アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

Summary

我々は、バクテリオファージの複製システムのタンパク質によって媒介個々のDNA分子のリアルタイムレプリケーションを観察するための方法を説明します。

Abstract

我々は、バクテリオファージの複製システムのタンパク質によって媒介個々のDNA分子のリアルタイムレプリケーションを観察するための方法を説明します。線形化されたλDNAは、1つの鎖の端にビオチン、および同じ鎖のもう一方の端のジゴキシゲニンの部分を持つように変更されます。ビオチン化エンドは、官能ガラスのカバースリップと小さなビーズにdigoxigeninated末尾に添付されます。フローセルの表面上にこれらのDNA -ビーズテザーのアセンブリは、層流がビーズ上に抗力を発揮する適用することができます。その結果、DNAが近い引き伸ばされていると流量（図1）によって決定される力でカバースリップの表面に平行。 DNAの長さは、ビーズの位置を監視することにより測定されます。一本鎖および二本鎖DNAとの間の長さの違いは、フォークで複製タンパク質の活性のリアルタイム情報を取得するために利用されています。ビーズの位置を測定することで巻き戻しDNAと重合（図2）の速度とprocessivitiesの正確な測定が可能になります。

Protocol

1。 DNA複製のテンプレート

反応のためのDNAは、複製フォークを形成するオリゴヌクレオチドのアニーリングによって修正された直鎖状λのDNAです。さらに、ビオチンは、λのDNAの一方の鎖の端に取り付けられており、ジゴキシゲニンの部分は同じ鎖¹の他端に接続されています。

材料：バクテリオファージλのDNA、オリゴヌクレオチド：ビオチン化フォークアーム（：5' -ビオチン- AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC - 3'）、λ-相補的なフォークアーム（B：5' - GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA - 3'）、フォークのプライマー（C：5' - TGCCATATCTGAAATCCTCCCTGC - 3'）、λ-相補的なジゴキシゲニンの終わり（D：5' - AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA -ジゴキシゲニン- 3'）、T4 DNAリガーゼ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、ヒートブロック。

1. T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドBとDの5'末端をリン酸化する。
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Discussion

層流でビーズに加わる抗力は、複製タンパク質の酵素活性に影響を与えないことを保証することが重要です。例えば、0.012 ml / minの流量に対応する3 PNの力は、DNAリーディング鎖の複製には影響しません。しかしそれは協調DNA合成中に行われる酵素活性に影響を与えます、そして、従って、1.5 PNに縮小する必要があります。抗力は、簡単に流量や流路⁵の幅を変更することによって制御できます。

DNA伸長アッセイは、二重と一本鎖DNAとの間の長さの違いを採用しています。実験では、ssDNAのへのdsDNAの変換は、リーディング鎖の合成（図2）の結果として発生するここで説明する。 ssDNAは6 PN（図1）以下の低伸縮力でのみdsDNAをより短いことを覚えておく必要があります。

この方法の可能な改善は、その3'末端に2番目のビーズを取り付けることにより、レプリケーションテンプレートのラギング鎖を変更することです。このような交代は、DNAの両鎖で行わ酵素活性の直接観察を可能にするであろう。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
バクテリオファージ λDNA	ニューイングランドバイオラボ	N3011L
DNAオリゴヌクレオチド	統合DNAテクノロジー
T4 DNAリガーゼ	ニューイングランドバイオラボ	M0202L
T4ポリヌクレオチドキナーゼ	ニューイングランドバイオラボ	M0201L
&α;-ジゴキシゲニン Fab	ロシュグループ	11214667001
トシル活性化ビーズ	Invitrogen	142-03
マグネティックセパレーター	Invitrogen	Dynal MPC
3-アミノプロピル-トリエトキシシラン	Sigma-Aldrich	A3648	他のアミノシランは、スパースな表面のために非アミン反応性シランと混合することができます
プロピオン酸スクシンイミジル PEG	Nektar		同様のPEGは、Nanocs、CreativePEGWorksなどから購入できます。
ビオチン-PEG-NHS	ネクター		Nanocs、CreativePEGWorksなどから同様のPEGを購入できます。
両面テープ	株式会社グレース・バイオ・ラボ	SA-S-1L	100 μmの厚さ
クォーツスライド	テクニカルガラス	20 mm (W) x 50 mm (L) x 1mm (H)	カバーガラスに収まるサイズ。ダイヤモンドチップドリルビット付きドリル穴 (DiamondBurs.net)
ポリエチレンチューブ	BD Biosciences	427416	0.76 mm ID、1.22 OD 他のサイズのチューブで代用できます。
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762	1 mg/mL 溶液、25 μPBS pH 7.3
デオキシリボヌクレオチド三リン酸溶液混合物	ニューイングランド バイオラボ	N0447
10X 対物レンズ付き倒立光学顕微鏡	オリンパス株式会社	オリンパス IX-51
パーマメント希土類磁石	National Imports www.rare-earth-magnets.com
CCD カメラ	QImaging	Rolera-XR Fast 139
シリンジポンプ	ハーバード装置	11 プラス	溶液の変更を容易にするために詰め替えモードで操作
ファイバーイルミネーター	Thorlabs Inc.	OSL1