本视频文章演示了视网膜组织型全层培养物的建立以及用于分析外源性诱导效应的细胞离心涂片技术。视网膜组织型全层培养物可模拟 体内 在避免传统小鼠动物模型缺陷的同时，显著提高小鼠视网膜在实验操作中的可及性。
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摘要
摘要
靶向敲除基因并分析动物模型是研究特定视网膜基因功能的经典策略。然而，转基因、视网膜特异性或条件性基因敲除小鼠模型常出现早期致死或严重畸形，从而无法对胚胎期或出生后早期阶段之后的表型进行分析。
原代细胞培养是一种在受控环境中研究外源性添加的重组因子、基因过表达或siRNA介导的基因敲低效应的替代方法。离散细胞培养的优势在于，到达靶细胞的内源性信号被减少，从而有利于在药理学干预后识别由外源性刺激引发的效应。然而，即使使用再聚集的视网膜类球体培养1，细胞间的相互作用在最初也会因酶消化或机械解离而遭到破坏。
相比之下，视网膜器官型全层培养物提供了一个接近生理性的in vivo状态的系统，其中神经元之间的相互作用和连接仍得以保留2-5。
在本视频文章中，我们将逐步演示：（1）建立类似 in vivo 环境的视网膜组织型全层培养体系，包括胚胎期、出生后及成年小鼠眼球的解剖技术要点；（2）一种用于分析组织型全层培养物中神经元凋亡和视网膜细胞增殖的细胞解离与细胞离心涂片操作流程，例如在添加外源性重组因子进行培养后开展相关分析。
方案
所有仪器和试剂必须购买无菌产品，或通过高温、蒸汽灭菌，或使用70%乙醇进行灭菌。
作者声明，动物实验严格遵循欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC），并符合美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理与使用的指南，以及德国杜伊斯堡-埃森大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）所制定的规定。
第1部分：不同发育阶段小鼠眼球的去核
胚胎眼球去核
- 设置定时妊娠交配，将雌性小鼠检测到阴道栓的当天早晨定为妊娠第0天。
- 当胚胎发育达到所需阶段（此处为胚胎第15天（E15））时，通过颈椎脱位法处死妊娠雌鼠，并将其固定在石蜡板上6。
- 用70%乙醇润湿腹壁，沿中线剪开，并用镊子将皮肤瓣向两侧固定6。
- 将子宫从腹腔中取出，分离后转移至含有冷PBS的烧杯中6。
- 将胚胎分离，转移至培养皿中，并使用镊子小心去除子宫壁和胚胎膜6。
- 通过断头法处死胚胎。
- 使用精细的弯头镊子摘除眼球，将眼睛从眼窝中“剥离”出来。
出生后及成年眼球的去核
- 幼龄幼崽通过断头处死，较大幼崽及成年个体通过颈椎脱臼处死。
- 在出生后第15天（P15）之前，即小鼠睁眼的时间点，需使用镊子机械性打开眼裂，并用弹簧剪在眼睑处进行两处横向剪切以扩大开口。
- 通过使用弯头镊子对眼眶施加压力，摘除眼球。
注意：出生后第2天，眼眶骨仍处于软骨状态，因此在摘除眼球时切勿施加过大压力。
相比之下，成年小鼠的眼眶骨已较为坚硬，因此摘除眼球时只需对眼眶施加压力即可，无需预先扩大眼裂。
第2部分：胚胎期、出生后及成年小鼠视网膜的解剖分离
视网膜的解剖
- 将眼球置于含有无菌 PBS 的小型培养皿中，并在解剖显微镜下去除周围的眼组织层。
- 在出生后阶段和成年眼球中，为去除外层眼组织，需使用弹簧剪或镊子尽可能靠近基部切断视神经。
- 旋转眼球，使背部朝向操作者，即原先视神经穿出的位置所形成的孔洞面朝前方。从视神经穿入眼球组织的部位，用两把极细镊子的尖端插入视网膜与色素上皮之间的视网膜下腔。
注意：通常情况下，色素上皮因其深色而易于识别。但在某些小鼠突变品系中——尤其是白化动物——该色素层可能无颜色，因此难以辨认。 - 用两把镊子小心地向两侧撕扯，去除附着有脉络膜和巩膜的色素上皮层。
- 剥离组织至角膜水平，然后将眼杯翻转至晶状体一侧，在用另一把镊子固定残留的视网膜杯的同时，将角膜连同色素上皮、脉络膜和巩膜一并移除。
- 用镊子夹住玻璃体及其中的小型晶状体，在撕扯的同时用第二把镊子固定视网膜整体标本。
