אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage. לינארית λ-DNA הוא שונה יש ביוטין על קצה חוט אחד, מחצית digoxigenin בצד השני של גדיל אחד. סוף biotinylated מחובר coverslip כוס פונקציונליות לבין סוף digoxigeninated כדי חרוז קטן. הרכבה של אלה-DNA חרוז חבלים על פני השטח של התא זרימה מאפשר זרימה למינרית להיות מיושם להפעיל כוח לגרור על החרוז. כתוצאה מכך, ה-DNA הוא נמתח קרוב ובמקביל פני השטח של coverslip לעבר הכוח אשר נקבעת על ידי קצב הזרימה (איור 1). אורכו של ה-DNA נמדד על ידי ניטור את המיקום של החרוז. הבדלי אורך בין דנ"א יחיד ו פעמיים תקועים מנוצלים לקבל מידע בזמן אמת על פעילות החלבונים שכפול במזלג. מדידת המיקום של החרוז מאפשר קביעה מדויקת של שיעורי processivities של ה-DNA ואת ההתרה פילמור (איור 2).
פרוטוקול
1. שכפול ה-DNA תבנית
DNA עבור התגובה הינה DNA λ לינארית שונה על ידי חישול של oligonucleotides להקים מזלג שכפול. בנוסף, ביוטין מצורף בסופו של גדיל אחד של הדנ"א λ, וכן מחצית digoxigenin מחוברת בקצה השני של הגדיל אותו 1.
חומרים: bacteriophage DNA λ, oligonucleotides: זרוע מזלג biotinylated (A: 5'-ביוטין-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3 "), λ-משלימים הזרוע מזלג (B: 5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAA....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חשוב להבטיח כי כוח הגרר המופעל על ידי זרימה למינרית חרוזים אינו משפיע על פעילות אנזימטית של חלבונים שכפול. למשל, כוח 3 PN המתאים קצב זרימה של 0.012 ml / min לא משפיע השכפול של גדיל DNA מובילים. היא עושה זאת להשפיע על הפעילות האנזימטית המתרחשים במהלך סינתזת DNA מתואמת, ולכן יש לצמצם 1.5 PN. הכוח לגרור ניתן לשלוט בקלות על ידי שינוי קצב הזרימה או ברוחב של ערוץ הזרימה 5.
ה-DNA מתיחה assay מעסיקה הבדלים באו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
הפיתוח של ה-DNA מתיחה assay נעזרה פול Blainey, בונג ג'ונג לי, סמיר חמדאן. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים לצ'ארלס ריצ'רדסון (GM54397) ואנטואן ואן Oijen (GM077248).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DNA של בקטריופאג λ | New England Biolabs | N3011L | |
| אוליגו-נוקלאוטידים של DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| α-digoxigenin Fab | Roche Group | 11214667001 | |
| חרוזי Tosyl Activated | Invitrogen | 142-03 | |
| מפריד מגנטי | Invitrogen | Dynal MPC | |
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | ניתן להשתמש באמינו-סילאנים אחרים או לערבב אותם עם סילאנים שאינם רגיבים לאמינים עבור משטחים דלילים יותר |
| Succinimidyl propionate PEG | Nektar | ניתן לרכוש PEGs דומים מ-Nanocs, CreativePEGWorks וכו' | |
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | ניתן לרכוש PEGs דומים מ-Nanocs, CreativePEGWorks וכו' | |
| סרט דו-צדדי | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | עובי 100 μm |
| שקופית קוורץ | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | גודל המתאים לכיסויי זכוכית. יש לקדוח חורים באמצעות מקדחים בעלי קצה יהלום (DiamondBurs.net) |
| צינור פוליאתילן | BD Biosciences | 427416 | קוטר פנימי 0.76 mm, קוטר חיצוני 1.22 OD ניתן להחליף בצינורות בגדלים אחרים. |
| סטרפטאבידין | Sigma-Aldrich | S4762 | הכן תמיסה בריכוז 1 mg/mL, במנות (aliquots) של 25 μL ב-PBS pH 7.3 |
| תערובת תמיסות דאוקסיריבו-נוקלאוטיד טריפוספט | New England Biolabs | N0447 | |
| מיקרוסקופ אופטי הפוך עם עדשה 10X | Olympus Corporation | Olympus IX-51 | |
| מגנט קבוע של נדירות-ארץ | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | |
| מצלמת CCD | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | |
| משאבת מזרקים | Harvard Apparatus | 11 Plus | הפעל במצב מילוי חוזר (refill mode) כדי להקל על החלפת תמיסות |
| מאיר סיבים | Thorlabs Inc. | OSL1 |
מקורות
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merril....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
