Summary
Il Stemgent inducibile Dox Mouse Set TF Lentivirus possibile riprogrammare i fibroblasti embrionali di topo (MEF) per pluripotenti indotte staminali (iPS), cellule. Qui mostriamo il protocollo per DOX-inducibile espressione di fattori di trascrizione del mouse riprogrammazione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc di generare colonie iPS che esprimono i marcatori comune MES pluripotenza.
Abstract
Utilizzando un insieme definito di fattori di trascrizione e condizioni di coltura cellulare, Yamanaka e colleghi hanno dimostrato che retrovirus-mediata consegna ed espressione di Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4 è in grado di indurre pluripotenza in fibroblasti di topo. 1 Le relazioni successive hanno dimostrato l'utilità della doxiciclina (DOX) inducibile sistema lentivirale di consegna per la generazione di primaria e secondaria cellule iPS da una varietà di altri tipi di topo adulto cellule somatiche. 2,3
Staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule sono simili alle staminali embrionali (ES), le cellule di morfologia, proliferazione e la capacità di indurre la formazione di teratoma. Entrambi i tipi di cellule possono essere utilizzate come materiale pluripotenti di partenza per la generazione di cellule o tessuti differenziati nella medicina rigenerativa. 4-6 cellule iPS hanno anche un netto vantaggio rispetto cellule ES in quanto mostrano proprietà fondamentali delle cellule ES senza il dilemma etico di distruzione degli embrioni.
Qui mostriamo il protocollo per la riprogrammazione dei fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule con il mouse Stemgent inducibile DOX Set TF Lentivirus. Abbiamo anche dimostrato che il Stemgent inducibile DOX Mouse Set TF Lentivirus è capace di esprimere ciascuno dei quattro fattori di trascrizione su trasduzione in MEF così inducendo uno stato di cellule staminali pluripotenti che visualizza i marcatori caratteristici pluripotenza delle cellule ES.
Protocol
Discussion
Questi risultati dimostrano che la Stemgent inducibile DOX Mouse Set TF Lentivirus può essere utilizzato per generare in modo efficiente le colonie iPS inducendo l'espressione ectopica di trasduzione fattori di trascrizione in fibroblasti embrionali di topo. Nel progettare gli esperimenti di riprogrammazione, diverse variabili dovrebbero essere considerate per ottimizzare l'efficienza della riprogrammazione. In primo luogo, è possibile modificare il virus attivo rispetto al traguardo rapporto cellulare (cioè MOI) durante la fase di infezione primaria per aumentare o diminuire l'efficienza di trasduzione, interessando così il numero di virus integrati nella popolazione di cellule bersaglio. In secondo luogo, regolando la lunghezza del tempo le cellule sono esposte a DOX può influenzare l'efficienza della generazione colonia di cellule iPS. In terzo luogo, la capacità proliferativa delle cellule bersaglio può avere un impatto riprogrammazione, le cellule che sono in attiva crescita e dividendo sono più suscettibili di riprogrammazione. Infine, quando si modifica il protocollo per numero di cellule differenti o differenti dimensioni piatti colture di tessuti, si raccomanda che il numero di cellule bersaglio essere adeguato in proporzione alla superficie del piatto cultura.
Disclosures
L'autore, Brad Hamilton, è un dipendente Stemgent che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set | Stemgent | 00-0003 |
References
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