注意：解剖胚胎眼球时，务必连同玻璃体一起彻底去除位于玻璃体下方的三角形、帐篷状毛细血管丛。
在成年眼球中，应从两侧夹取玻璃体，操作时需注意避免镊子尖刺破玻璃体，因其内容物黏稠，易黏附于镊子表面，妨碍完整移除。 - 用于器官型整体培养的视网膜杯收集于含有 200 μl DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基，见下文）的 96 孔板中。
注意：在分离各视网膜样本之间，应将含有培养基的96孔收集板置于培养箱中，因为培养基的pH值通过碳酸盐系统受CO2调节。
第3部分：小鼠视网膜器官型全层培养
- 通过称取 7.8 g 达尔伯克改良伊格尔培养基/汉姆 F-12 营养混合物（DMEM）和 0.6 g NAHCO3，溶于 MilliQ 水中，配制 500 ml 培养液。将 pH 值调节至 7.15。在超净台中加入 50 mg 脱铁转铁蛋白、50 μl 腐胺（储备液：60 mg/ml）、50 μl 亚硒酸钠（储备液：52 μg/ml）、孕酮（储备液：60 μg/ml）和 2.5 ml 庆大霉素（200 mM）。混匀后通过瓶口滤器过滤。使用前立即每毫升培养基加入 10 μl 谷氨酰胺（200 mM）。
注意：该无血清且无胰岛素的培养基可在 4°C 下保存最多 2 周，适用于诱导凋亡实验，因无胰岛素干扰实验效应。若需对整体组织进行超过 24 小时的孵育且不评估细胞死亡率，则应添加胰岛素或血清（如胎牛血清；FCS）等补充物以提高存活率。 - 在开始培养前，将视网膜整体组织在 37°C 下预孵育 15 分钟，使用 200 μl 温热、pH 平衡的 DMEM，其中含有 0.5 mg/ml 透明质酸酶，以预先消化米勒胶质细胞所含的内界膜和外界膜中的透明质酸酶，从而促进外源性物质的渗透。
- 将视网膜转移至 24 孔板中，尽量减少透明质酸酶残留，并在 2 ml 化学成分明确的达尔伯克改良伊格尔培养基中以器官型整体组织形式进行培养。
注意：转移视网膜时，使用 1 ml 移液枪，并将枪头切去数毫米以扩大开口。对于胚胎眼球，200 μl 枪头已足够。可通过插入并旋转第二个枪头来打磨切割边缘使其平滑。
对于 24–48 小时的短期培养，所有操作可在实验台上进行；但如果发现培养物污染问题，则应在超净台内操作。 - 培养物在 37°C、5% CO2 的环境中维持 24–48 小时，并可例如接受重组因子的药理学处理。
第4部分：培养的视网膜全层组织的解离
- 在所需的培养时间后，将视网膜收集到含有850 μl PBS和50 μl牛血清白蛋白（BSA；30 mg/ml）的2 ml 圆底离心管中。
- 将装有视网膜的离心管放入预热至37°C的加热块中。
- 向每个离心管中加入25 μl胶原酶（200 U/ml）和25 μl透明质酸酶（20 mg/ml），并通过硅化巴斯德移液管吹打3次，使视网膜解离成单细胞悬液。
- 加入10 μl胰蛋白酶（1 mg/ml），孵育3–5分钟，然后用硅化巴斯德移液管缓慢吹打3–5次，以机械方式进一步解离组织。
- 加入10 μl DNase I（5 mg/ml），再次孵育3–5分钟，然后用硅化巴斯德移液管缓慢吹打3–5次。
注意：酶解孵育时间因眼球大小和发育阶段而异。可通过轻柔吹打来检查组织酶解的程度。 - 如果此时细胞悬液仍不均匀，仍存在较大的细胞团块，可额外加入10 μl胰蛋白酶和10 μl DNase I。
- 当细胞悬液呈现均匀状态时，加入10 μl EDTA（0.5 M）终止消化反应，将离心管从加热器上取出，并在室温下于旋转摇床上加入1 ml新鲜的、预冷的8%多聚甲醛（PFA），固定1小时。
第5部分：解离细胞悬液的洗涤
- 将细胞悬液在4°C、0.2 rcf条件下，于冷却离心机中离心5分钟。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于含3 mg/ml BSA的1 ml PBS中。
- 重复上述洗涤步骤两次后，最终将沉淀重悬于500 μl PBS中，其中含有3 mg/ml BSA、5 mM EDTA和0.1%叠氮化钠。
