FM染料在理解突触动态方面提供了不可估量的帮助。通常在不同刺激条件下，通过荧光显微镜观察FM染料的信号。然而，将FM染料的光转化技术与电子显微镜相结合，可实现对突触小体中不同突触囊泡池以及其他超微结构组分的可视化观察。
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摘要
摘要
突触小泡与质膜的融合（胞吐作用）是神经递质释放和神经元间通信所必需的步骤。随后，这些小泡从质膜上被回收（内吞作用），并重新归入神经末梢内的小泡总池中，直至它们再次经历新的胞吐与内吞循环（小泡循环）。这些过程已通过多种技术手段进行研究，包括电子显微镜、电生理记录、安培法和电容测量法。尤其在过去二十年中，一系列荧光标记物相继出现，使得光学技术能够用于追踪小泡在循环过程中的动态变化。其中最常用的标记物之一是苯乙烯基染料（即FM染料）1；从结构上看，所有FM染料均包含一个亲水性头部和一个疏水性尾部，二者通过芳香环以及一个或多个双键相连（图1B）。一种经典的FM染料实验方法是在刺激神经（通过电刺激或高K+溶液）的同时，将样品（图1Ai）浸入含有染料的溶液中。该过程可诱导小泡循环，并使染料被新近内吞的小泡摄取（图1Ai-iii）。在小泡完成染料加载后，将其转移至无染料溶液中并进行第二次刺激，即可通过胞吐作用释放FM染料（图1Aiv-v），此过程可通过监测荧光强度的下降（脱色）来实时追踪。
尽管FM染料在囊泡循环研究领域发挥了重要作用，但使用常规荧光显微镜无法确定单个囊泡的精确定位或形态。因此，本文介绍如何通过光转化技术，将FM染料作为内吞标记物用于电子显微镜观察。光转化技术利用了荧光染料在强光照下产生活性氧物种的特性。将荧光标记的样品浸入含有二氨基联苯胺（DAB）的溶液中并进行光照。染料分子产生的活性物种会氧化DAB，形成稳定且不溶性的深色沉淀物，可在电子显微镜下清晰识别2,3。由于DAB仅在荧光分子附近被氧化（因为活性氧物种寿命极短），该技术可确保只有荧光标记的结构才会含有电子致密沉淀。因此，该技术可用于研究活跃循环细胞器的精确位置和形态。
方案
1）制备 黑腹果蝇 神经肌肉接头（NMJ）
- 配制标准果蝇生理盐水（130 mM NaCl，36 mM 蔗糖，5 mM KCl，2 mM CaCl2，2 mM MgCl2，5 mM Hepes，pH 7.3 4）。
- 在生理盐水（1.1）中进行标本解剖。将果蝇幼虫背侧朝上固定于硅胶培养皿中，沿背侧纵向切开，并移除内部器官。随后将标本拉伸并固定。可使用多个腹侧肌肉进行实验。
2) 刺激与 FM 染色
- 建议在弱光条件下进行以下所有步骤，以防止 FM 染料发生漂白。
- 对于神经的化学刺激，使用高钾缓冲液。配制含有 90 mM KCl 和 10 μM FM1-43 染料的果蝇生理盐水（见 1.1）。将溶液避光保存。
- 在室温下用预先配制好的缓冲液孵育样本 1 分钟。
- 用标准果蝇生理盐水（1.1）洗涤，以去除细胞外的 FM1-43 染料。随后迅速进行固定。
3）固定
- 将样品置于含2.5%戊二醛的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在室温下固定45分钟。为良好保存形态学特征，优先选用戊二醛而非多聚甲醛。
- 用PBS洗涤一次，然后将样品浸入100 mM NH4....
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讨论
应考虑以下几个关键步骤：
- 必须在彻底清洗并淬灭样品后，才能进行DAB孵育。否则未反应的戊二醛会与DAB发生反应，导致其沉淀（通常表现为扁平晶体，无电子密度）。若样品中出现大量此类沉淀，则通常无法用于透射电子显微镜观察。
- 光照时间应通过测试多个相同样品在不同光照时间下的效果进行优化。根据我们的经验，最佳转化效果（图2B）出现在约5分钟的时间窗口内（例如，从光照开始后35至40分钟之间）。光照不足（图2A）表现为无标记细胞器或部分标记的细胞器（例如，囊泡仅在其体积的一半中显示含有DAB）。相反，过长的光照会导致过度转化——DAB转化产物大量积累，使细胞器结构扭曲，并扩散至胞质溶胶中（图2C）。此类样品在透射电镜下呈现为黑色结构，几乎无法观察到形态细节。
我们已在多种样本制备中应用了该技术，包括秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、斑马鱼（Danio rerio）以及蛙类（Rana .......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| 环氧树脂 Epon | Plano GmbH | R1030 | |
| 二氨基苯肼盐酸盐 | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% 戊二醛 | AppliChem | A3166 | 电镜级 |
| 硅胶 Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus 显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20倍物镜，数值孔径 0.5 | Olympus Corporation | 干式物镜 | |
| 100 W 汞灯 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 带反光镜的灯箱 | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm 相机 | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | 图像采集 |
| 激发滤光片（HQ 470/40） | AHF | F49-671 | |
| 二向色镜（495 DCLP） | AHF | F33-100 | |
| 发射滤光片（HQ 500 LP） | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 × 1024 |
参考文献
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog mo....
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