שיטות מחקר של דג הזברה לסתי בינית

Summary

לסתי דג הזברה בינית הוא איבר חוש הכסות המכיל ectodermal, mesodermal ונגזרות הרכס העצבי. חשוב לציין, בינית מבוגר יכול להתחדש לאחר כריתה הפרוקסימלי. וידאו זה מציג לסתי פיתוח בינית ומדגים פרוטוקול כירורגי כדי לעורר התחדשות, ואחריו הדמיה, אוסף הטבעה במורד דגימות בינית.

Abstract

Barbels הם הנספחים העור חושית למצוא דגים, זוחלים ודו. דג הזברה, Danio rerio, מפתחת שני זוגות זוג barbels האף קצר וזוג לסתי יותר. בינית מכיל רקמות תאים של ectodermal, mesodermal ומוצא הרכס העצבי, כולל בתאי העור, בלוטות, בלוטות הטעם, מלנוציטים, כלי הדם והעצבים התחושתיים. שלא כמו רקמות הבוגר ביותר, בינית לסתי ברור אופטית, ומאפשר לנו לחזות את פיתוח ותחזוקה של אלו סוגי רקמות לאורך כל מחזור החיים.

וידאו זה מציג את התפתחות מוקדמת של בינית לסתי (החל כחודש לאחר ההפריה) ומדגים פרוטוקול כירורגי כדי לעורר התחדשות בתוך תוספת הבוגרת (> 3 חודשים לאחר ההפריה). בקצרה, בינית לסתי השמאלי של דגים הרדים מוגבה עם מלקחיים סטריליות דיסטלי רק עד קצה הזנב של maxilla. בסדר, מספריים באביב סטרילי ממוקם נגד מלקחיים כדי לחתוך את פיר בינית ברמה זו, הקמת נקודת ציון אנטומיות למטוס קטיעה. צמיחה הרגנרציה ניתן למדוד ביחס למישור זה, בהשוואה בינית הנגדי. רקמה בינית מחדש במהירות, להגיע לצמיחה מחודשת מקסימלי בתוך 2 שבועות של פציעה.

טכניקות לניתוח בינית מחדש כוללים לנתח והטבעה תואמים barbels (להתחדש ובקרה) של בארות של תקן ה-DNA ג'ל אלקטרופורזה. דגימות Embedded מצולמים בנוחות תחת stereomicroscope עבור מורפולוגיה morphometry ברוטו, והוא יכול להיות מאוחסן במשך שבועות לפני יישומים במורד כגון היסטולוגיה פרפין, cryosectioning, ו / או אימונוהיסטוכימיה הר שלם. שיטות אלה להקים בינית לסתי כרומן במערכת רקמות vivo לחקר יכולת ההתחדשות של סוגי תאים מרובים בתוך ההקשר הגנטי של דג הזברה.

Protocol

בעלי דג הזברה

דג הזברה הם שוכנו וגודלו על פי שיטות סטנדרטיות ^1. עבר תקופת הזחל מאוחר, בשלב ההתפתחותי של דג הזברה ניתן למדוד לפי אורך הסטנדרטי שלה (SL), או את המרחק במילימטרים קו ישר מנקודת anteriormost של השפה העליונה לבסיס של סנפיר הזנב (צלחת hypural posteriormost) ^2. בשלב ההפריה כחודש פוסט (10-12 מ"מ SL), את barbels האף לסתי מופיעים ניצנים אפיתל שקוף כמו ליד בורות חוש הריח ועל הפינות האחורי של maxillae, בהתאמה. כמו דג הזברה מתבגר, barbels להאריך לתוך צרה, זיף כמו הנספחים. מכיוון בינית לסתי גדול (2-3 מ"מ), קל יותר לתמרן, פרוטוקול שלנו חלה רק על תוספת זו בפרט; בטכניקות דומות, לעומת זאת, יכול להיות מותאם קטן האף בינית.

בינית Clipping

1. לטשטש את דג הזברה בשלב הבוגר הרצוי (למשל., 1.5-2.5 ס"מ SL, ~ 3-6 חודשים לאחר ההפריה) על ידי טבילה% 0.015 MS-222 (אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate) שנאגרו עד 7.0 pH במים המערכת. שימו לב עד תנועות לשחות לעצור אוורור הזימים הופך איטי וקבוע. בהתאם לגודל הדגים, הרדמה מלאה לוקח כ 2-5 דקות.
2. בעזרת רשת דייגים אקווריום, להעביר דגים 1-3 בכל פעם כדי פיסת מגבת נייר מקופל של רטוב בצלחת פטרי. בעזרת מרית בוטה, לכוון את הדגים ולכן הם מקבילים לרוחב כל צד שמאל אחרים למעלה. חלק מקפלים מגבת נייר רטובה על החלק הזנב של הדג, מכסה את כל הגוף עד operculum (מכסה הזימים) כדי לשמור על עור לח זימים במהלך ההליך.
3. הצג את צלחת פטרי תחת stereomicroscope, באמצעות זווית נמוכה לאור התקרית כדי להאיר את אזור הראש. פוקוס על בסיס של בינית לסתי משמאל, אשר הבולטת מזווית הגחון האחורי של maxilla (איור 1).
   
