במאמר זה תיארנו את הדרך טיפוסי לבודד תרבות עכברוש מבוגר myocytes לב. Collagenase ו פרוטאז משמשים לעכל לבודד myocytes יחיד. Myocytes תרבותי לעקוב בפרוטוקול זה לעמוד בדרישות הניסוי ביותר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Cultured העיקרי מכרסמים מבוגרים לתאי לב הם מערכת מודל חשוב למחקר קרדיווסקולרי. עם זאת, הקמתה של החזקה, myocytes קיימא מבוגר תרבותי יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, שער הגבלת צעד עבור חוקרים רבים. כאן אנו תיאר פרוטוקול להשיג תשואה גבוהה של מבוגר לב myocytes עכברוש שנותרו קיימא בתרבות במשך כמה ימים. הלב הוא מבודד perfused עם collagenase ו פרוטאז תחת Ca נמוך
פרוטוקול
חלק א הכנה לניתוח
- יום לפני הניתוח חולדה, לוודא את כל פתרונות מורכבים, אבל לא להוסיף כל האנזימים עדיין. Buffers, B ו החיץ לשטוף צריכים להיות מסוננים על סטריליות לפני האחסון. מאגרים צריכים להיות מאוחסנים 4 ° C.
- 6 גם תרבות צלחות רקמות חייב להיות מצופה עם 10-20 מיקרוגרם / מ"ל laminin ב 2 מ"ל 1XSFM יום לפני, וגם צריך להיות מאוחסן על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור.
- ביום הניתוח, להכין את מכשירי ניתוח עיקור על ידי מהדק, מספריים, מלקחיים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הצעד הקריטי הוא המהירות שבה את הלב מבודד הוא תלה על מערכת זלוף. אורך תקופת עיכול אנזימטי עשוי להיות קצת שונה עבור כל חולדה. ההתאמה תלוי כמה רך הלב הופך לאחר תקופת סדירה של מערכת העיכול. ההתאוששות באיטיות של Ca 2 + לאחר עיכול אנזים חיוני להשגת Ca 2 +-סובלנית תאים בריאים.
עבור שפן ניסיונות, הפרוטוקול הוא זהה, למעט hyaluronidase משמש במקום פרוטאז XIV. בדרך כלל, אנו מוצאים את אחוז הראשונית של הת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| גלוקוז | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| מלח נתרן של הפרין | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| קולגנאז מסוג II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| פרוטאז XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| קרניטין | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| טאורין | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| חומצה גלוטמית | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| קריאטין | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| אנטיביוטיקה | Cellgro | 30-009-CI | |
| מדיום 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| למינין | BD Biosciences | 354232 | |
| בן מאט | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| משאבה כימית בעלת ספיקה משתנה | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| פלטת תרבית בעלת 6 בארות | Corning | 3516 |
מקורות
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
