버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Summary

이 문서에서 우리는 효모 어머니 세포의 replicative의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

Abstract

노화는 세포의 구성 요소와 사망률의 결과 organelles의 점진적 저하 특징 퇴행성 과정이다. 신진 효모

Protocol

파트 1 : replicative 수명 분석을위한 종자 및 플레이트 준비

이 섹션은 replicative 수명 실험 및 수명 분석을위한 효모 세포의 준비에 사용하기 위해 고체 YEPD 접시의 준비에 대해 설명합니다.

1. 적절한 무균 기술을 사용하여 culturing 효모 세포 및 replicative 수명 분석에 사용됩니다 YEPD 한천 플레이트를 (1 % 효모 추출물, 2퍼센트 bacto - 펩톤, 2 %의 한천, 2 % 포도당) 준비합니다. 당신은 수명 실험에서 분석하기 위해 모든 4-5 종자에 대한 최소한 2 접시를 준비한다. 접시는 수명 실험하기 전에 적어도 이일 준비 및 수명 분석을 시작하기 전에 건조 수 있어야합니다. 실험이 번호판을 털어놓지 않는 편입니다 4~5일 이내에 시작하지 않는 경우, 그들은 냉장 배양기에 위치하고 parafilm에 싸여 또는 dessication을 막기 위해 플라스틱해야합니다.
2. 냉동 주식 및 YEPD 한천 플레이트에 하나의 식민지에 대한 승리의 효모 종자를 제거합니다. 최대 6 계통에 쉽게 동일 크기의 파이 모양의 웨지로 번호판을 분할하여 동일한 YEPD 접시 줄무늬 수 있습니다.
3. 2 일 30 ° C에서 세포를 품어.
4. 신선한 YEPD 접시에 보육 및 단일 식민지에서 패치 세포에서 세포를 제거합니다. 두 개의 다른 식민지에서 두 패치는 각 변형 생성해야합니다. 이때, 분석하는 변종은 dissectors 개별 종자의 신원을 모르는 어디 replicative 수명 실험은, "눈먼"을 수행할 수 있도록 코딩해야합니다.
5. 다음날 저녁까지 30 패치, 코딩 세포 ° C를 품어.
6. replicative 수명 분석에 사용되는 실험 접시 될 것입니다 신선한 YEPD 접시 각 코딩 변형율에서 세포와 가볍게 패치 세포를 제거합니다. 세포 YEPD 플레이트 (그림 1)의 왼쪽에 세로 라인을 따라 패치가 있어야합니다. 플레이트 약 3-5 패치는 각 패치에서 20 세포의 replicative 수명 분석을 가정, 최적입니다. 이것이 세포가 자신의 후속 replicative 수명을 제한할 수있는 야간 부화 동안 두껍게 성장의 원인이되므로, 신선한 YEPD 접시에 세포의 큰 숫자를 전송할 수 (않으며 바람직하지) 필요하지 않습니다.
7. 벤치 위에 밤새 신선한 패치 접시를 품어.

2 부 : replicative 수명 분석을위한 위치 세포.

이 섹션에서 우리는 효모 접시에 세포 및 replicative 수명 분석을위한 처녀 딸 세포를 얻기 위해 위치를하는 방법에 대해 설명합니다. 이 시점에서, 모든 접시가 dessication을 방지하기 위해 절개를받은 경우를 제외하고, parafilmed해야합니다.

