Summary
Abstract
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) هي نادرة السكان من الخلايا المحفزة التي تحافظ على جميع الأنساب المتباينة الدم طوال حياة الكائن الحي. تعريف وظيفي للشهادة الثانوية العامة هي خلية زرع أن لديه القدرة على إعادة جميع الأنساب دم مصطلح المتلقي المشع طويلة. تأسست هذه التسمية من قبل عقود من العمل المنوي في نظم الثدييات. زرع الخلايا المكونة للدم تستخدم (HCT) والتلاعبات الجينية العكسية في الماوس ، والعوامل الكامنة وراء التنظيمية البيولوجيا شهادة الثانوية العامة هي بداية لكشف النقاب عن أن تكون ، ولكن لا تزال الى حد كبير في إطار استكشاف. في الآونة الأخيرة ، برزت الزرد نموذجا لدراسة جينية قوية تكون الدم الفقاريات. وإنشاء كليات التقنية العليا في الزرد تسمح للعلماء للاستفادة من المنهجيات واسعة النطاق الفحص الجيني والكيماوية المتوفرة في الزرد للكشف عن الآليات الكامنة وراء تنظيم رواية HSC. في هذه المقالة ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لأداء كليات التقنية العليا في الزرد الكبار. نظهر للتشريح وإعداد الزرد نخاع الكلى كله ، تكون الدم في موقع الكبار في الزرد ، وإدخال هذه الخلايا المانحة إلى الدورة الدموية للأسماك المشع المتلقي عن طريق الحقن داخل القلب. بالإضافة إلى ذلك ، ونحن تصف الرعاية اللاحقة للزرع من الأسماك في "العناية المركزة" لزيادة قدرتها على الصحة على المدى الطويل. في رعاية عامة لطيف من الأسماك قبل وأثناء وبعد عملية الزرع أمر بالغ الأهمية لزيادة عدد الأسماك التي سوف البقاء على قيد الحياة أكثر من الشهر التالي للإجراءات ، وهو أمر أساسي لتقييم المدى الطويل (<لمدة 3 أشهر) engraftment. وسيتم نشر البيانات التجريبية المستخدمة لإنشاء هذا البروتوكول في مكان آخر. فإن إنشاء هذا البروتوكول يسمح للاندماج الجينات الزرد على نطاق واسع والبيولوجيا زرع.
Protocol
إشعاع
- أشرق في وزن الأسماك 25Gy 2 قبل أيام من زرع
تشريح الكلى
- التضحية العدد المناسب من الجهات المانحة في tricaine فلوري (~ 100ML 4mg/ml Tricaine / لتر من أسماك المياه) (متوسط 500،000 خلية لكل الأسماك المانحة)
- عزل الكلى في برنامج تلفزيوني 0.9X + 5 ٪ + 1 ٪ FCS بن بكتيريا ("PBS +") في أنبوب
- تفريق مع الماصة 1ml ، ثم مع المحاقن مع إبرة 10ML G 18 02/01
- نقل إلى 50mL المخروطية وتمتلئ PBS +
- تدور باستمرار @ 1500rpm 8min
- أسكب ، resuspend بيليه في حجم كبير وتصفيتها من خلال تصفية 40micron
- تدور باستمرار @ 1500rpm 8min
- أسكب ، في برنامج تلفزيوني resuspend 1ml + ، ونقل إلى أنبوب إيبندورف
- العد : 10ul الخلية سول + 90ul التريبان الأزرق (الآن هو تخفيفه 10X)
- 10ul الخلية سول + 90ul PBS + (الآن هو تخفيفه 10X)
- اسمحوا الوقوف 5 دقائق ، إضافة إلى سول 10ul كلا جانبي عدادة الكريات
- عدد الخلايا في المربع الكبير (5x5) ، وحساب النسبة المئوية لموت إذا هامة
- خلايا / مل = (خلايا) (10 4) (X10 يخفف عامل)
سبيل المثال -- 60 خلايا تعول على عدادة الكريات هي مجموع الخلايا 6000000 - تدور باستمرار عينة @ 1500rpm 8min
- حساب حجم لتكوير resuspend في الحصول على تركيز مناسب من الخلايا
- اجمالى حجم 5ul لحقن -- 3ul WKM يجري ويجري الدم المحيطي 2ul
- مثلا -- ومجموع الخلايا 6000000
تريد زرع الخلايا في المتلقي 200000
لدينا 20 المستلمين
نريد 66667 خلية / UL (200000 خلية / 3ul)
resuspend بيليه في 90ul (6000000 خلية / خلايا 66667 / UL)
تحتاج فقط عن 60ul من أن (س 20recip 3ul)
استخراج الدم المحيطية
- التضحية العدد المناسب من الأسماك في WT tricaine (~ 100ML 4mg/ml Tricaine / ليتر من الماء الأسماك) للدم الحامل (متوسط 2000000 الخلايا لكل من الجهات المانحة)
- تخثر : 1ul تمييع (3unit/ul) في برنامج تلفزيوني 1mL +
- معطف طرف الماصة مع الهيبارين ، وطعنة من خلال الخياشيم مع طرف الماصة ، إضافة إلى برنامج تلفزيوني الدم +
- تدور 1500rpm 5min ، resuspend في 1.5mL
- تدور 1500rpm 5min ، resuspend في 1mL
- من خلال فلتر تصفية 40micron
- عدد الخلايا على النحو الوارد أعلاه
- خلايا / مل = (خلايا) (10 4) (X10 يخفف عامل)
- حساب للموت
- حساب حجم إعادة تعليق على النحو الوارد أعلاه
حقن
- حقن 5ul في قلب كل مستلم باستخدام حقنة هاميلتون
- تخدير الأسماك في tricaine (4.2ml (4mg/ml) أسماك المياه Tricaine / 100ML) ووضعت على اسفنجة رطبة
- إدراج غيض قليلا وراء القلب
- كزة حول منطقة القلب حتى تشاهد انفجار صغيرة من الدم (مما يعني ضرب قلب) -- قد> لا نرى هذا ولكن على أي حال حقن
ICU السمك -- بعد الحقن
- إبقاء الأسماك قبالة تدفق لل1 أسبوع لتجنب العدوى
- وضع الأسماك في الأقفاص 50-10
- إزالة الموتى والاحتفاظ بسجل
- يدويا تغيير المياه كل يوم
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
