Summary
ديكستران سلفات الصوديوم (DSS) في إدارة مياه الشرب هو تأسيس نموذج إصابة الفئران التهاب التهاب القولون الحاد. هذا البروتوكول يحدد طريقة لمعالجة مفاجآت صيف دبي ، وإعداد الأنسجة.
Abstract
يمكن أن يحدث التهاب القولون من العدوى الفيروسية أو البكتيرية ، وإهانة الدماغية ، أو اضطرابات المناعة الذاتية ، التهاب القولون التقرحي لا سيما ومعظم المتغير القولون مرض كرون -- التهاب القولون كرون. التهاب القولون الحاد قد الحالية مع آلام في البطن وانتفاخ ، سوء الامتصاص ، والإسهال ، وتغوط مدمى مخاط في البراز. نحن بداية لفهم التفاعلات المعقدة بين البيئة والوراثة ، وضعف الحاجز الظهاري في مرض التهاب الأمعاء والقولون نماذج من الحيوانات قد تم أساسي في تعزيز فهمنا لهذا المرض. نموذج واحد شعبية ينطوي المكمل لمياه الشرب من الفئران مع منخفضة الوزن الجزيئي كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) ، مما أسفر عن أضرار الظهارية وردا قويا على التهاب في القولون تستغرق عدة أيام
Protocol
الجزء 1 : بالاصابات إصلاح النموذجي التهاب القولون
- وينبغي الحصول على الوزن أساسية لكل الماوس قبل بداية العلاج مفاجآت صيف دبي.
- إجراء 3 ٪ سلفات الدكستران (ث / ت) الصوديوم محلول الملح في الماء وتصفيته مع مرشح 0.45 ميكرون خلات السليلوز.
- يحل محل مياه الشرب في قفص الفأر مع الحل مفاجآت صيف دبي 3 ٪ لمدة أربعة أيام. ينبغي أن الفئران لم تتمكن من الوصول إلى أي مصدر آخر للمياه (نصائح استبعاد أي وضعها على نظم الري الآلي).
- في اليوم الرابع ، حل محل مفاجآت صيف دبي مع الماء لثلاثة أيام إضافية ، والسماح لبعض الانتعاش القولون الظهارية. وينبغي أن يكون وزنه على الفئران على مدى أربعة أيام من أجل تقدير العواقب النظامية من القولون. فقدان الوزن هو مشترك مع اصابة شديدة.
- في يوم 7 ، تزن والتضحية الفئران. وافق IACUC يمكن الموت الرحيم الفئران جرعة زائدة من قبل لisoflurane الاستنشاق ، أو غيرها من مؤسسيا ، وأساليب.
الجزء 2 : التشريح وحصد القولون
- كشف الجانب البطني للفأرة والساقين آمنة لضمان الوصول دون عائق في البطن. الرطب البطن تماما مع الايثانول 70 ٪.
- فهم خط الوسط في البطن مع ملقط الأنسجة وبالتالي تمديد صعودا خيام الجلد. غرامة استخدام مقص يميل إلى شق البطن مما يعرض محتويات البطن. تمديد شق لغيض من عملية سيفي الشكل في خط الوسط وتمتد بعد ذلك على طول الجانب السفلي للهوامش الساحلية على المستوى الثنائي.
- التعرف على الأمعاء الدقيقة ، الأعور والقولون. تشريح بعناية / ندف القولون من مساريق المحيطة بها. المسح الشامل للقولون في عمق الحوض لتحرير القاصي القولون والمستقيم. المسح الشامل للقولون على هامش colonocecal لتحرير القولون القريبة. ويجب أخذ الحيطة والحذر خلال هذه العملية لا يلحق الضرر القولون وتنظيف القولون وسوف يحدث مشكلة إذا ثقب.
- باستخدام إبرة التغذية 20G و 10 مل حقنة ، intubate وتدفق القولون مع الثلج الباردة PBS حتى شطافة واضح تماما من البراز.
- عند هذه النقطة ، إذا كان المطلوب هو تحليل العيانية مع مجهر تشريح ، يمكن أن تكون ثابتة في نقطتين بأنها "النقانق". إذا كان التحليل نسيجية فقط هو المطلوب من الشروع في الجزء 4 "صنع رولز السويسرية للتحليل النسيجي للالتهاب القولون الحاد".
الجزء 3 : معالجة بأنها "النقانق" لتحليل ترى بالعين المجردة والقولون بأكمله
- فمن المهم للحفاظ على التوجه الصحيح من القولون ، وبالتالي ، والحفاظ على النهاية البعيدة من القولون الأقرب إلى المشغل. قطع قطعتين من غير قابل للامتصاص خياطة (SP116 1.5 الحرير مضفر متري) ، واحدة تقريبا 1 بوصة في الطول ، وغيرها من 2 بوصة.