   באיור 1.
4. חזק לתפוס את פיר של בינית דיסטלי מעט לקצה maxilla. הגבהה של פיר בינית והכנס מלתעותיו של קנס שקצהו מספריים באביב הפרוקסימלי רק כדי מלקחיים. מספריים ניתן נגע אל מלקחיים ליציבות. החלק את הלסתות של המספריים לאורך הפיר של בינית עד חוד החנית גישות קצה maxilla. סגור את המספריים לחתוך דרך הפיר בינית. בינית קטוע, עדיין אחז ב מלקחיים, ניתן להסיר את קיבוע או תצפית נוספת.
5. מיד להעביר את הדגים לאקווריום קטן של מים מערכת נקייה (~ 500 מ"ל) המכילה טיפה אחת של מתילן כחול לשלוט זיהום פטרייתי שטחי. אפשר הדגים להתאושש במהלך הלילה. למחרת בבוקר, להחזיר את הדגים למערכת גידול. בינית התחדשות היא מקסימאלית לאחר 2 שבועות.

אגר והטבעה של זוגות בהתאמה בינית

1. איסוף הדגים על ידי המתת חסד טכניקה מתאימה לתקן בצינור 50 מ"ל של 4% paraformaldehyde-שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) בהתרגשות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. נפח מקבע צריך להיות לפחות עשר פעמים את נפח הרקמה. לאחר קיבוע, להשליך פסולת paraformaldehyde במיכל מאושר ולשטוף את הרקמה ביסודיות כמה שינויים של PBS.
2. הכינו זכוכית 250 מ"ל 150 מ"ל בקבוק של 2% agarose (T _מ ~ 37 ° C) במים מזוקקים. מחממים עם מיקרוגל או צלחת חמה, התססה מעת לעת עד נמס לגמרי. לאזן את הפתרון מותך בתוך אמבט מים 50-60 מעלות צלזיוס.
3. להרכיב מתקן סטנדרטי ג'ל אלקטרופורזה ידי הצבת עובש קטן ג'ל gasketed (10 x 10 ס"מ, נפח ~ 100 מ"ל ג'ל) בתקיפות נגד צידי החדר חיץ. הוספת 2-4 קטן שיניים מדגם מסרקים (4 x 1.5 מ"מ).
4. על משטח ישר, ויוצקים את agarose נמס לתוך התבנית רק כדי לכסות את הבסיס של מסרקים, להרכיב בארות רדוד מאוד. מיד לשים את שאריות agarose בחזרה לתוך האמבט במים חמים, זה ישמש מאוחר יותר להטביע את הרקמה (שלבים 9-12). שים זכוכית ארוכה פסטר פיפטה לתוך הבקבוק כדי לשמור על פיפטה לטמפרטורה זהה agarose.
5. אפשר ג'ל להתקשות במשך 20-30 דקות. הסר את מסרקים, ולאחר מכן להסיר את התבנית ג'ל המכיל את ג'ל מוקשה מן החדר חיץ. קלטת היטב את הצדדים לפתוח את הג'ל של עובש עם הקלטת מעבדה כך הג'ל אינו מחליק החוצה. סרט זה אמור להאריך כמה מילימטרים מעל פני השטח של agarose כך agarose נוסף ניתן להוסיף מאוחר יותר (שלב 13).
6. מקמו את תבנית ג'ל על הבמה של stereomicroscope. הגדלה באר מים ריקה ולהביא את הקצוות אל המוקד.
7. על פני השטח של agarose סמוך לבאר, פיפטה טיפת מים או חיץ המכילה את דגימות קבוע בינית (למשל, להתחדש ובקרה). USIng כפוף סיכות חרקים, גרור את דגימות לחות לתוך הבאר ולדחוף אותם לתחתית. המזרח פירים בינית מקבילים זה לזה מיושר נגד קצוות מנוגדים של ארוך היטב. מתח פנים יעזור להחזיק את הרקמה בעמדה.
8. כאשר מוכן להטביע, השתמש קצה פיפטה קנס או את הפינה של רקמות במעבדה כדי להסיר את הנוזלים העודפים מן הבאר. עבודה במהירות, כדי לא לתת הרקמה להתייבש.
9. שימוש בזכוכית חימם פיפטה פסטר, בעדינות פיפטה agarose מותכת טרי סביב דגימות כדי לאטום את רקמת בינית במקום. אל תמלא יותר מדי. לפני agarose מתקשה, לעשות שינויים של הרגע האחרון עם סיכות חרקים.
10. מקום הדגימה ממוספרת תווית נייר ליד הבאר לאבטח אותו עם טיפה קטנה של agarose.
11. חזור על שלבים 6 עד 10 עבור כל טוב של דגימות.
12. אם תרצה לצורך כיול התמונה, להוסיף פיסת נייר עם בקנה מידה מיקרומטר מודפס (לדוגמה, http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) לתוך החלק התחתון של ריק היטב. שטחו את הנייר לתחתית הבאר לכסות את זה עם agarose חם.
13. אחרי כל הדגימות הם מוטבעים, את פני השטח של ג'ל יהיה לא סדיר, עם טיפות של מוקשה agarose. מניחים את הג'ל על משטח שטוח בעדינות ויוצקים פנימה agarose נמס נוספים עד משטח עליון אחיד. השתמש הסכום הקטן ביותר של agarose הכרחי כדי לקבל משטח חלק, יותר מדי agarose יהיה מעורפל מועבר אור בצילום. אפשר זו השכבה העליונה להתקשות.
14. הג'ל יכול להצטלם על הבמה של stereomicroscope להקליט מורפולוגיה ברוטו עבור כל זוג בינית. כיול תמונה מתקבלת על ידי מצלם את היקף מיקרומטר מוטבע.
15. ג'ל כולו ניתן לאחסן עטופים במגבות נייר רטוב אטום בשקית ניילון ב 4 מעלות למשך מספר שבועות.
16. לצורך ניתוח נוסף, קוביות אגר המכיל זוג מתאימים של barbels ניתן לגזור מתוך הג'ל עם להב סכין מנתחים או סכין גילוח ומעובד היסטולוגיה פרפין או cryosectioning על ידי שיטות סטנדרטיות ^3,4. לחלופין, barbels הפרט יכול להיות גזור מתוך agarose עם מחטים דקות, לשטוף במים, ומעובדים עבור יישומים במורד אחרים (למשל, כל הר או אימונוהיסטוכימיה מיקרוסקופיה confocal).

