이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
줄기 세포가 수있는 능력을 가진 세포로 정의 모두 자기 갱신 여러 차별 자손을 생성합니다. 배아 줄기 세포 (ESC)은 초기 배아의 blastocyst에서 파생된 및 differentiative 능력 pluripotent입니다. 그들의 광대한 differentiative 가능성들을 임상적으로 유용한 세포 유형을 생성하기 위해 그들을 동축 케이블하는 방법 deducing을 중심으로 많은 연구의 초점이되었다. 마우스 ESC에서 조혈 줄기 세포 (HSC)의 성공적인 유도가 최근 완성되었으며이 비디오 프로토콜의 시각하실 수 있습니다. HSC, 거의 틀림없이 가장 임상적으로 악용 세포 인구는 조혈 malignancies 및 장애의 무수한를 치료하는 데 사용됩니다. 그러나, HSC 치료 혜택을 누릴 수 많은 환자가 적합한 기증자에 대한 액세스를 부족합니다. ESC는 이러한 환자 HSC의 대체 소스를 제공할 수. 다음 프로토콜은 ESC - HSC이 공부하고 인간 ESC에서 HSC를 격리하는 노력을 알려 될 수있는 기준을 설정합니다. 이 프로토콜에서는 ESC가 상용 혈청 사전 검사를 최적의 조혈 차별화 6 일 동안 embryoid 기관 (EBS)로 구별됩니다. EBS 다음 dissociated과 retroviral HoxB4에 감염됩니다. 마우스, 그리고 열흘 동안 크린 시토킨를 추진하고 조혈의 존재 공동 교양 - 감염된 EB - 파생 전지 OP9 기질, M - CSF - /의 calvaria에서 파생된 골수 stromal 세포 라인에 도금입니다. 이 공동의 문화 중에 감염된 세포는 세대 세포의 수백만의 100s의 이기종 수영장 결과 크게 확장합니다. 이러한 전지는 다음 구조와 reconstitute lethally 조사 마우스로 사용할 수 있습니다.
프로토콜
배아 줄기 세포의 분화
- ESC 트립신과 치료를 통해 배아 줄기 세포 (ESC)의 근처에 합류 플라스크를 수집합니다.
- 차별화 미디어 5 ML에서 세포를 Resuspend가 아닌 젤라틴 코팅 T25로 전송할 수 있습니다. 37 품어 ° C를 45 분 정도 사용합니다. 뜨는 회수하여 원심 분리를 통해 세포를 수집합니다.
참고 : ESC 문화에서 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)가 아닌 젤라틴 코팅 T25에 쉽게 부착하고 있으므로이 도금 단계에서 문화 고갈됩니다. 당신이 MEFs에 culturing 귀하의 ESC를하지 않은 경우, 당신은 사전 플레이트를 건너뛸 수 있습니다.
- 333,333 cells/50 ML에서 차별화 미디어에 Resuspend MEF - 고갈 ESC. 이 농도 100 ESC/15 ML 결과.
- 를 사용하여 다중 채널 pipettor, 15cm이 배양 접시에 100 cells/15 ML 드롭에 플레이트 ESC. 8 채널 pipettor으로, 당신은 접시마다 방울의 18-22 행 (접시 당 5ml에 대한)에 대한 맞게 수 있어야합니다.
참고 :이 프로토콜의 경우, 방울 2-5 15cm이
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c 결핍 마우스 | 동물 | Taconic Farm | ||
| 플레이트 쉐이커 | 도구 | VWR international | 33998-360 | Ikaworks사의 오비탈 쉐이커 |
| 멀티채널 피펫 | 도구 | VWR international | 15000-174 | BioHit사의 ePet |
| ES 트립신 | 시약 | Invitrogen | 15090-046 | PBS 내 0.25% Trypsin |
| 표준 트립신 | 시약 | Invitrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | 완충액 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 효소 미포함 해리 완충액 | 완충액 | Invitrogen | 13151-014 | |
| 해리 효소 믹스 | 완충액 | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| 히알루로니다아제 | 시약 | Sigma-Aldrich | H2126 | 500 μL씩 분주하여 냉동 보관하고 반복적인 냉동 및 해동을 피하십시오. |
| DNAse | 시약 | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| 프로타민 황산염 | 시약 | Sigma-Aldrich | P3369 | 8 μg/mL |
| EB 분화 배지 | 배지 | 첨부된 Protocol.doc의 레시피를 참조하십시오 | ||
| 10% IMDM | 배지 | 첨부된 Protocol.doc의 레시피를 참조하십시오 | ||
| 10% IMDM+사이토카인 | 배지 | 첨부된 Protocol.doc의 레시피를 참조하십시오 | ||
| 20% anti-MEM | 첨부된 Protocol.doc의 레시피를 참조하십시오 |
재인쇄 및 허가
