Nous décrivons une méthode pour l'observation de la réplication en temps réel des molécules individuelles d'ADN médiée par les protéines du système de réplication des bactériophages.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Observation directe d'ADN Enzymes réplication via un ADN simple molécule Stretching Assay
Dans cet article
Résumé
Résumé
Nous décrivons une méthode pour l'observation de la réplication en temps réel des molécules individuelles d'ADN médiée par les protéines du système de réplication des bactériophages. Linéarisé λ ADN est modifiée pour avoir une biotine à l'extrémité d'un brin, et un fragment de la digoxigénine sur l'autre extrémité du même brin. La fin biotinylé est attaché à une lamelle de verre fonctionnalisée et la fin digoxigeninated à une petite perle. L'assemblage de ces attaches ADN perlent à la surface d'une cellule de flux permet un flux laminaire à être appliqués à exercer une force de traînée sur le talon. En conséquence, l'ADN est étiré proche et parallèle à la surface de la lamelle à une force qui est déterminé par le débit (Figure 1). La longueur de l'ADN est mesurée par le suivi de la position de la bille. Différences de longueur entre l'ADN simple et double brin sont utilisées pour obtenir des informations en temps réel sur l'activité des protéines de réplication sur la fourche. Mesure de la position de la bille permet une détermination précise des tarifs et processivities de l'ADN de déroulage et de polymérisation (figure 2).
Protocole
1. Modèle de réplication d'ADN
D'ADN pour la réaction est un ADN linéarisé λ modifié par recuit d'oligonucléotides pour former une fourche de réplication. De plus, la biotine est fixé à l'extrémité d'un brin de l'ADN λ, et un groupement digoxigénine est attaché à l'autre extrémité du même brin 1.
Matériaux: bactériophage λ l'ADN, les oligonucléotides: bras de fourche biotinylé (A: 5'-biotine-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3 '), bras de fourche λ-complémentaire (B: 5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTC....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Il est important de s'assurer que la force de traînée exercée sur les billes par flux laminaire ne pas influencer les activités enzymatiques des protéines de réplication. Par exemple, une force de 3 PN qui correspond à un débit de 0,012 ml / min n'affecte pas la réplication du brin d'ADN de premier plan. Cela ne va cependant affecter les activités enzymatiques qui ont lieu pendant la synthèse d'ADN coordonnés, et il doit donc être réduite à 1,5 pN. La force de traînée peut être facilement contrôlé en cha.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Remerciements
Le développement de l'ADN qui s'étend de dosage a été aidé par Paul Blainey, Bong Jong-Lee, et Samir Hamdan. Ce travail est soutenu par le National Institutes of Health accorde à Charles Richardson (GM54397), et Antoine van Oijen (GM077248).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| ADN de bactériophage λ | New England Biolabs | N3011L | |
| Oligonucléotides d'ADN | Integrated DNA Technologies | ||
| Ligase T4 de l'ADN | New England Biolabs | M0202L | |
| Kinase T4 des polynucléotides | New England Biolabs | M0201L | |
| Fab anti-digoxigénine α | Roche Group | 11214667001 | |
| Perles activées au tosyle | Invitrogen | 142-03 | |
| Séparateur magnétique | Invitrogen | Dynal MPC | |
| 3-aminopropyl-triéthoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | D'autres aminosilanes peuvent être utilisés ou mélangés avec des silanes non réactifs à l'amine pour obtenir des surfaces plus espacées |
| PEG propionyle succinimidyle | Nektar | Des PEG similaires peuvent être achetés chez Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | |
| Biotine-PEG-NHS | Nektar | Des PEG similaires peuvent être achetés chez Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | |
| Adhésif double face | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | Épaisseur de 100 μm |
| Lame de quartz | Technical Glass | 20 mm (L) × 50 mm (l) × 1 mm (H) | Dimensionner pour s'adapter aux lamelles. Percer des trous avec des forets à pointe en diamant (DiamondBurs.net) |
| Tuyau en polyéthylène | BD Biosciences | 427416 | 0,76 mm de diamètre intérieur, 1,22 mm de diamètre extérieur Un tuyau d'une autre taille peut être utilisé à la place. |
| Streptavidine | Sigma-Aldrich | S4762 | Préparer une solution à 1 mg/mL, des aliquotes de 25 μL dans du PBS pH 7,3 |
| Mélange de solution de désoxyribonucléotides triphosphates | New England Biolabs | N0447 | |
| Microscope optique inversé avec objectif 10X | Olympus Corporation | Olympus IX-51 | |
| Aimant permanent en terre rare | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | |
| Caméra CCD | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | |
| Pompe à seringue | Harvard Apparatus | 11 Plus | Fonctionner en mode remplissage pour faciliter les changements de solution |
| Éclaireur à fibre optique | Thorlabs Inc. | OSL1 |
Références
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merril....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
Explorer plus d’articles
