف ، أو على الأقل أنا مهتم أكثر بفهم ذلك.لذلك من خلال تصوير الخلايا الحية وخاصة نطاق التصوير متعدد المواضع وطويل المدى ، يمكنك أن تأخذ ، يمكنك تصوير الخلايا لمدة يومين أو ثلاثة أيام تدخل الانقسام ، ويمكنك تصوير جولات متعددة من الانقسام حتى تتمكن من فهمها. وبعد ذلك يمكنك وضع الأدوية أو الحمض النووي الريبي أو أي نوع من الاضطرابات على الخلايا التي ترغب في دراستها. حتى تتمكن من فهم كيف تكون هذه الأدوية أو الجينات مهمة في تنظيم تطور الانقسام.نظرا لأنه ليس عملا ثابتا للخلايا وعمل الخلايا الحية ، يمكنك فهم ما الذي تحتاج فيه إلى اضطراب يؤثر على الانقسام أو أي مرحلة من الانقسام المتأثر. لذلك فهي قوية حقا في هذا الصدد. ماذا ، ما هي العناصر التقنية الرئيسية لهذه التجارب؟ما هي المشاكل المحتملة؟ حسنا ، المشكلة الأكبر إلى جانب إعداد الحفارة ، فإن إعداد الحفارة ليست تافهة. يمتلك الكثير من الأشخاص الحفارة ، ولكن فقط تأكد من أنها تعمل بشكل جيد مع تطبيقك.العنصر المالي ليس صغيرا. إذن هناك إعداد الجهاز وبعد ذلك ، وبعد ذلك بمجرد جمع البيانات ، هناك مشكلة حقيقية في تحليل البيانات. يستغرق الأمر هذه الأفلام ، إذا كنت تجمع 40 فيلما لكل منها 30 خلية ، فلديك 40 في 40 حقلا قمت بتصويرها للتو وكل حقل من هذه الحققول يحتوي على 30 خلية ، فعليك الجلوس مع كل واحد من هذه الأفلام وإلقاء نظرة على كل واحدة من تلك الخلايا في هذا الفيلم.لذلك يستغرق الأمر وقتا طويلا حقا لإجراء تحليل البيانات. وهذا ، لذلك يستغرق الأمر أسبوعا لتحليل البيانات التي استغرق الأمر يومين لجمعها. إذن هناك عقبة كبيرة جدا من حيث جمع الكثير من البيانات.لذلك فهو ليس كذلك ، على الرغم من أنه جمع بيانات عالي الإنتاجية ، إلا أنه ليس تحليلا عالي الإنتاجية. إذن ما الذي ستفعله لجعل هذه التجربة عالية الإنتاجية حقا؟ لذا فإن مختبرنا بصدد تطوير برنامج يقوم بتحليل البيانات تلقائيا.وهو برنامج لائق جدا. انها ليست مثالية. العين البشرية دائما أفضل ، لكنها تصل إلى هناك.إذن ما هو التطبيق المثير للاهتمام لهذه التجربة؟ ربما مجالات أخرى يمكنك ذكرها؟ إلى جانب انقسام الخلية؟تقصد ، أوه ، لتصوير الخلايا الحية؟ نعم ، حسنا ، يمكنك إجراء فحوصات حركة الخلية. يمكنك، اعتمادا على الفحص المجهري المعني، يمكنك، كما تعلمون، أن تنظر إلى كيفية ظهور الخلايا، يمكنك النظر إلى تطور الورم إذا كنت تريد ذلك حقا.ولكن هناك ، أنت ، إذا كان لديك إعداد التصوير الصحيح ، يمكنك ذلك ، فأنت لست مقيدا إلى حد كبير من حيث أي شيء. يصادف أن نطاقنا مجرد مجال واسع ونستخدم هدف 20 × 20. لذلك فهي دقة منخفضة جدا ، لكن هذا كاف لما نحتاج إلى رؤيته.لذلك هناك ، ولكن بالتأكيد لا توجد ، لن تكون مقيدا. أي شيء يحتوي على أي نوع ديناميكي من التجارب ، وهو علم الأحياء ، سيكون كذلك ، سيستفيد حقا من تصوير نمط الحياة. لذا تصوير الكالسيوم ، على الرغم من أنه لا يمكنك القيام بذلك على أجهزتنا ، فهذه خلية حية.أنت بالتأكيد بحاجة إلى تصوير الخلايا الحية لذلك. كما قلت ، فحوصات المريض ، وفحوصات الحركة ، وهذه الأنواع من الأشياء ستستفيد حقا من تصوير الخلايا الحية. هل ترغب في إخبار بضع كلمات عن تجربتك السابقة؟ما هي المدة التي تستغرقها في العمل على هذه التقنيات؟ ما الذي تعمل عليه من قبل؟ Wow.So في درجة الدكتوراه لم أعمل.لقد أجريت الكثير من الفحص المجهري متحد البؤر ، لكن لم أصور نمط الحياة. وهكذا خلال فترة ما بعد الدكتوراه التي كنت فيها ، ساعدت الدكتور كينغ في الحصول على هذا الجهاز الذي استخدمناه للتو لإعداد هذه الأجزاء ، وتشغيله. وهكذا خلال فترة ما بعد الدكتوراه ، كان لدي الكثير من الخبرة في كل من المجال الواسع مع تصوير TimeLapse على نطاقنا ، وهو التصوير الواسع النطاق وأيضا TimeLapse باستخدام المجهر متحد البؤر.وأود أن أقول إنه قوي حقا. تحصل على الكثير من المعلومات ، لكن ليس من السهل أن تعمل بشكل مثالي. لذلك يتطلب الأمر حقا الكثير من الاهتمام والكثير من الاهتمام بالتفاصيل في كل خطوة صغيرة من العملية.وبعد ذلك لا تزال لديك مشاكل. لذا فهو تطبيق صعب ، ولكن يمكنك حقا الحصول عليه ، إذا كان هذا هو ما تحتاج إليه ، لدراسة مشكلتك ، مشكلتك العلمية ، فهذا لا يقدر بثمن في هذا الصدد ، لكنه صعب. لذا ابحث عن شخص يعرف ما يفعلونه واستخدمه.هذه نصيحتي. جيد جدًا.

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

In This Article

Disclosures

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles