Summary
혈소판 유착 계단식는 전단 흐름의 존재에서 일어나는, 요인은 종래의 (정적) 잘 철판 assays에서 차지하는 없습니다. 이 문서의 생리 전단 흐름 조건을 에뮬레이트하는 microfluidic 잘 플레이트 형식을 이용한 혈소판 - 집계 분석에 대한 보고서.
Abstract
혈소판 응집은 내피 아래의 세포외 기질이 노출되었습니다 혈관 손상에 대한 응답으로 발생합니다. 혈소판 유착 계단식는 전단 흐름의 존재에서 일어나는, 요인은 종래의 (정적) 잘 철판 assays에서 차지하는 없습니다. 이 문서의 생리 전단 흐름 조건을 에뮬레이트하는 microfluidic 잘 플레이트 형식을 이용한 혈소판 - 집계 분석에 대한 보고서. 세포외 단백질, 콜라겐 I 또는 폰 Willebrand 인자는 공기 펌프와 적극적인 재관류를 사용하여 microfluidic 채널 내에 입금됩니다. 매트릭스 단백질은 다음 버퍼로 세탁 및 혈소판 상호 작용에 대한 microfluidic 채널을 준비하는 차단됩니다. 형광 염료로 분류 전체 혈액은 혈소판 활성화 및 집계를 달성하기 위해 다양한 유량에서 채널을 통해 perfused입니다. 혈소판 응집 억제제는 IC50의 선량 응답 데이터를 생성하는 흐름 세포 실험 이전에 추가할 수 있습니다.
Protocol
1 부 : BioFlux 판의 microfluidic 채널의 준비.
- 흐름 세포 실험을 실행하기 전에, 하나는 관심의 단백질 코팅 microfluidic 채널을 준비해야합니다. 이 경우에는 콜라겐은 내가이 사용됩니다. 각 채널은 잘 입구와 콘센트가 있습니다. 이 접시는 입구가 잘 잘 채널과 우물이 오른쪽에있는 콘센트를주고 왼쪽입니다.
- 0.02M 초산에 200μg/ml 농도 콜라겐 I (5mg/ml 주식) 코팅을 희석. 하나는 사용되는 각 채널에 대해 20μl가 필요합니다. micropipette 팁과 부드러운 triteration하여 섞는다.
- 사용되는 각 해당 채널에 코팅 20 μl를 추가합니다. 하나는 잘 micropipette를 사용하여 관심있는 microfluidic 채널을 먹이 콘센트의 내부 펀치로 액체를 분배합니다. 거품을 도입하지 마십시오, 피펫의 공기를 밀어하지 않습니다. 콜라겐 컨트롤을위한 콜라겐없이 하나의 채널을 (접착 및 집합에 대한 부정적인 컨트롤)을 포함시키십시오.
- 4 개의 나사 그리고 그들이 모두 설정되면 완전히 조이 토크 드라이버를 사용 강화 첫 번째 손가락으로 접시에 인터페이스를 연결합니다. 그것이 최대 죄어져 있음에 도달하면 토크 드라이버를 클릭합니다.
- BioFlux 소프트웨어에서 수동 모드를 사용하여 콘센트에 잘 2dyn/cm -에서 2 관심의 채널에 재관류를 적용할 수 있습니다. 여기 하나는 액체로 가득하는 반대 안쪽 펀치에 대한 감시해야합니다. 이것은 몇 분 정도 소요됩니다. 하나는 하나 이것은 현미경의 낮은 전력을 사용하는 목적 (4X)과 잘하거나 접시를 들고 아래에서 유입 우물을 조사하여 입구를 찾는가 발생할 볼 수 있습니다. 하나는 먼저 천천히 안쪽 펀치를 채우고 액체의 작은 구슬이 나타납니다. 입구 안쪽 펀치가 가득되면, 소프트웨어의 중지를 추진하여 한번에 재관류를 중지합니다.
- 한 시간 만이라도 실온에서 접시를 품어.
- 인터페이스를 제거하고 잘 콘센트에 PBS (플러스 칼슘 2 + / MG 2 +) 1 ML를 추가합니다. 2dyn/cm 2 잘 콘센트에서 재관류를 시작합니다. 10 분 동안 재관류를 계속합니다. 재관류를 중지하고 인터페이스를 제거합니다.
- 입구와 출구의 우물 모두에서 초과 PBS를 제거 - 내부 펀치를 채우고 액체를 제거하지 마십시오. 차단 솔루션 (0.5 % PBS의 V / V BSA (플러스 칼슘 2 + / MG 2 이상)을)를 사용하여 채널을 차단합니다. 사용할 수 있도록 잘 각 콘센트에 차단 솔루션 1 ML을 추가하고 2dyn/cm 2 잘 콘센트에서 perfuse. 10 분 동안 재관류를 계속합니다. 재관류를 중지하고 인터페이스를 제거합니다. 이 단계까지 준비 채널이 하루 동안 사용할 수 있습니다.
- 혈액을 추가하기 전에, 안쪽 펀치를 제외하고 채널의 양쪽에있는 액체를 제거합니다.
2 부. GPIIb / IIIa 억제 항체와 함께 혈액을 준비.
- 콜라겐이 채널에 잠복기이지만, 하나는 전체 혈액을 준비합니다. 하나는 인간의 혈액을 다룰 때 그 / 그녀의 연구소에 의해 결정 biosafety 규정을 따라야합니다.