1. 효모에 적합한 microdissection 기기 장착된 현미경을 사용하여 패치가 세포로 말초 번호판의 위치에 첫 번째 패치 변형에서 약 50 세포를 전송합니다. 당신의 현미경 스테이지 평점 경우, 이러한 순서는 세포가 이후 반복하는 동안 쉽게 찾을 수 있도록하는 데 사용할 수 있습니다. 자이스 혈구 Axioscope 40, 첫 번째 패치 변형 세포는 좌표 90 X 10에 배치하고 거기에서 수직 못하였 느니라.
2. 반복 한천 표면을 만져 세포의 바늘을 청소 후 한천 표면을 통해 바늘을 강제하여 한천에 구멍을 만듭니다. 이 구멍은 절개와 딸 세포 제거의 후속 반복하는 동안 접시 동양 당신에게 마커 역할을합니다. 구멍에있는 효모 세포를하거나 그들이 성장하고 식민지를 형성하지 않도록주의하십시오.
3. 직접 구멍 위에 수직으로 각 셀에 위치 (그림 1) 사이 1-3 바늘 지름 (~ 100 μm의)와 20 균등하게 게재 위치로 각각의 효모 세포를 맞춥니다. 모든 세포 몇 아니라보다 라인에 동일한 위치에 서로 인접 두 개는 배치하십시오. 양도 세포 중 하나가 분열하지 않을 경우 이것은 처녀 딸 셀 선택하는 동안 중복을 허용합니다.
4. 10 ^일 및 라인에서 11 ^{일 위치} 사이에 한천에 7-8 구멍의 수평 시리즈를 만들 수 있습니다. 이것은 절개와 딸 세포 제거의 후속 반복하는 동안 접시 동양 당신에게 마커 역할을합니다. 구멍에있는 효모 세포를하거나 그들이 성장하고 식민지를 형성하지 않도록주의하십시오.
5. 반복은 동일한 축을 따라 세로로 배열 세포 계속, 접시의 각 패치에 대한 2.1-2.4 단계를 반복합니다. 단계 2.2의 경우, 만들어진 구멍의 숫자는 패치 번호 (최초의 패치를 한 구멍, 두 번째 두 구멍 등)에 해당한다.
6. 일단 세포 parafilm는 30 접시와 부화는 ° C 약 2 시간 동안 각 패치 못하였 느니라되었습니다.
7. 반복 실험의 각 접시 2.1-2.6 단계를 반복합니다.

파트 3 : 수명 분석을위한 구합니다 처녀 딸 세포

이 섹션에서는 각 세포가 처녀 딸로 시작함으로써 수명 분석을 시작셀.

1. 인큐베이터에서 접시를 제거하고 못하였 느니라 세포의 대부분은 세포 분열을받은 것을 확인하십시오. 추가 시간이 세포 분열이 완료 될 수 있도록 필요한 경우에는 보육에 접시를 반환합니다.
2. 첫 번째 못하였 느니라 세포부터, 부드럽게 부착 세포의 상단에있는 바늘을 배치하여 어머니 세포의 딸 세포를 분리하기 위해 바늘을 사용합니다. 이것은 바늘이 세포에서 쉬고있는 동안 현미경 기지의 측면을 도청하기 위해 때로는 도움이됩니다.
3. 어머니의 셀을 클릭하고 추가 딸 세포를 대체하고 일시적으로 별도로 그들을 움직이는 수직선에서 분리 딸 세포를 놓으십시오.
4. 못하였 느니라 세포 각각에 대해 3.2 3.3 단계를 반복합니다. 세포는 분열로 실패하는 경우 단계 2.3의 위치에 중복 세포 중 하나에서 딸 세포 가져가라. 완료되면, 당신은 수명 판에 수직으로 정렬 각 패치 20 딸 세포가 있어야합니다.
5. 더미로 어머니 세포와 별도의 딸 세포를 모두 수집하고 패치 근처 지역 (이하 "묘지")에 다시 전송합니다. 멀리 microcolonies 및 지방 영양소 고갈의 형성을 방지하기 위해 수명 분석을받은 세포에서 원치 않는 세포를 유지하는 것이 중요합니다.
6. Parafilm 30 판과 부화 ° C 약 2 시간.
7. 반복 실험의 각 접시 3.2-3.6 단계를 반복합니다.

4 부 : 개별 세포의 replicative 용량을 측정

1. 수명 데이터 시트를 준비합니다. 수명 데이터 시트는 각 행은 개별 어머니 세포에 해당하는 각 열에 세 점 (그림 2)에 해당하는 간단한 격자 수 있습니다. 분석하는 종자의 수를에 따라 각 데이터 시트를 라벨.
2. 인큐베이터에서 접시를 제거하고 못하였 느니라 세포의 대부분은 적어도 하나의 세포 분열을받은 것을 확인하십시오. 추가 시간이 세포 분열이 완료 될 수 있도록 필요한 경우에는 보육에 접시를 반환합니다.
3. 첫 번째 접시 첫 번째 못하였 느니라 세포부터, 시각 엄마와 딸 세포 (S)을 관찰하고 발생했을 세포 분열의 수를 결정합니다. 어머니가 세포 계약의 특성 패턴을 기반으로 제작했습니다 얼마나 많은 딸 세포 결정하기 위해 일반적으로 쉽지입니다. 수명 점수 시트의 해당 상자에 어머니 세포에 의해 만들어진 딸 세포의 수를 기록합니다.
4. 로 단계 3.2에서 설명한 어머니 세포의 딸 세포를 분리하기 위해 바늘을 사용합니다.
5. 수직선의 위치에있는 엄마 세포를 유지하고 별도로 일시적으로 딸 세포 (들)을 이동합니다.
6. 반복 못하였 느니라 세포의 각 4.3-4.5 단계를 반복합니다.
7. 폐기 딸 세포를 모두 모아서 원래의 패치 근처에있는 '묘지'로 이동합니다.
8. 30 Parafilm 접시와 부화 ° 2-3시간를위한 C.
9. 반복 실험의 각 접시 4.3-4.8 단계를 반복합니다.
10. 모든 엄마는 세포가 분열 정지 때까지 반복 4.2-4.9 단계를 반복합니다. 어머니 세포 연령으로서, 세포주기의 진행이 느린되고 그것은 나이 지점 사이의 시간 긴 기간 동안 접시를 부화 바람직한 것입니다. 접시는 4 ° C 하룻밤에 배치될 수 있습니다.

