Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Sommario

Procedura per la concimazione Ovociti di Xenopus Con il metodo del trasferimento di accoglienza.

Abstract

Studiare il contributo di molecole ereditato dalla madre di vertebrati sviluppo precoce è spesso ostacolata dal tempo e la spesa necessaria per generare animali materno-effetto mutante. Inoltre, molte delle tecniche di iperespressione o inibire la funzione dei geni negli organismi come Xenopus zebrafish e non riescono a bersaglio sufficientemente critico le vie di segnalazione della madre, come il segnale Wnt. In Xenopus, manipolando la funzione dei geni negli ovociti in coltura e la loro successiva concimazione può migliorare questi problemi in una certa misura. Ovociti vengono manualmente defolliculated dal tessuto del donatore ovaio, iniettati o trattati in cultura come desiderato, quindi stimolati con progesterone per indurre la maturazione. Successivamente, gli ovociti vengono introdotti nella cavità del corpo di una rana ospitare l'ovulazione femminile, dopo di che verrà traslocato attraverso ovidotto del padrone di casa ed acquisire le modifiche e cappotti gelatina necessaria per la fecondazione. Gli embrioni risultanti possono essere elevato alla scena desiderata e analizzati gli effetti di eventuali perturbazioni sperimentale. L'host di trasferimento metodo è stato molto efficace nello scoprire i meccanismi fondamentali dello sviluppo precoce e consente una vasta gamma di possibilità di sperimentazione non disponibile in qualsiasi altro organismo modello vertebrato.

Protocollo

1. La rimozione chirurgica del tessuto dell'ovaio

1. Preparare un lotto fresco di media cultura ovocita (OCM; Materiali), tra 400-800 ml a seconda delle dimensioni dell'esperimento. Regolare il pH a 7,6-7,8, fino a quando il rosso fenolo trasforma un colore rosso scuro (sei o giù di piccole gocce di NaOH 5N). Versare una piccola quantità di controllare il pH in un tubo a parte in quanto l'elettrodo pH può contaminare i media. OCM deve essere conservato a 18 ° C e utilizzata entro una settimana.
2. Seleziona 3-5 femmine e posto uno in ~ 2L soluzione tamponata anestetico (Materiali). Cerchiamo di evitare di usare le rane che so....

Discussione

Un trasferimento di successo si tradurrà in fertilizzazione e scissione normale> 50% degli ovociti (Figura 3). Generalmente tra 30-60% degli ovociti trasferiti sopravviverà passato le fasi neurula. Di solito il trasferimento 75-150 ovociti per ogni gruppo sperimentale, che sarà resa embrioni sufficiente per diversi tipi di analisi (in situ, RT-PCR), così come visualizzare il fenotipo. L'impianto di ovociti sostanzialmente più non sembra aumentare notevolmente la resa. Inoltre, almeno 30 ovociti per ogni gruppo dovreb.......

Materiali

Soluzioni e ricette:

OCM (terreno di coltura degli ovociti; modificato da Wylie et al, 1996).

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
70% di L-15 a medio Leibovitz (contenente l-glutammina)	(Invitrogen 11415-064)
0,4 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA; V frazione)	(Sigma A-9418-50g)
1x penicillina-streptomicina	(Sigma P-0781)
Aggiustare il pH a 7,6-7,8 con 5N NaOH
Fai fresca settimanale, conservare a 18 ° C.

10X MMR (Soluzione di Marc modifica di Ringer;. Zuck et al, 1998)

1M NaCl
20 mM KCl
20 mM CaCl 2
10 mM MgCl 2
150 mM HEPES
regolare a pH 7,6-7,8
Conservare a 4 ° C

Anestetico soluzione

1 g / L 3-Aminobenzoic di etile (MS222)	(Sigma A-5040)
0,7 g / l di sodio bicarbonato
Sciogliere in Amquel trattati con acqua
Fai fresca settimanale

Progesterone scorte

Progesterone 10 mM (Sigma P-0130) in 100% etanolo
Diluire a 1 mm di EtOH 100% per uno stock 500x / soluzione di lavoro
Conservare a -20 ° C

Coloranti vitali (modificato da Heasman et al., 1991)

Blu: 0,1% Nilo Azzurro A	(Aldrich 121479-5G),
Rosso: 0,25% Rosso neutro	(Sigma N-6634),
Marrone: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Verde (80 microlitri blu + 80 microlitri marrone),
Mauve (80 microlitri blu + 80 rosso microlitri).
Un colore sesto, arancione (80 + 80 microlitri rosso bruno microlitri), possono essere utilizzati, ma è spesso difficile da distinguere da marrone.

Gli stock di blu, rosso e Brown sono preparati in acqua deionizzata a 50 ml provette, incubate per 20 minuti con dondolo e filato in una centrifuga clinica. I surnatanti sono aliquotted in provette da microcentrifuga e conservati a -20 ° C.