注意：在细胞悬液中加入酸性钠可使其在 4°C 下保存数天。然而，如果后续将进行免疫细胞化学染色，则不要在重悬缓冲液中添加酸性钠，因为这会导致染色质量下降。
第6部分：用于定量分析细胞凋亡和增殖的细胞悬液细胞离心涂片
- 将一端磨砂的显微镜载玻片、带有一个或两个孔的细胞离心涂片滤膜以及细胞离心涂片漏斗插入细胞离心涂片夹中。关闭涂片夹后，将其置于细胞离心转子中。
- 通过轻柔吹打将解离的细胞悬液混匀。
注意：根据视网膜的发育阶段，解离程序获得的细胞悬液可能需要用 PBS 稀释，以获得可计数的细胞数量。 - 一份等分试样（100 μl将细胞悬液的一滴加入细胞离心涂片机的漏斗中。
注意：将细胞悬液移液至漏斗时，移液器吸头应一直伸到漏斗底部。切勿按压移液器的第二档压力点，否则会产生气泡，这些气泡在离心涂片后可见于细胞斑点中，干扰细胞计数。 - 细胞悬液以700 rpm转速在载玻片上离心7分钟。
- 为测定外源施加因子对细胞凋亡水平的影响，可用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI； 2μg/ml)，用荧光封片剂封片。通过计数至少1000个细胞（包含至少10个浓染核）的细胞涂片点来确定细胞凋亡的变化，细胞死亡率以总细胞数的百分比计算3,4.
注意：或者，可在平铺样本中评估凋亡细胞核的分布情况3 或通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）对培养的视网膜全层铺片进行冰冻切片检测。 - 用于检测细胞增殖，使用 BrdU（5 μM可在培养结束前6小时加入，通过免疫细胞化学染色（使用抗BrdU抗体，例如美国爱荷华州发育研究杂交瘤库）在细胞匀浆的细胞离心涂片中可视化BrdU掺入情况。
- 通过使用神经元特异性抗体（如Brn3a（视网膜神经节细胞标志物）或视紫红质（感光细胞标志物））对细胞涂片进行染色，并用DAPI复染，可直观显示治疗对不同类型视网膜细胞的影响。
第7部分：代表性结果
图1： 小鼠视网膜器官型整体装片制备步骤
A 含双眼的小鼠头部。 B 小鼠眼球，晶状体朝上，所有层次结构仍完整。 C 小鼠眼球背面观，视神经仍附着。 D 部分去除巩膜和色素上皮的小鼠眼球。 E 完全去除角膜、巩膜和色素上皮，但晶状体和玻璃体仍保留的小鼠视网膜。 F 去除晶状体和玻璃体后的小鼠视网膜整体装片杯状结构。 请点击此处查看图1的放大版本。
图2：通过细胞离心涂片和切片分析视网膜类器官全层培养物
为分析细胞凋亡，可对解离后的细胞悬液制备细胞离心涂片，并用DAPI染色，通过细胞核碎裂或染色质浓缩来识别凋亡细胞核（A中箭头所示）。或者，也可对全层组织切片（C-E；小鼠出生后第（P）2天的视网膜）或视网膜平铺标本（F）进行TUNEL检测，并用DAPI复染（E）。通过细胞离心涂片结合神经元特异性抗体（如视网膜神经节细胞标志物Brn3a）可观察不同处理对各类视网膜细胞的影响（B中箭头所示）。GCL，神经节细胞层；INL，内核层。请点击此处查看图2的放大版本。
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讨论
与解离培养、单层培养、视网膜球状体或再聚集的三维球状体培养1相比，小鼠视网膜器官型全层培养2-5的优势在于能够保留神经元之间的相互作用和连接，从而模拟体内（in vivo）的真实情况。与以往报道2相比，本视频文章详细展示了摘除小鼠眼球及分离不同发育阶段视网膜过程中的技术要点，包括在不损伤视网膜的前提下移除晶状体和玻璃体。移除晶状体和玻璃体对于药理学操作至关重要，因为二者会阻碍物质进入视网膜各层。与其他已报道的小鼠外植体培养系统不同，我们的器官型培养不使用支撑材料（如聚碳酸酯膜2），而是将视网膜全层组织块以自由漂浮的方式进行培养，从而进一步提高了外源性物质的可及性3-5。
使用化学成分明确、无血清且不含补充物的培养基（不含胰岛素）仅能支持短时间培养（24 - 48 小时），但可避免胰岛素对细胞凋亡水平的抵消作用3，以及胎牛血清（FCS）和补充物所具有的生长因子模拟效应。
大多数...
