体内样小鼠视网膜器官型全层培养

摘要

本视频文章演示了视网膜组织型全层培养物的建立以及用于分析外源性诱导效应的细胞离心涂片技术。视网膜组织型全层培养物可模拟 体内 在避免传统小鼠动物模型缺陷的同时，显著提高小鼠视网膜在实验操作中的可及性。

摘要

靶向敲除基因并分析动物模型是研究特定视网膜基因功能的经典策略。然而，转基因、视网膜特异性或条件性基因敲除小鼠模型常出现早期致死或严重畸形，从而无法对胚胎期或出生后早期阶段之后的表型进行分析。

原代细胞培养是一种在受控环境中研究外源性添加的重组因子、基因过表达或siRNA介导的基因敲低效应的替代方法。离散细胞培养的优势在于，到达靶细胞的内源性信号被减少，从而有利于在药理学干预后识别由外源性刺激引发的效应。然而，即使使用再聚集的视网膜类球体培养¹，细胞间的相互作用在最初也会因酶消化或机械解离而遭到破坏。

相比之下，视网膜器官型全层培养物提供了一个接近生理性的in vivo状态的系统，其中神经元之间的相互作用和连接仍得以保留^2-5。

在本视频文章中，我们将逐步演示：（1）建立类似 in vivo 环境的视网膜组织型全层培养体系，包括胚胎期、出生后及成年小鼠眼球的解剖技术要点；（2）一种用于分析组织型全层培养物中神经元凋亡和视网膜细胞增殖的细胞解离与细胞离心涂片操作流程，例如在添加外源性重组因子进行培养后开展相关分析。

方案

所有仪器和试剂必须购买无菌产品，或通过高温、蒸汽灭菌，或使用70%乙醇进行灭菌。

作者声明，动物实验严格遵循欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC），并符合美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理与使用的指南，以及德国杜伊斯堡-埃森大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）所制定的规定。

第1部分：不同发育阶段小鼠眼球的去核

胚胎眼球去核

1. 设置定时妊娠交配，将雌性小鼠检测到阴道栓的当天早晨定为妊娠第0天。
2. 当胚胎发育达到所需阶段（此处为胚胎第15天（E15））时，通过颈椎脱位法处死妊娠雌鼠，并将其固定在石蜡板上⁶。
3. 用70%乙醇润湿腹壁，沿中线剪开，并用镊子将皮肤瓣向两侧固定⁶。
4. 将子宫从腹腔中取出，分离后转移至含有冷PBS的烧杯中⁶。
5. 将胚胎分离，转移至培养皿中，并使用镊子小心去除子宫壁和胚胎膜⁶。
6. 通过断头法处死胚胎。
7. 使用精细的弯头镊子摘除眼球，将眼睛从眼窝中“剥离”出来。

出生后及成年眼球的去核

....

讨论

与解离培养、单层培养、视网膜球状体或再聚集的三维球状体培养¹相比，小鼠视网膜器官型全层培养^2-5的优势在于能够保留神经元之间的相互作用和连接，从而模拟体内（in vivo）的真实情况。与以往报道²相比，本视频文章详细展示了摘除小鼠眼球及分离不同发育阶段视网膜过程中的技术要点，包括在不损伤视网膜的前提下移除晶状体和玻璃体。移除晶状体和玻璃体对于药理学操作至关重要，因为二者会阻碍物质进入视网膜各层。与其他已报道的小鼠外植体培养系统不同，我们的器官型培养不使用支撑材料（如聚碳酸酯膜²），而是将视网膜全层组织块以自由漂浮的方式进行培养，从而进一步提高了外源性物质的可及性^3-5。

使用化学成分明确、无血清且不含补充物的培养基（不含胰岛素）仅能支持短时间培养（24 - 48 小时），但可避免胰岛素对细胞凋亡水平的抵消作用³，以及胎牛血清（FCS）和补充物所具有的生长因子模拟效应。

大多数.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠	动物	Charles River Laboratories
解剖显微镜	工具	Carl Zeiss, Inc.
PBS	试剂	Sigma-Aldrich		PBS 应为冷的（> 4°C）且无菌
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 / F-12 Ham 营养混合物	试剂	Sigma-Aldrich	D 8900	DMEM / F-12
转铁蛋白	试剂	Sigma-Aldrich	T 1147
腐胺	试剂	Sigma-Aldrich	P 5780
亚硒酸钠	试剂	Sigma-Aldrich	S 9133
孕酮	试剂	Sigma-Aldrich	P 6149
庆大霉素	试剂	Invitrogen
L-谷氨酰胺	试剂	Invitrogen	25030-024	200 mM (100X)，液体
牛血清白蛋白 (BSA)	试剂	Carl Roth Gmbh	8076.3	30 mg/ml
胶原酶	试剂	Sigma-Aldrich	C 0773	200 U/ml
胰蛋白酶	试剂	Sigma-Aldrich	T4799	来源于猪胰腺；1 mg/ml
透明质酸酶	试剂	Sigma-Aldrich	H 3884	200 mg/ml
DNase I	试剂	Roche Group	1 284 932	10 mg/ml
EDTA	试剂	Sigma-Aldrich	E 6511
硅油溶液	试剂	SERVA Electrophoresis	35130
多聚甲醛 (PFA)	试剂	Sigma-Aldrich	P6148	0.1 M 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中含 8% PFA。
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐	试剂	Sigma-Aldrich	D 0542	DAPI
荧光封片介质	试剂	Dako	S3023
BrDU	试剂	Sigma-Aldrich	B 9285
96 孔板	工具	Falcon BD	3072
24 孔板	工具	Falcon BD	3047
巴斯德吸管	工具	Brand GmbH	747720
DUMONT #5 镊子	工具	Fine Science Tools	11252-30	斜面极细柄（尖端 0.05 mm × 0.02 mm）
DUMONT #7 镊子	工具	Fine Science Tools	11271-30	弯曲柄（尖端 0.07 mm × 0.10 mm）
弹簧剪，直型，8 cm	工具	Fine Science Tools	15000-00	细小直刃
标准剪刀，直型，锐/钝头	工具	Fine Science Tools	14007-14	用于断头或颈椎脱位
Eppendorf 管	工具	Eppendorf		2 ml；圆底，便于离心/细胞离心涂片时沉淀形成
冷冻离心机	工具	Eppendorf
旋转摇床	工具	CAT
细胞离心涂片仪	工具	Thermo Fisher Scientific, Inc.