Discussion

לסתי דג הזברה בינית היא מערכת רקמות מנוצלים לחקר גדילה, תחזוקה, התחדשות של תאים מסוגים כמה דג הזברה. למרות תוספת בינית אין אנלוגי האנושי, סוגי התאים שהוא מכיל הם שמור ביותר, כך שניתן ללמוד, בלוטות בעור, מלנוציטים, כלי הדם והעצבים במבנה גלילי ברור אופטית פשוטה מבחינה אנטומית. בדומה סנפיר היטב למד את הזנב, רקמה בינית יכול להיגרם להתחדש על ידי קטיעה. שימוש גבול maxilla כמו ציון דרך אנטומיים, המטוס קטיעה ניתן למקם במדויק, להקל על המדידה של בינית לצמיחה מחודשת. עבור מפעיל מנוסה, כל הניתוח לוקח רק כמה שניות. החלמה מהירה, ויש לנו זוהה עד כה ללא תופעות קצרות או ארוכות טווח על התנהגות הדגים. דג הזברה עם לשחות one בינית לסתי, לאכול להתרבות בצורה יעילה כמו ניתוחי שולטת, יש להשוות את זמן ההישרדות של אוסף רקמות, עד 6 חודשים לאחר הניתוח. ההשפעה הפיזיולוגית של ניתוח זה צפוי להיות מינימלי, כי 1) את בלוטות הטעם extraoral נישא על בינית נמצאים גם על חלקים רבים אחרים של האפיתל דגים, כולל שפתיים, לחיים וראש ^5, 2) בלוטות הטעם להבדיל להופיע בינית התחדשות בתוך 72 שעות (LeClair et al., נתונים שלא פורסמו.) זה הופך את בינית לסתי מערכת פולשנית ללימוד ריפוי הפצע, revascularization ו reinnervation בהקשר של החולייתנים מבוגר.

לאחר אינדוקציה כירורגית של התחדשות, barbels ניתן לאסוף במרווחים למדידת morphometric ו / או ניתוח מיקרוסקופי של רקמת קבוע. נוח, בינית לסתי כ אורך (2-3 מ"מ) קוטר (100-200 מ"מ) של עובר דג הזברה, להקל את היישום של פרוטוקולים סטנדרטיים רבים, כולל היסטולוגיה פרפין, cryosectioning, כל הר אימונוהיסטוכימיה ו באתרו הכלאה. יחדיו, תכונות אלו להפוך את בינית לסתי ריאלי מאוד במודל vivo ללימוד ולתיקון רקמות והתחדשות.

Materials