- 나트륨 구연 산염의 항응고제로 그려 신선한 인간의 피를 (금식 개인에서) 컬렉션 3 시간 이내에 사용해야합니다.
- AM 4μM calcein을 추가하여 혈액을 준비합니다. DMSO의 AM calcein의 4mm짜리 주식을 준비하고 1천분의 1 V /의 희석에 혈액에 추가 V. 부드러운 역전로 섞는다.
- 1.5mL microtubes - 1 calcein의 ML 10에 혈액 라벨 AM 하는걸. 원하는 희석 (IgG의 분자량은 150kDa ~입니다)에서 각 GPIIb / IIIa 억제제 항체를 추가합니다. 예제 희석 시리즈 1200nM에서 9nM하는 것입니다 그리고 항체 컨트롤도 및 관련없는 항체 컨트롤을 포함하지 않습니다. 억제를위한 훌륭한 긍정적인 제어 20ug/ml의 농도에서 (압식시맙, 엘리 릴리) ReoPro 것입니다. 온화한 역전의 혼합.
- 1 시간 동안 실온에서 알을 품다. 부드러운 역전로 10 분마다 섞는다.
파트 3 : BF1000 워크 스테이션에서 유동 세포 실험을 실행.
- 첫째, 하나는 BioFlux 제어 모듈에 자동 프로토콜을 설정해야합니다. 콜라겐을 위해서라면, 하나는 잘 콘센트에서 10 분 동안 10dyn/cm 2 실행하는 프로토콜을 설정해야합니다. 이 시점에서 하나도 BF1000 워크 스테이션을 사용하여 데이터 수집 매개 변수를 설정해야합니다, 채널 위치를 포함하여, FITC 파장 및 시간 - 저속 정보를 캡처합니다. 그것은 총 10 분 기간 동안 채널당 10X 목표 30 초마다를 사용하여 볼 3 분야를 캡처하는 것이 좋습니다.
- 별도의 준비 채널로 각 조건의 준비 피가 500ul 빠르게 작업, 장소. 콜라겐 그리고 차단 하나 코팅하는 채널로 아무 항체 제어 혈액 플레이스 없습니다.
- 접시에 인터페이스를 배치합니다.
- BF1000 워크 스테이션 현미경에서 접시를 놓습니다. 인터페이스에 클램프.
- 플레이트 부하 조정을 수행합니다. 또한, 하나 잘 들어있는 혈액으로 무대를 이동합니다. 설정 FTIC 이미지 캡쳐 매개 변수 (노출 시간, 이득 등 ...).
- BioFlux 몬티지 소프트웨어에서 동시에 유동 및 수집을 시작하는 인수를 시작합니다.
- BF1000 워크 스테이션에서 접시를 제거, 기관 지침에 따라 접시의 처분.
4 부 : 대표 결과.
여기 microfluidic 채널 혈소판 점착 및 집계를위한 프로토콜이 제시되었다. 혈소판 응집 억제제 치료는 anti-GPIIb/IIIa 또한 프로토콜에 포함되었다. BioFlux 시스템의 콜라겐 코팅 microfluidic 채널을 사용하여, 하나는 치료 제어 혈액 샘플과 uncoated 채널없이 혈전 형성과 함께 시간이 지남에 따라 적극적인 혈전 형성을 볼 것으로 예상한다. 한 최근 수행한 실험에서, 제어 조건 집계의 평균 크기는 2000μm이되었습니다.
그림 1. 
활성 GPIIb / IIIa는 혈소판 - 상호 작용과 혈소판 집합 안정화 1 강력한 중보자입니다. 콜라겐에 부착이 응답 2 이끌어내는 수있는 GPIIb / IIIa 복잡한을 활성화한다. 전단 노출 이전에 1 시간 anti-GPIIb/IIIa과 부화 후, 하나는 thrombi의 크기의 감소뿐만 아니라 혈전 형성의 빈도 감소를 관찰할 것으로 기대한다. 선량에 의존 반응은 일반적으로 10dyn/cm 2 볼 수 있습니다.
그림 2. 
이 특정 억제제에 대한 IC 50 값은 10 dyn / cm 2 17nM되었습니다. 노 항체 컨트롤에 비해 최대 억제 (이 기증자에 대한) 10 dyn / cm 2 11%되었다.
여기에 방법이 특정 세포외 기질 단백질과 혈소판 집합의 특정 억제제를 사용하여 제시하는 동안, 프로토콜은 다른 코팅 다른 세포 종류와 세포 유착 assays 다른 억제제로 확장됩니다. 이러한 실험의 성공의 핵심 요소는 모든 시약에 대한 microfluidic 채널, 올바른 diluents의 모든 시약의 정확한 희석하고, 적절한 배양 조건에서 거품의 소지를 없애기 있습니다.
Discussion
여기에 방법이 특정 세포외 기질 단백질과 혈소판 집합의 특정 억제제를 사용하여 제시하는 동안, 프로토콜은 다른 코팅 다른 세포 종류와 세포 유착 assays 다른 억제제로 확장됩니다. 이러한 실험의 성공의 핵심 요소는 모든 시약에 대한 microfluidic 채널, 올바른 diluents의 모든 시약의 정확한 희석하고, 적절한 배양 조건에서 거품의 소지를 없애기 있습니다.
Disclosures
기여 저자 Fluxion Biosciences의 직원입니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