- استخدام قطعة 2 بوصة من خياطة لادراك التعادل قبالة نهاية البعيدة أقرب إلى الهامش ممكن مع الحفاظ على ختم جيدة.
- مكان إبرة التغذية 20G تحتوي على 5 مل من الفوسفات بنسبة 10 ٪ مخزنة الفورمالين في نهاية القريبة من القولون. التعادل فضفاضة قطعة المتبقية من الدرز القريبة على الفور إلى بصلة الإبرة التغذية. فهم القولون بحزم على بصلة الإبرة والتغذية لبث الفورمالين حتى يتم توسيع القولون. تشديد عقدة في خياطة كما كنت تسحب الإبرة التغذية ، مما يترك غرست والقولون الموسع بأنه "النقانق".
- ملء أنبوب 15 مل المخروطية مع 10 ٪ مخزنة الفوسفات الفورمالين ومكان القولون في أنبوب. الإصلاح لمدة 24 ساعة.
- تخلصي الفورمالين واستبدالها مع EtOH 70 ٪ ل24hrs إضافية. (يمكن تخزين في الكولونات EtOH 70 ٪ لأجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة).
- إزالة القولون من أنبوب مخروطي الشكل وقطع الخيوط على كل نهاية مع مشرط ، والحرص على عدم الاضرار القولون. نتذكر أن القاصي ونهاية أطول قطعة من السلسلة. قطع طولي من القاصي والداني من نهاية القولون بحيث تشكل ورقة طويلة. عند هذه النقطة ، يمكن أن ينظر إلى القولون تشريح تحت المجهر.
الجزء 4 : جعل رولز السويسرية للتحليل النسيجي للالتهاب القولون الحاد
- فمن المهم للحفاظ على التوجه الصحيح من القولون ، وبالتالي ، والحفاظ على النهاية البعيدة من القولون الأقرب إلى المشغل.
- قياس طول القولون. هذا المقياس هو مؤشر آخر على مدى خطورة الاصابة. التهاب القولون يزيد ذمة ويقصر طول القولون عموما.
- باستخدام غرامة ذات الرؤوس مقص ، شق طولي من القاصي والداني من نهاية القولون. استخدام ملقط يميل غرامة لفهم إما حافة شق وفتح أفقيا تعمل بشكل أقصى طريقك -> قريب ، وبالتالي عرض القولون ورقة مسطحة.
- المتداول القولون يتطلب زوج من الملقط وتقنية two الوفاض. فهم إما حافة الهامش القاصي بالملقط. انتقل إلى لفة بالتسلسل القولون عن طريق تناوب والافراج عن ملقط الشروع في الهامش القريبة. مما يولد دوامة مع البعد الثالث أو "سويس رول".للحفاظ على شكل تدحرجت ، فهم لفة بحزم مع ملقط والقطع مع إبرة 27G1 / 2. تأمين إبرة عن طريق الانحناء الإبرة فور خروجها من لفة.
- مخزنة في مكان لفة في الكاسيت النسيج المسمى بشكل مناسب ووضعه في وعاء من الفوسفات بنسبة 10 ٪ من الفورمالين في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة للتأكد من تثبيت الأنسجة.
- تخلصي الفورمالين واستبدالها مع EtOH 70 ٪ ل24hrs إضافية. (يمكن تخزين في الكولونات EtOH 70 ٪ لأجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة).
- مرة واحدة وقد تم تحديد عينة ، يمكن أن يكون جزءا لا يتجزأ من البرافين ، مقطوع والتي شنت على شرائح نسيجية لتحليلها.
الجزء 5 : نتائج الممثل
نموذج لمفاجآت صيف دبي التهاب القولون الحاد يتيح للباحث الحصول عليها ، الإصلاح ، وتحليل القولون التهاب القولون الحاد أن النماذج. عندما يتم قطع لفة السويسرية والمركبة ، فإنه ينبغي أن تشكل شريحة تمثيلية من القولون بأكمله إذا توالت بشكل صحيح (الشكل 1). يمكن أن تكون ملطخة لفة مزودة H & E وذلك لتحديد مدى الأضرار التي لحقت القولون ، من نهاية (داخل) القاصي إلى نهاية (خارج) القريبة (الشكل 2). ويمكن أيضا أن يؤديها المناعية على لفة السويسرية لتحديد وقياس تتسرب التهابات. إذا تم تنفيذ الأسلوب النقانق بشكل صحيح ، سوف تمدد القولون ثابتة ويمكن أن يكون كامل سطح المخاطية معالجته بسهولة وينظر تحت المجهر تشريح (الشكل 3).
الشكل 1 ، والتي ينفذها بشكل صحيح "سويس رول". (A) هو إرجاع القولون من القاصي والداني نهاية ، مقطوع بإبرة وتأمينها عن طريق الانحناء نهاية الإبرة. يوضع بعد ذلك في شريط كاسيت لتثبيت الأنسجة. (ب) ملطخة H & E الباب 5 ميكرون من لفة السويسرية المصنوعة من القولون من ماوس تعامل مع مفاجآت صيف دبي (د = = القولون القولون القاصي الداني ع).