제 5 부 : 대표 결과.

replicative 수명 실험에 의해 만들어진 원시 데이터는 각 연령 점 (그림 2) 각 어머니 세포에 의해 만들어진 딸 세포에 해당하는 목록 숫자입니다. 점수 시트의 각 행을 합산하여, 각 어머니 세포에 대한 replicative 수명이 얻어진다. 같은 실험 그룹에서 어머니 세포에 대한 데이터는 생존 곡선 (그림 3A)를 생성하고 같은 의미 수명, 평균 수명, 그리고 표준 편차와 같은 통계 계산을 수행하기 위해 풀링 수 있습니다. 같은 윌콕슨이 순위 - 합계 테스트와 같은 비 파라메 트릭 시험, 수명에 큰 차이가 실험 집단 간의 발견되었습니다 여부를 확인을 수행할 수 있습니다. 실험이 제대로 작동하면, 생존 곡선은 생존에 상대적으로 급속한 하락과 곡선의 평평화 밖으로 나중에 나이를 따라 낮은 초기 사망률과 sigmoidal 샤프를 보여주는 Gompertz - 메이크햄 속도론과 약 일관되어야합니다. 이 범위의 유사 외부가보고되었습니다 있지만 대부분의 야생 형 변종은 20-30 세대의 범위에서 replicative 수명 값을있다.

그림 1. 전형적인 replicative 수명 판의 다이어그램. 효모 세포의 microdissection를 시작하기 전에 저녁은 3-5 종자는 가볍게 접시의 한쪽을 따라 수직선에 YEPD 접시 (빨간색 박스)의 표면에 패치입니다. 하룻밤 성장에 따라, 각 변형에서 약 30 개인 세포는 20 자리를 포함하는 라인에 수직 못하였 느니라입니다. 수명 analysiS는이 초기 세포에서 얻은 V 처녀 딸 세포에서 수행됩니다. 실험 (예 : 원치 않는 딸 세포) 중 microdissection에서 얻은 여분 전지는 식민지가 형성 등 영양 지역 고갈을 방지하기 위해 멀리 실험 세포의 위치는 "묘지"(회색 원형)에 배치됩니다.

그림 2. replicative 수명 실험에서 replicative 수명의 집계 시트. 원시 데이터가 표시됩니다. 각 행은 단일 효모 어머니 세포에 해당하며 각 컬럼은 연령 포인트에 해당합니다. 각 상자에 입력된 번호는 연령 지점에서 그 어머니 세포에 의해 만들어진 딸 세포의 숫자입니다. 각 변형이 효모 세포를 해부 개인이 분석되는 변종의 정체성에 대한 지식이없는 것과 같은 코드 번호와 함께 표시됩니다. 스물 세포는 각 변형에 대한 assayed 있습니다.

그림 3. replicative 수명 실험에서 대표 생존과 성장 곡선. (A) 생존 곡선은 (B) 성장 곡선은을하려하여 얻을 수 있습니다 (휴대폰 부문의 번호입니다. replicative 시대의 함수로 살아있는 어머니 세포의 분율을하려하여 얻을 수 있습니다 나이 지점의 함수로 주어진 변형에 의해 만들어진 딸 세포의 평균 개수.이 예제에서, 스트레인 # 2 오래 살았지만 느린로 성장 음모를 감소 초기 기울기에 의해 입증, 성장하고 있습니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose