계절 hypoxic 피요르드의 수직 깊이 연속으로부터 격리 환경 게놈 DNA와 fosmid 라이브러리의 구축이 설명되어 있습니다. 그 결과 클론 라이브러리는 384 잘 접시에 들어서 자동 식민지 따기 시스템의 응용 프로그램에서 스트림 시퀀싱 및 기능 검사를 위해 보관됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
자연 미생물의 대부분은 현재 전통적인 재배 방식에 액세스할 수 남아 있습니다. 지난 10 년간, 문화, 독립적인 환경 게놈 (
프로토콜
Fosmid 라이브러리 구축은 네 가지 주요 단계와 여러 부분 (개요에 대한 Fig.1 참조)로 하위 분할로 나뉘어있다.
([3] "0.22 μm의 Sterivex 필터에서 DNA 추출"프로토콜을 참조) I 단계
1 부 : 효소 - 촉매 세포 용해
2 부 : CsCl 밀도 기울기 원심 분리와 DNA의 회복에 의해 환경의 DNA 정제
파트 3 : 겔 전기 영동에 의해 추출한 DNA의 품질 관리
단계 II
1 부 : 복구 환경의 DNA 효소 수정 단계
환경 DNA의 최종 수리 단계에 필요한 모든 시약은 EPICENTRE에서 pCC1 Fosmid 라이브러리 제작 키트에 포함되어 있습니다. 이상적으로, 당신의 게놈 DNA는 0.5 μg / μl로 조정해야합니다.
- 얼음의 모든 시약을 녹여 다음을 조합하여 간략하게 아래에 모든 액체를 얻을 수있는 튜브를 원심 분리기 :
- X μl 멸균 물
- ....
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토론
절차는 가장 효율적으로 해안 물 샘플에서 파생된 게놈 DNA와 큰 삽입 fosmid 라이브러리를 생성하는 방법을 설명합니다. 업 - 스트림 게놈의 DNA 추출은 별도의 프로토콜 [3]에 설명되어 있습니다.
fosmid 라이브러리 생산 다단계 프로세스, 계획 네 명 모두 제공 단계를 포함하여 모든 절차에 시간에 최소한 2~3주 때문입니다. 게놈 DNA의 추출은 가장 중요한 단계와 단계를 추출한 게놈 DNA의 품질과 수량에 의존하는 모든 다운 스트림이며 때문에이 단계에 대한 충분한 시간을 보내는 고려하여 신중하게 작동합니다. 품질 및 추출한 DNA의 수량 조절은 매우 중요합니다. 이것이 당신이 만들려고하는 첫번째 라이브러리 특히 그것은 fosmid 클론의 숫자가 낮은 것을 발생할 수 있습니다. 자체 fosmid 라이브러리 건설 정직 한, 실패는 주로 귀하의 추출 및 정제 게놈 DNA의 부족 품질 및 / 또는 수량에 의해 발생합니다. 게놈 DNA를 다시 추출하여 도서관 공사가 성공.......
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공개 사항
나는 공개 없어요.
감사의 글
우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. MT와 SL은 미생물 다양성과 진화 (CMDE)의 툴라 기초 투자 센터에서 장학금으로 지원했다. MT 또한 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에서 화목 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 단계 II | |||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | Epicentre Biotechnologies | CCFOS110 | fosmid 라이브러리 9-10개 생성에 충분한 양 |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | |
| 교반 가열판 | Corning | PC-420D | |
| 1.0X TAE 러닝 버퍼 | |||
| 냉각 모듈 및 가변 속도 펌프를 포함한 CHEF Mapper XA 펄스장 전기영동 시스템 | Bio-Rad | ||
| λ DNA-HindIII Digest | New England Biolabs | N3012S | |
| MidRange I PFG Marker | New England Biolabs | N3551S | |
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | |
| 전자레인지 사용 가능 플라스틱 랩 | Saran premium wrap | ||
| Safe Imager 트랜스일루미네이터 | Invitrogen | S37102 | |
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | Epicentre Biotechnologies | G09100 | |
| 메스 | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Ultracel-10 멤브레인이 포함된 Amicon Ultra-4 원심분리 필터 유닛 | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Microcon YM-30 원심분리 필터 유닛 | EMD Millipore | 42410 | |
| 뉴클레아제 프리 워터 | Ambion | AM9932 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | |
| 디지털 드라이 블록 히터 | VWR international | 12621-088 | |
| 항온수조 | VWR international | 14231-854 | |
| 원심분리기 | Beckman Coulter Inc. | Avanti J-E | |
| 원심분리 로터 | Beckman Coulter Inc. | JA 5.3 | |
| 탁상형 원심분리기 | Eppendorf | 5415D | |
| 마이크로 원심분리 튜브, 1.7 mL, 투명 | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| 15 mL 원심분리 튜브 | Fisher Scientific | 430052 | |
| 단계 III | |||
| LB 배지 | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| 파지 희석 버퍼 | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | ||
| 냉동 보관 튜브 | Fisher Scientific | 430488 | |
| 단계 IV | |||
| 뚜껑이 있는 96웰 플레이트 | Fisher Scientific | CS003370(3370) | |
| 뚜껑이 있는 384웰 플레이트 | Fisher Scientific | 07201157(3680) | |
| 페트리 접시 100 O.D. x 15mm H | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 페트리 접시 150 Dia. x 15mmH | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR international | CABD351040 | |
| 글리세롤 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 클로람페니콜 | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| LB 배지 | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| Difco Agar | BD Biosciences | 214530 | |
| 유리 구슬 | Fisher Scientific | 10-310-1 | |
| QFill3 | Genetix | X3050 | |
| 표백제 | Javex | ||
| 에탄올 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 15 mL 원심분리 튜브 | Fisher Scientific | 430052 | |
| QPix 콜로니 피커 | Genetix | QPix2 | |
| 피킹 헤드 (E. coli) | Genetix | X4006 |
참고문헌
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.
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