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致谢
作者感谢 E. de la Rosa 和 A.I. Valenciano 在建立器官型培养体系初期提供的帮助，以及 U. Laub 和 U. Gerster 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 小鼠 | 动物 | Charles River Laboratories | ||
| 解剖显微镜 | 工具 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBS | 试剂 | Sigma-Aldrich | PBS 应为冷的（> 4°C）且无菌 | |
| Dulbecco 改良 Eagle 培养基 / F-12 Ham 营养混合物 | 试剂 | Sigma-Aldrich | D 8900 | DMEM / F-12 |
| 转铁蛋白 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T 1147 | |
| 腐胺 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P 5780 | |
| 亚硒酸钠 | 试剂 | Sigma-Aldrich | S 9133 | |
| 孕酮 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P 6149 | |
| 庆大霉素 | 试剂 | Invitrogen | ||
| L-谷氨酰胺 | 试剂 | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X)，液体 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | 试剂 | Carl Roth Gmbh | 8076.3 | 30 mg/ml |
| 胶原酶 | 试剂 | Sigma-Aldrich | C 0773 | 200 U/ml |
| 胰蛋白酶 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T4799 | 来源于猪胰腺；1 mg/ml |
| 透明质酸酶 | 试剂 | Sigma-Aldrich | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | 试剂 | Roche Group | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | 试剂 | Sigma-Aldrich | E 6511 | |
| 硅油溶液 | 试剂 | SERVA Electrophoresis | 35130 | |
| 多聚甲醛 (PFA) | 试剂 | Sigma-Aldrich | P6148 | 0.1 M 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中含 8% PFA。 |
| 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 | 试剂 | Sigma-Aldrich | D 0542 | DAPI |
| 荧光封片介质 | 试剂 | Dako | S3023 | |
| BrDU | 试剂 | Sigma-Aldrich | B 9285 | |
| 96 孔板 | 工具 | Falcon BD | 3072 | |
| 24 孔板 | 工具 | Falcon BD | 3047 | |
| 巴斯德吸管 | 工具 | Brand GmbH | 747720 | |
| DUMONT #5 镊子 | 工具 | Fine Science Tools | 11252-30 | 斜面极细柄（尖端 0.05 mm × 0.02 mm） |
| DUMONT #7 镊子 | 工具 | Fine Science Tools | 11271-30 | 弯曲柄（尖端 0.07 mm × 0.10 mm） |
| 弹簧剪，直型，8 cm | 工具 | Fine Science Tools | 15000-00 | 细小直刃 |
| 标准剪刀，直型，锐/钝头 | 工具 | Fine Science Tools | 14007-14 | 用于断头或颈椎脱位 |
| Eppendorf 管 | 工具 | Eppendorf | 2 ml；圆底，便于离心/细胞离心涂片时沉淀形成 | |
| 冷冻离心机 | 工具 | Eppendorf | ||
| 旋转摇床 | 工具 | CAT | ||
| 细胞离心涂片仪 | 工具 | Thermo Fisher Scientific, Inc. |
参考文献
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
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