الشكل 2. كولون مفاجآت صيف دبي معاملة تظهر علامات التهاب القولون الحاد. الالتهاب والضرر سرداب واضحة في القولون مفاجآت صيف دبي معاملة مقارنة مع التحكم في المياه المعالجة.
الشكل 3. مثال على "النقانق". النقانق يملؤه الفورمالين وتوسعت بشكل كامل. وسوف تكون الزاوية طفيفة الثانوي الحالي إلى انحناء طبيعي من القولون. ينبغي أن السجق فتح الاستلقاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تعديل هذا البروتوكول النموذجي لإصابة الحادة ، وإصلاح الضرر ، أو إصابة مزمنة عمليات القولون.
الإصابات الحادة تعديل :
مفاجآت صيف دبي ليب الإعلانية العلاج لمدة 4-6 أيام تليها التضحية الفوري
الاصابات إصلاح تعديل :
مع إصابة 4-6 أيام من العلاج مفاجآت صيف دبي تليها فترة نقاهة لمدة 3-4 أيام والتضحية (كما هو موضح في بروتوكول أعلاه).
التهاب القولون المزمن تعديل :
يتم وضع الفئران في دورات لمدة خمسة أيام ثلاثة من مفاجآت صيف دبي 3 ٪ مع ستة عشر يوما من الانتعاش بين كل دورة. وضحى الفئران بعد فترة نهائية بقية 16 يوما.
هناك العديد من القضايا التي يحتاج الباحثون إلى أن تكون على علم مع هذا النموذج :
- تقلب في موقع الإصابة : في أيدينا ، ونحن نرى نمط اصابة القاصي في الغالب ، مع تجنيب النسبية من القولون الأعور والداني. وأفادت آخرين أكثر الأقرب إلى غلبة نمط الاصابة.
- التغير البيئي. هناك تقلبات بيئية كبيرة. وهذا هو المرجح ، في جزء منه ، وذلك بسبب الاختلافات في الدقيقة المعوية ، والنظام الغذائي والاعتبارات البيئية الأخرى.
- هذا النموذج غير فعال إذا تم استخدام DSS عالية الوزن الجزيئي (أي 500000 دا).
- هناك قدر كبير من التباين سلالة مع هذا النموذج 4.
يمكن إجراء تحليل كيميائي حيوي من القولون بواسطة أخذ عينات من الهوامش القريبة أو البعيدة. اعتمادا على شدة الاصابة وهذا قد أثر على قدرتك على توليد درجة إصابة نسيجية. في BrdU فيفو يمكن وضع العلامات لقياس انتشار يتحقق عن طريق الحقن داخل الصفاق من 16.7 ميكروغرام / كغ 2 ساعات قبل BrdU للتضحية تليها تجهيز IHC α - BrdU.
كبديل ل "النقانق" ، يمكن أن تكون ثابتة في القولون مسطح تماما. خط مخزنة أسفل حاوية تثبرور مع ورقة Whatman ونقع ورقة مع 10 ٪ فوسفات الفورمالين. تشريح النقطتين كما هو موضح في "الجزء 2 : التشريح وحصد القولون". مرة أخرى ، والحفاظ على النهاية البعيدة من القولون الأقرب إلى المشغل. باستخدام غرامة ذات الرؤوس مقص ، شق طولي من القاصي والداني من نهاية القولون. بالملقط يميل غرامة فهم إما حافة شق وفتح أفقيا العمل ، وبالتالي عرض القولون ورقة مسطحة. نقل هذه الورقة إلى ورقة مسطحة Whatman قبل غارقة. تغطية القولون بالارض مع قطعة أخرى من Whatman والرطب مع 10 ٪ مخزنة الفوسفات الفورمالين. يجب أن تكون مغطاة بالكامل Whatman في الفورمالين ولكن ليس كثيرا بحيث ترفع قبالة القولون. ختم تثبرور والإصلاح لمدة 24 ساعة. إزالة القولون من تثبرور ووضعه في الايثانول 10 مل 70 ٪ في أنبوب مخروطي 15 مل. (يمكن تخزين في الكولونات EtOH 70 ٪ لأجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة).
هناك عدة طرق لقياس إصابة القولون 5،6،7. أسلوب واحد ، على سبيل المثال ، يستخدم على نطاق المعلمة متعددة منها : التهاب المشاركة ، ومدى ، والتجدد ، والضرر سرداب ، ومشاركة 8 في المئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها IACUC فاندربيلت.
Acknowledgments
بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (1 DK080221 K08 - 01) وصناديق التنمية المؤسسية فاندربيلت.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
- Okayasu, I. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
- Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
- Hahm, K. B. Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease. Gut. 49 (2), 190-198 (2001).
- Green, B. T. Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).
- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
